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Isolement, culture et caractérisation de cellules souches de la pulpe dentaire à partir de dents de lait et permanentes humaines

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DOI :

10.3791/65767

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17 mai 2024

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1Department of Dentistry, Oral Health Institute, Hamad Medical Corporation, 2Pushpagiri Institute of Medical Sciences and Research Centre, 3Saveetha Dental College, Saveetha Institute of Medical and Technical Sciences, 4College of Applied Medical Sciences, King Saud University

Dans cet article

Résumé

Ce protocole met l’accent sur l’extraction, la culture et la préservation de cellules souches multipotentes de la pulpe dentaire par digestion enzymatique. De plus, il démontre leur potentiel à se différencier en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes, soulignant l’importance de la précision et de la cohérence dans le processus.

Résumé

Dans le domaine de la médecine régénérative et des applications thérapeutiques, la recherche sur les cellules souches gagne rapidement du terrain. Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC), qui sont présentes dans les dents de lait et les dents permanentes, sont devenues une source vitale de cellules souches en raison de leur accessibilité, de leur adaptabilité et de leurs capacités de différenciation innées. Les DPSC offrent un réservoir abondant et facilement disponible de cellules souches mésenchymateuses, faisant preuve d’une polyvalence et d’un potentiel impressionnants, en particulier à des fins de régénération. Malgré leurs promesses, le principal obstacle réside dans l’isolement et la caractérisation efficaces des DPSC, étant donné leur représentation sous forme de fraction infime dans les cellules de la pulpe dentaire. La préservation de cette ressource cellulaire inestimable est tout aussi cruciale. Les deux méthodes prédominantes d’isolement des DPSC sont la digestion enzymatique (DE) et l’excroissance à partir d’explants de tissus (OG), souvent appelée croissance spontanée. Ce protocole se concentre principalement sur l’approche de digestion enzymatique pour l’isolement du DPSC, détaillant de manière complexe les étapes englobant l’extraction, le traitement en laboratoire et la préservation des cellules. Au-delà de l’extraction et de la préservation, le protocole se penche sur les prouesses de différenciation des DPSC. Plus précisément, il décrit les procédures employées pour induire ces cellules souches à se différencier en adipocytes, ostéoblastes et chondrocytes, mettant en évidence leurs attributs multipotents. L’utilisation ultérieure de techniques de coloration colorimétrique facilite la visualisation précise et la confirmation de la différenciation réussie, validant ainsi le calibre et la fonctionnalité des DPSC isolés. Ce protocole complet fonctionne comme un plan couvrant l’ensemble du spectre de l’extraction, de la culture, de la préservation et de la caractérisation des cellules souches de la pulpe dentaire. Il souligne le potentiel substantiel recèlé par les DPSC, propulsant l’exploration des cellules souches et prometteur pour de futures percées régénératives et thérapeutiques.

Introduction

La recherche sur les cellules souches a prospéré dans les sciences biomédicales en raison de ses applications prometteuses en médecine régénérative et en ingénierie tissulaire. Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC), dérivées du tissu pulpaire des dents de lait et des dents permanentes humaines, ont suscité un intérêt considérable en tant que source de cellules souches en raison de leur disponibilité immédiate et de leur capacité multipotente 1,2. Ces cellules ont le potentiel de se différencier en différents types de cellules, notamment les adipocytes, les ostéoblastes et les chondrocytes, comme le confirment de nombreuses études3.

Au cours des dernières décennies, la recherche et les applications thérapeutiques des cellules souches ont explosé. Le potentiel expansif des cellules souches exige de diversifier les sources à partir desquelles elles sont obtenues. Plusieurs facteurs influencent l’efficacité, la viabilité et la souche des cellules choisies. Malgré l’existence de divers réservoirs de cellules souches connus, tels que la moelle osseuse et les tissus adipeux, les procédures invasives, la morbidité du site et les préoccupations éthiques liées à ces sources limitent souvent leur exploration 4,5. Parmi les différentes sources de cellules souches, les cellules souches dentaires ont attiré l’attention en raison de leur facilité d’accès, de leur grande plasticité et de leurs diverses applications potentielles. Les cellules souches de la pulpe dentaire humaine, en particulier, ont fait l’objet de recherches approfondies pour leurs perspectives thérapeutiques6. Les dents, souvent jetées comme déchets médicaux, contiennent une multitude de cellules souches mésenchymateuses7. La sauvegarde de ce précieux réservoir de cellules souches nécessite des efforts collectifs de la part des patients, des dentistes et des médecins pour s’assurer que ces ressources ne sont pas gaspillées, ce qui rend chaque cellule souche de la pulpe dentaire disponible pour les besoins futurs en matière de régénération.

Les cellules souches dérivées de la pulpe dentaire, telles que les cellules souches de la pulpe dentaire humaine adulte (DPSC) et les cellules souches de dents de lait humaines exfoliées (SHED), sont situées dans la niche périvasculaire de la pulpe dentaire. On pense que ces cellules proviennent de cellules de la crête neurale crânienne et présentent des marqueurs précoces pour les cellules souches mésenchymateuses (CSM) et les cellules souches neuroectodermiques. Les DPSC et les SHED ont démontré leur multipuissance et leur capacité à régénérer divers types de tissus8.

Les sources potentielles de cellules souches dentaires englobent les dents de lait et les dents permanentes saines. Les cellules souches ne représentent qu’environ 1 % de la population cellulaire totale de la pulpe, ce qui souligne l’importance de techniques efficaces d’isolement et d’expansion9. Par conséquent, l’extraction et l’expansion de ces cellules souches sont des étapes cruciales de l’isolement de la DPSC10. Les dents extraites ou exfoliées doivent être stockées dans un milieu de transport riche en nutriments, tel qu’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) ou une solution saline tamponnée au hanches (HBSS).

L’obtention de la pulpe dentaire peut être obtenue par diverses méthodes, en fonction du type de dent 7,11. Pour les dents de lait avec des racines résorbées, l’extraction peut être effectuée par l’apex de la racine. De même, les broches barbelées stériles peuvent être utilisées pour obtenir de la pulpe à partir de dents permanentes avec un apex ouvert immature. Dans le cas de dents permanentes avec des racines complètement développées, l’accès à la chambre pulpaire implique de séparer la couronne dentaire de la racine. Ceci est accompli en coupant la dent à l’aide d’un disque de diamant à la jonction du cémento-émail. Cette incision expose la chambre pulpaire, permettant de récupérer le tissu pulpaire 12,13,14.

Les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) peuvent être isolées par digestion enzymatique (DE) ou excroissance d’explants de tissus (OG), également connue sous le nom de croissance spontanée. La méthode DE utilise des enzymes, principalement la collagénase I et la dispase, pour décomposer le tissu en suspensions unicellulaires15,16. La méthode OG, plus simple et plus rapide, consiste à hacher les fragments de pulpe et à les placer directement dans une plaque de culture, permettant aux cellules de se développer à partir des explants de tissu17. Les chercheurs ont utilisé et comparé les deux techniques pour évaluer les taux de prolifération cellulaire, la préservation des propriétés des cellules souches isolées, la différenciation et l’expression des marqueurs de surface18. L’établissement et la normalisation de protocoles d’acquisition de DPSC à haute efficacité et à haute souche peuvent ouvrir la voie à des thérapies efficaces et sûres19. Ce protocole comprend l’extraction des DPSC par digestion enzymatique, le traitement en laboratoire, la préservation et la différenciation cellulaire avec coloration colorimétrique pour l’adipogenèse, l’ostéogenèse et la chondrogenèse.

Le protocole décrit dans cet article présente une procédure étape par étape, commençant par l’isolement initial de la pulpe dentaire de la dent, suivi de la culture et de l’entretien des DPSC en laboratoire, et se terminant par leur caractérisation à l’aide de marqueurs de cellules souches spécifiques (Figure 1). Les techniques permettant d’induire ces cellules souches dans différentes lignées cellulaires, mettant en évidence leur multipuissance, sont également décrites.

Protocole

Le protocole décrit dans le présent document est conforme aux directives du comité d’éthique de la recherche humaine de l’établissement (IRB, Centre de recherche Pushpagiri, Kerala). L’utilisation des dents extraites a été effectuée conformément aux normes éthiques afin de garantir l’intégrité, la dignité et les droits des participants. Les participants sélectionnés pour cette étude étaient des personnes en bonne santé de moins de 30 ans qui avaient besoin d’une extraction dentaire pour un traitement orthodontique. Les personnes souffrant de caries dentaires étendues ou de parodontite sévère ont été exclues de l’étude. Des dents de lait ont été prélevées sur des enfants qui nécessitaient l’extraction des dents conservées. Un consentement écrit éclairé a également été obtenu des sujets participant à cette étude.

1. Extraction et transport des dents

  1. Collecte de dents de lait et de dents permanentes
    1. Expliquez aux participants le but de la procédure et l’utilisation potentielle des dents extraites à des fins de recherche.
    2. Effectuez l’extraction des dents sous anesthésie locale en administrant un agent anesthésique à proximité de la dent à extraire. Plus précisément, 1,75 mL de lidocaïne mélangée à de l’épinéphrine (voir le tableau des matières) dans un rapport de 1:200 000 a été injecté dans le cadre de cette étude. Il est préférable de choisir des dents qui ne présentent pas de caries dentaires graves ou de parodontite20,21.
  2. Transport des dents extraites
    REMARQUE : Il est recommandé de travailler dans des conditions aseptiques pour éviter la contamination. Cela comprend le port d’un équipement de protection individuelle, comme des gants et une blouse de laboratoire, et le travail dans un environnement stérile, comme une cagoule à flux laminaire pour risque biologique.
    1. Une fois la dent extraite, rincez-la avec une solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le sang et les autres débris. À l’aide d’une pince stérile et d’un scalpel, retirez avec précaution tous les restes de tissus mous attachés à la surface de la dent (figure 2A).
    2. Immergez la dent dans une solution désinfectante, telle que de l’éthanol à 70 %, pendant 10 s. Après la désinfection, rincez la dent avec du PBS stérile pour éliminer tout désinfectant résiduel.
    3. Placez la dent dans un récipient stérile contenant le milieu de transport.
      REMARQUE : Le milieu de transport était constitué d’Alpha-MEM, un milieu de culture commercial complété par des antibiotiques : 100 U/mL de pénicilline/streptomycine (voir le tableau des matières). Ce milieu fournissait des nutriments essentiels aux cellules de la dent extraite, assurant leur survie jusqu’au traitement en laboratoire. Les antibiotiques servaient à inhiber la croissance bactérienne.
    4. Maintenir une température de 4 °C pendant le transport pour ralentir les activités métaboliques cellulaires et retarder la mort cellulaire. Transportez la dent au laboratoire pour les étapes suivantes, y compris le traitement et l’isolement des cellules souches de la pulpe dentaire.

2. Prélèvement de tissu pulpaire

  1. Fixez la dent à l’aide d’une pince dentaire pour vous assurer qu’elle reste en place pendant la procédure. À l’aide d’un disque diamanté, coupez la dent d’une pièce à main dentaire (voir le tableau des matériaux) reliée à un liquide de refroidissement à eau (Figure 2B).
    REMARQUE : L’objectif est d’exposer la chambre pulpaire sans causer de dommages inutiles au tissu pulpaire à l’intérieur.
  2. Utilisez une excavatrice dentaire (voir le tableau des matériaux) pour retirer le tissu pulpaire. Cet instrument permet d’extraire la pulpe sans infliger de dommages, préservant ainsi la viabilité des cellules souches de la pulpe dentaire (Figure 2C).
  3. Placez le tissu obtenu sur une boîte de Pétri en verre. Lavez le tissu pulpaire avec une solution saline tamponnée au phosphate.

3. Digestion du tissu pulpaire et isolement cellulaire

  1. Hachage et digestion des tissus
    1. À l’aide d’une lame chirurgicale stérile, hachez soigneusement le tissu pulpaire en petits fragments (Figure 2D) et placez-le dans un mini broyeur de tissus avec du PBS pour obtenir un mélange finement homogénéisé. Ce processus augmente la surface des tissus, facilitant une action enzymatique plus efficace pendant la digestion.
    2. Transférez les fragments de tissu homogène haché dans un tube de 15 mL et digérez par voie enzymatique à l’aide d’un mélange de 3 mg/mL de collagénase de type I et de 4 mg/mL de dispase (voir le tableau des matières). Ces enzymes ont été dissoutes dans la solution saline équilibrée de Hank (HBSS) pour atteindre les concentrations souhaitées.
    3. Incuber le tissu pulpaire dans le mélange enzymatique (étape 3.1.2) pendant environ 2 h à 37 °C. Après l’incubation, neutralisez les enzymes et collectez les cellules par centrifugation (étape 3.2.1) pour une culture ultérieure.
  2. Centrifugation et remise en suspension
    1. Après l’incubation, transférez le tissu digéré dans un tube à centrifuger de 15 ml et faites-le tourner à 300 x g pendant 5 minutes à température ambiante pour granuler les cellules. Cette étape sépare les cellules des fragments de tissus non digérés et des enzymes restants. Jetez soigneusement le milieu surnageant, en veillant à ne pas perturber la pastille cellulaire au fond du tube.
    2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de culture frais. Ce milieu fournit les nutriments et l’environnement nécessaires à la survie et à la prolifération des cellules isolées.

4. Culture cellulaire

  1. Placage et incubation des cellules
    1. Transférez délicatement les cellules remises en suspension dans une fiole de culture de 25 cm².
      REMARQUE : Tout le matériel d’une seule pulpe est transféré dans un seul ballon de culture cellulaire de25 cm 2 . Un volume de média de 5 à 7 ml assure une couverture suffisante et une disponibilité des nutriments pour les cellules. S’assurer que le milieu de culture des DPSC est le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 à 20 % de sérum fœtal bovin (FBS) (voir le tableau des matériaux) pour fournir les facteurs de croissance nécessaires. De plus, complétez le milieu avec 1% de pénicilline/streptomycine pour éviter la contamination bactérienne. Assurez-vous que les cellules sont uniformément réparties dans le flacon pour favoriser une croissance homogène.
    2. Incuber le ballon à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2.
  2. Changement de milieu et surveillance de la confluence
    1. Changez le milieu de culture tous les 2-3 jours pour apporter des nutriments frais et éliminer les déchets métaboliques. Pour ce faire, aspirez soigneusement l’ancien milieu à l’aide d’une pipette sérologique stérile et remplacez-le par un milieu frais.
    2. Surveillez régulièrement la culture cellulaire au microscope pour suivre la croissance des cellules et vérifier tout signe de contamination.
    3. Continuez ce processus jusqu’à ce que les cellules atteignent 80 % à 90 % de confluence, point auquel les cellules couvrent la majeure partie de la surface du ballon mais ne sont pas trop encombrées.
  3. Trypsinisation cellulaire et passage ou congélation
    1. Une fois que les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, retirez le milieu de culture et lavez les cellules avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) pour éliminer le milieu résiduel et les cellules non adhérentes.
    2. Ajouter une solution de trypsine-EDTA à 0,25 % dans le ballon pour détacher les cellules de la surface du ballon. Incuber pendant 2 à 5 minutes à 37 °C jusqu’à ce que les cellules se décollent.
    3. Neutralisez la trypsine en ajoutant un volume égal de milieu de culture, puis pipetez doucement la suspension cellulaire de haut en bas pour assurer un détachement complet des cellules.
    4. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules.
    5. Remettez les cellules en suspension dans un milieu de culture frais et replaquez-les (passage) pour une croissance ultérieure ou congelez-les pour une utilisation future. Lors de la congélation, utilisez un milieu de congélation qui contient un cryoprotecteur, comme le DMSO, pour protéger les cellules des dommages pendant la congélation.

5. Caractérisation des DPSC

  1. Analyse par cytométrie en flux
    1. Pour confirmer la nature des cellules souches mésenchymateuses des cellules isolées, effectuez une analyse par cytométrie en flux22,23. Dans un premier temps, essayez de réduire et de prélever des cellules comme décrit à l’étape 4.3.
    2. Déterminer la viabilité cellulaire par la technique d’exclusion du colorant trypan. Effectuez l’analyse à l’aide d’un analyseur de viabilité cellulaire (voir Tableau des matériaux) lors des 2ème et 8èmepassages . Réaliser une analyse phénotypique via un cytomètre de flux lors des 3èmeet 7èmepassages .
    3. Après l’incubation, lavez les cellules dans un tampon de cytométrie en flux pour éliminer l’excès d’anticorps et analysez les cellules à l’aide d’un cytomètre en flux.
      REMARQUE : Le tampon de cytométrie en flux est composé d’une solution saline tamponnée au phosphate (1x PBS), de 1 % à 2 % de sérum de veau fœtal (FBS) et de 0,1 % d’azoture de sodium (NaN3). Le FBS ou BSA bloque la liaison non spécifique des anticorps, tandis que l’azoture de sodium agit comme un conservateur. Un pourcentage élevé de cellules doit exprimer les marqueurs des cellules souches mésenchymateuses et manquer des marqueurs hématopoïétiques, confirmant leur identité en tant que DPSC24.
    4. Détachez les DPSC et colorez-les avec des anticorps d’immunofluorescence pour l’analyse par cytométrie en flux.
      REMARQUE : La sélection des marqueurs pour l’analyse par cytométrie en flux des cellules souches mésenchymateuses (CSM) est basée sur le consensus établi par la Société internationale de thérapie cellulaire (ISCT), qui stipule que les CSM doivent exprimer CD105, CD73 et CD90, et ne pas exprimer CD45, CD34, CD14 ou CD11b, CD79a ou CD19, et HLA classe II25. Ces marqueurs sont couramment utilisés dans les études portant sur les cellules souches de la pulpe dentaire26. Les concentrations d’anticorps pour la coloration peuvent varier en fonction de l’anticorps spécifique utilisé, et il est recommandé de suivre les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux) pour les dilutions d’anticorps et les conditions d’incubation25.
    5. Etablir les critères de classification27,28 pour l’expression des marqueurs CD tels que mentionnés : moins de 10%, aucune expression ; entre 11 % et 40 %, faible expression ; une plage de 41 % à 70 %, expression modérée ; au-dessus de 71%, expression élevée.
    6. De plus, confirmer l’absence de marqueurs hématopoïétiques en incubant une aliquote cellulaire distincte avec des anticorps contre CD34 et CD45.

6. Différenciation multilignée

REMARQUE : Les étapes suivantes décrivent les protocoles de différenciation ostéogénique, adipogénique et chondrogénique des cellules souches dentaires. Commencez par ensemencer des cultures à une densité de 1 x 105 cellules par puits dans une plaque de culture tissulaire enrobée de fibronectine avec un milieu complet (CM). Surveillez la croissance cellulaire jusqu’à ce que 80 % à 90 % de confluence soit atteinte avant de lancer le protocole de différenciation souhaité. Pour évaluer le potentiel de différenciation multilignée des DPSC, amorcez le processus de différenciation vers les ostéoblastes, les adipocytes et les chondrocytes en ensemencant les cellules dans des plaques à 24 puits et en les cultivant dans des milieux de différenciation appropriés.

  1. Différenciation ostéogénique
    1. Commencer par cultiver les DPSC dans un milieu de croissance régulier dans des conditions standard jusqu’à ce qu’ils atteignent 70 % à 80 % de confluence.
    2. Retirez le milieu de croissance des cellules, puis lavez les cellules une fois avec 1x PBS. Ajoutez le milieu de différenciation ostéogénique (ODM) aux cellules.
      REMARQUE : L’ODM se compose d’un milieu essentiel minimum alpha (α-MEM) complété par 10 % de FBS, 100 unités/ml de pénicilline, 100 μg/mL de streptomycine, 0,25 μg/mL d’amphotéricine B, 50 μg/mL d’acide ascorbique, 10 mM de bêta-glycérophosphate et 100 nM de dexaméthasone (voir le tableau des matériaux).
    3. Incuber les cellules dans le milieu ostéogénique à 37 °C avec 5% de CO2. Changez le milieu ostéogénique tous les 2-3 jours.
      REMARQUE : Après 14 à 21 jours, les DPSC devraient s’être différenciés en cellules de type ostéoblaste. Cela peut être confirmé en vérifiant une augmentation de l’expression de marqueurs spécifiques aux ostéoblastes, tels que la phosphatase alcaline, ou en utilisant des techniques de coloration pour détecter la matrice minéralisée, telles que la coloration au rouge d’alizarine S.
    4. Fixez les cellules en les incubant avec de l’éthanol glacé à 70 % pendant 1 h à -20 °C.
    5. Colorer les cellules fixées avec une solution de coloration au rouge d’alizarine S (pH 4,2) à température ambiante dans l’obscurité pendant 10 à 15 min. Visualiser la coloration au microscope pour confirmer la différenciation ostéogénique (Figure 3). Confirmer la différenciation en colorant les cellules avec du rouge d’alizarine S, ce qui identifie les dépôts de calcium indiquant une minéralisation29,30.
  2. Différenciation adipogénique
    1. Comme détaillé dans la section précédente, cultiver des DPSC dans des conditions standard dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 à 37 °C. Passez les cellules lorsqu’elles atteignent environ 70 % à 80 % de confluence.
    2. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec 1x PBS. Remplacer le milieu délavé par un milieu de différenciation adipogénique. Ce milieu se compose généralement de DMEM, de 10 % de FBS, de 10 μg/mL d’insuline, de 1 μM de dexaméthasone, de 200 μM d’indométacine et de 0,5 mM d’IBMX (voir le tableau des matériaux).
    3. Changez le milieu de différenciation tous les 3-4 jours. Après environ 3 semaines, lavez les DPSC adipogènes différenciés avec du PBS et fixez-les avec du paraformaldéhyde à 4% (PFA) pendant 20 min à température ambiante.
    4. Teindre les cellules fixées avec du O rouge huile (voir le tableau des matériaux) pour visualiser l’accumulation de gouttelettes lipidiques (Figure 4). Pour confirmer davantage la différenciation adipogénique, effectuez une analyse de l’expression génique des marqueurs adipogéniques tels que le récepteur gamma activé par les proliférateurs de peroxysomes (PPARγ) et l’adiponectine31,32.
  3. Différenciation chondrogénique
    1. Des cultures de DPSC maintenues dans une atmosphère humidifiée avec 5% de CO2 à 37 °C sont utilisées pour la différenciation chondrogénique. Passez les cellules lorsqu’elles atteignent environ 70 % à 80 % de confluence.
    2. Aspirez le milieu et lavez les cellules une fois avec 1x PBS. Remplacez le milieu lessivé par un milieu de différenciation chondrogénique, qui contient généralement du milieu modifié de Dulbecco à haute teneur en glucose, 1 % d’ITS, 100 nM de dexaméthasone, 50 μg/mL d’ascorbate-2-phosphate, 40 μg/mL de proline et 10 ng/mL de facteur de croissance transformant-bêta 3 (TGF-β3) (voir le tableau des matériaux).
    3. Maintenez les cellules dans le milieu de différenciation chondrogénique, en changeant le milieu tous les 2-3 jours. Après environ trois semaines, les DPSC devraient s’être différenciés en cellules de type chondrocytes.
    4. Fixez les cellules en les incubant avec du paraformaldéhyde (PFA) à 4 % pendant 20 min à température ambiante. Après fixation, colorer les cellules avec du bleu d’Alcian (voir Tableau des matériaux) et les visualiser au microscope pour confirmer la différenciation chondrogénique (Figure 5).
    5. Confirmez la différenciation des DPSC en chondrocytes à l’aide de techniques telles que la coloration au bleu d’Alcian pour les protéoglycanes ou l’analyse de l’expression génique de marqueurs chondrogéniques tels que l’agrégatécane, le SOX9 et le collagène de type II33,34.

Résultats

L’exécution réussie du protocole décrit a permis d’obtenir des cellules souches de pulpe dentaire (DPSC) capables de différenciation multilignée, démontrant ainsi leur multipotence.

Tests de viabilité
La viabilité des DPSC a été évaluée à l’aide d’un test d’exclusion au bleu de trypan à divers moments. Les résultats montrent une viabilité élevée et constante (supérieure à 95 %) tout au long de la période de culture, ce qui démontre la robustesse de notre protocole d’isolement et de culture.

Essais d’unités formant colonies (UFC)
Des analyses UFC ont été effectuées pour évaluer la capacité d’auto-renouvellement des DPSC. Une suspension unicellulaire a été plaquée à une faible densité et cultivée pendant 14 jours. Les colonies formées ont ensuite été colorées et comptées. Les résultats montrent de nombreuses colonies, indiquant une forte proportion de cellules auto-renouvelées au sein de la population DPSC.

Temps de doublement des cellules
Le temps de doublement des cellules a été calculé sur la base de la courbe de croissance des DPSC. Les cellules ont été ensemencées à une densité spécifique et comptées régulièrement pour construire une courbe de croissance. Le temps de doublement a ensuite été calculé à l’aide de la phase de croissance exponentielle de la courbe. Les résultats montrent un temps de doublement cohérent avec celui rapporté pour les CSM, suggérant une population cellulaire saine et proliférative (Figure 6).

Analyse par cytométrie en flux
L’analyse par cytométrie en flux a montré qu’une grande majorité des CSDP (p. ex., >95 %) étaient positifs pour les CSM 90, CD73 et CD105, confirmant ainsi leur identité en tant que CSM (figure 7). De plus, moins de 2 % des cellules étaient positives pour CD45, CD34 et HLA-DR, confirmant l’absence de contamination significative des cellules hématopoïétiques ou endothéliales.

Différenciation ostéogénique
À la fin de la différenciation ostéogénique, les cellules présentaient une matrice minéralisée, qui est visualisée par la coloration au rouge d’alizarine S (Figure 3). La présence d’une coloration rouge dans les cellules colorées indique le dépôt réussi d’une matrice minéralisée, caractéristique essentielle de la différenciation ostéogénique. L’incapacité à réaliser avec succès la coloration de différenciation pourrait potentiellement être liée aux défis rencontrés lors de la procédure de collecte d’échantillons.

Différenciation adipogénique
Au cours de la différenciation adipogénique, les DPSC ont accumulé des gouttelettes lipidiques, indicatrices de l’adipogenèse. Les gouttelettes lipidiques peuvent être observées avec une coloration au rouge d’huile O (Figure 4). Une différenciation réussie a entraîné la présence de gouttelettes lipidiques colorées en rouge orangé dans les cellules.

Différenciation chondrogénique
Enfin, après différenciation chondrogénique, les DPSC ont produit des glycosaminoglycanes, un composant essentiel du cartilage confirmé par la coloration au bleu d’Alcian, qui se lie à ces glycosaminoglycanes. Les cellules ayant subi avec succès une chondrogenèse ont présenté une coloration bleue lors de la coloration (Figure 5).

Les cellules qui n’ont pas présenté de changements de couleur respectifs dans les procédures de coloration pourraient être dues à une différenciation sous-optimale, peut-être en raison de problèmes avec les milieux de différenciation ou la qualité initiale des DPSC. Il est important de s’assurer de la qualité des milieux et des suppléments, ainsi que de la santé et du nombre de passages des DPSC utilisés. La différenciation réussie des DPSC en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes valide la nature multipotente de ces cellules et souligne leur potentiel dans la médecine régénérative et les applications thérapeutiques.

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Figure 1 : Vue d’ensemble de l’isolement, de la caractérisation et de la différenciation des cellules souches de la pulpe dentaire. Cette figure fournit une représentation schématique du flux de travail pour isoler, caractériser et différencier les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC). Le processus commence par l’extraction de la dent (ou des dents), suivie de l’isolement du tissu pulpaire, à partir duquel les DPSC sont dérivés. Après l’isolement, les DPSC subissent divers tests de caractérisation pour confirmer leur identité de cellules souches et évaluer leur viabilité, leur taux de prolifération et d’autres attributs clés. La dernière étape représentée dans ce schéma implique l’induction de la différenciation, où les DPSC sont traitées avec des facteurs spécifiques pour guider leur transformation en types de cellules spécialisés, tels que les ostéoblastes, les adipocytes ou les chondrocytes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Extraction pulpaire à partir de dents extraites. (A) Une dent extraite préparée pour l’extraction de tissu pulpaire. (B) Coupe de la dent extraite à l’aide d’une fraise diamantée. (C) Retrait du tissu pulpaire de la chambre pulpaire. (D) Fragmentation du tissu pulpaire à l’aide d’une lame chirurgicale. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Différenciation ostéogénique des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) mise en évidence par coloration au rouge d’alizarine S (40x). La coloration rouge vif révèle le dépôt de la matrice minéralisée, une caractéristique des ostéoblastes, confirmant la différenciation ostéogénique réussie. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 4 : Différenciation adipogénique des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) démontrée par coloration au rouge d’huile O. La présence de gouttelettes rouge vif représente l’accumulation de lipides, une caractéristique des adipocytes, confirmant la différenciation adipogénique réussie. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 5 : Différenciation chondrogénique des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) démontrée par coloration au bleu d’Alcian (40x). La couleur bleue intense indique la présence d’une matrice extracellulaire riche en protéoglycanes, une caractéristique des chondrocytes, confirmant la différenciation chondrogénique réussie. Barre d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

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Figure 6 : Temps de doublement des cellules pour les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC). Cette figure illustre la courbe de croissance des DPSC au fil du temps. Les cellules ont d’abord été ensemencées à une densité spécifique, et le comptage des cellules a été effectué à intervalles réguliers (représenté sur l’axe des x) pour surveiller le taux de prolifération. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Expression du marqueur de surface des cellules souches dans la culture DPSC. Cette figure illustre l’expression de marqueurs de surface spécifiques sur les DPSC. Les marqueurs de cellules souches mésenchymateuses CD44, CD90 et CD105 présentent des niveaux d’expression élevés, indiquant la présence de traits mésenchymateux dans ces cellules. À l’inverse, l’expression des marqueurs hématopoïétiques (CD34 et CD45) et de la molécule du complexe majeur d’histocompatibilité de classe II (HLA-DR) est quasi négligeable, confirmant l’absence de cellules de la lignée hématopoïétique dans la culture. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Le protocole décrit l’isolement, la culture et la caractérisation des cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) à partir de dents humaines à feuilles caduques et permanentes. Il comprend une description du stockage et de la prolifération de ces cellules, ainsi que l’évaluation de leur potentiel de différenciation in vitro en ostéoblastes, adipocytes et chondrocytes35.

Chen et al.36 ont démontré que les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) pouvaient être obtenues à partir de diverses sources, y compris des dents humaines vitales infectées affligées par des affections telles que la parodontite, la résorption radiculaire, la péricoronarite et les fractures dentaires, ainsi que les dents surnuméraires et mal alignées. Cette constatation a été corroborée par des études ultérieures identifiant les dents vitales infectées comme sources potentielles de DPSC 37,38,39,40. Cependant, Bernardi et al.10 ont souligné qu’une résorption racinaire accrue pourrait nuire à la viabilité de ces cellules souches. Un obstacle important dans le processus est la préservation des cellules et la prévention de leur dégradation, qui commence immédiatement après l’extraction ou l’exfoliation des dents. De plus, il est important de noter que les dents affectées par des affections graves telles que des abcès périapicals, des tumeurs ou des kystes ne doivent pas être utilisées pour extraire des cellules souches40,41.

Les DPSC peuvent être obtenues par la technique de digestion enzymatique (ED) ou la méthode de l’excroissance des explants de tissus (OG), également connue sous le nom de technique de croissance spontanée14,15. Les chercheurs utilisent ces stratégies pour étudier l’efficacité de la prolifération cellulaire ou le maintien des attributs morphologiques et phénotypiques des cellules souches isolées17. Des études ont montré que les cellules souches isolées par la méthode OG présentent un taux de prolifération plus lent et une expression plus faible des marqueurs de cellules souches18. À l’inverse, les DPSC isolées par la méthode ED ont démontré une prolifération, une différenciation et une expression accrue plus rapides de marqueurs de surface supplémentaires que celles isolées par la méthode OG. Il est intéressant de noter que les cellules souches immatures de la pulpe dentaire (IDPSC) extraites de dents de lait à l’aide de la technique OG ont montré que la culture cellulaire encourageait la prolifération sélective des IDPSC, empêchant ainsi une différenciation précoce42.

La purification des DPSC est cruciale pour obtenir des cellules hautement régénératives et nécessite des marqueurs cellulaires spécifiques. La sélection des cellules est effectuée à l’aide de méthodes de tri cellulaire par fluorescence ou activées magnétiquement. Outre les marqueurs susmentionnés, de nombreux autres antigènes de surface sont également utilisés en raison de la nature hétérogène des DSCs43. Cependant, aucun marqueur unique n’a été identifié pour séparer les sous-populations.

Par rapport aux cellules souches mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse, les DPSC ont été reconnues comme une source prometteuse de cellules multipotentes en raison de leur potentiel de multilignage44. Cette souche est probablement le résultat de l’immaturité relative des tissus sources, car les dents de sagesse, souvent à l’origine de l’extraction des DPSC, sont les dernières dents permanentes à se développer et sont donc moins matures que la moelle osseuse45. Ce protocole explore avec succès la nature multipotente des cellules souches de la pulpe dentaire en induisant ces cellules à subir une adipogenèse, une ostéogenèse et une chondrogenèse. Notamment, les DPSC sont le seul type de cellule qui régule à la hausse l’expression des DSPP lorsqu’ils sont cultivés dans des conditions ostéogéniques, ce qui indique leur différenciation future en odontoblastes46.

Les cellules souches dentaires, isolées à partir de sources diverses, présentent de nombreux potentiels de prolifération et de différenciation47. Les progrès significatifs réalisés dans les systèmes in vitro ont eu un impact profond sur la biologie et les thérapies des cellules souches. Malgré ces progrès, il reste des défis à relever lors de l’application des thérapies par cellules souches du laboratoire au chevet du patient. Une attention particulière doit être portée à la survie et à la stabilité des cellules souches afin de s’assurer que les techniques de conservation ne compromettent pas la viabilité de ces cellules. Bien que la recherche sur les cellules souches dentaires ait donné des résultats prometteurs dans des modèles animaux, il est urgent d’étendre ces résultats aux essais sur l’homme. En continuant à stimuler une recherche et un développement rigoureux, les cellules souches dentaires sont prêtes à jouer un rôle important dans l’avancement du domaine des banques de cellules souches.

Bien qu’elle soit largement utilisée, l’approche de digestion enzymatique pour isoler les cellules souches de la pulpe dentaire (DPSC) présente plusieurs limites. Tout d’abord, le processus peut compromettre la viabilité cellulaire, car des enzymes comme la collagénase et la dispase peuvent endommager par inadvertance les membranes cellulaires, produisant moins de cellules souches vivantes17. De plus, cette méthode entraîne souvent la dégradation de la matrice extracellulaire vitale (MEC), ce qui est crucial pour préserver les propriétés inhérentes aux cellules souches48. La procédure peut également modifier les marqueurs de surface cellulaire, ce qui entrave l’identification et la caractérisation précises des DPSC43. Au-delà de ces contraintes biologiques, l’approche est chronophage, augmentant les risques de contamination microbienne due à des incubations prolongées à 37 °C. De plus, l’incohérence entre les lots d’enzymes peut conduire à des résultats variables, ce qui remet en question la reproductibilité de la procédure d’isolement. Le fardeau financier ne peut être négligé, car les enzymes de haute qualité adaptées à la digestion des tissus sont chères49. De plus, les conséquences de la digestion peuvent entraîner une activité enzymatique résiduelle qui pourrait affecter négativement les cultures cellulaires, influençant leur santé, leur prolifération et leur différenciation. Enfin, la possibilité que la digestion enzymatique isole préférentiellement certaines sous-populations de DPSC par rapport à d’autres pourrait fausser par inadvertance le pool cellulaire résultant, influençant ainsi leur potentiel thérapeutique50.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient le Dr Mathew Mazhavancheril, directeur et chef du Centre de recherche Pushpagiri à Thiruvalla, pour son soutien dans la documentation des procédures au Centre de recherche.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
3-isobuty-l-méthyl-xanthine  ;Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI5879
Acide acétique  ;Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAAS001
Bleu Alcian  ;Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USARM471
Solution de coloration du rouge d’alizarine SSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAGRM894
Phosphatase alcaline -Kit de colorationThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Alpha Minimum Essential Medium (&alpha ;-MEM)  ;Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,États-UnisGibco
Alpha Minimum Essential Medium (&alpha ;-MEM)  ;Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, ou Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Alpha-MEM, ou Alpha Minimum Essential MediumThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAGibco
Antibiotique/AntimycosiqueSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAP4333
Ascorbate-2-phosphateSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA012-04802
Bêta-glycérophosphate  ;Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAG9422-10G
Armoire de biosécurité-Hotte à flux laminaireLabconco Corporation, MO 64132-2696, États-Unis
CD90, CD105, CD73, CD34, CD45 et HLA-DRBioLegend, Inc.CA 92121, États-Unis
Passoire cellulaire (70 µ ; m)Laboratoires HiMedia  ; Ltd.Mumbai, IndeTCP025Centrifugeuse à crépine
cellulaire REMI Elektrotechnik Limited (REMI)
CentrifugeuseHiMedia Laboratories  ; Ltd.Mumbai,Inde1101 | 1102
CO2Incubateur Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Collagénase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, États-Unis
Collagenase type IWorthington Biochem. Corp. NJ 08701, États-Unis
Milieu de croissance completHiMedia Laboratories  ; Ltd.Mumbai, IndeAT006DMEM
Tubes coniques (15 ou 50 )Thermo Fisher Scientific, MA, USA546021P/546041P15 mL et 50 mL
Conteneur de congélationcryogénique Thermo Fisher Scientific ,MA 02451, USA15-350-50
Cryolabels Label Inde :
Boîtes de stockage cryoviales  ;Cryostore Boîtes
Cryoflacons ThermoFisher Scientific ,MA 02451,USA
Cryoflacons (1,8 mL)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAPW1282de culture autoportant
(25 cm² ;)Corning Inc.NY 14831,USA
Flacons de cultureHiMedia Laboratories  ; Ltd.Mumbai, IndeTCG4 / TCG6T25 / T75
Plaques de cultureHiMedia Laboratories  ; Ltd.Mumbai, IndeTCP129/TCP00860 mm/100 mm
Disques dentaires diamantésKomet SC 29730, États-UnisKomet  ;
Excavatrice Dental SpoonBrasseler,GA 31419,USA5023591U0
DexaméthasoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
DexamethosoneSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAD4902-25MG
Dimethyl Sulfoxide (DMSO)Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATC185
DispaseRoche Diagnostics,Mannheim,Allemagne.
DispaseRoche Diagnostics GmbH, Mannheim, Allemagne
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific, MA, USA
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Ethanol (70 %)HiMedia Laboratories  ; Ltd.Mumbai, IndeMB106
Éthanol -70 %Thermo Fisher Scientific ,MA 02451, USAFisher
Scientific Pince d’extraction  ;Dentsply Sirona, États-Unis
Sérum fœtal bovin (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Sérum fœtal bovin (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Sérum fœtal bovin (FBS)HiMedia Laboratories  ; Ltd.Mumbai, IndeRM9954
Sérum de veau fœtal (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Sérum de veau fœtal (FBS)Thermo Fisher Scientific Inc.,MA,USAF2442-500ML
Plaque de culture tissulaire enrobée de fibronectineCorning Inc.Corning, NY 14831,USA
Cytomètre en fluxBD Biosciences,CA 95131,USA
Tampon de cytométrie en fluxBD Biosciences,CA 95131,USA
Couvercle en verre 22 x 22 mmHiMedia Laboratories  ; Ltd.Mumbai, IndeTCP017
Hank’s Balanced Salt Solution (HBSS)Lonza Group Ltd,4002 Bâle, Suisse
Pièce à main dentaire à grande vitesse  ;NSK Ltd, Tokyo 8216, JaponTi-Max Z series
Sérumde cheval Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
IBMX, or 3-isobutyl-1-methylxanthineSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
IndométhacinePfizer Inc. NY 10017,USA
Insuline-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Insuline-Transferrin-Selenium (ITS)Thermo Fisher Scientific ,MA 02451,USAI5523
Prémélange Insuline-Transferrine-Sélénium (ITS) CorningIncorporated,MA 01876,USA
Microscope inverséOlympus Corp.,Tokyo 163-0914,Japon
Isopropanol (60 %) )Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAI9516
Alcool isopropylique  ;Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USAMB063
Hotte à flux laminaireThermo Fisher Scientific ,MA 02451,USA
Lidocaïne mélangée à de l’épinéphrineDENTSPLY,NC 28277,USACitanest
Azote liquideAir Liquide,75007 Paris,France
Réservoir de stockage d’azote liquideCryo Scientific Systems Pvt. Ltd.
MicropipettesEppendorf AG,22339 Hambourg,Allemagne30020Accupipet-2-20 µ ; L
Mini broyeur de tissusBio-Rad Lab, Inc. CA 94547,USAMini broyeurs ReadyPrep
Minus 80 congélateurBlue Star Limited
Neubauer chambre de comptageMarienfeld Superior,arktheidenfeld,Germany
Colorant O rouge huileSigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA1024190250
Milieu de différenciation ostéogénique (ODM)  ;STEMCELL Technologies Inc.Vancouver, C.-B., V5Z 1B3,Canada
Paraformaldéhyde (PFA)  ;Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL119
Pénicilline-StreptomycineGibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,USA
Solution tamponnée au phosphate (PBS) sans Ca++ et Mg++HiMedia Laboratories  ; Ltd.Mumbai,IndiaTS1101
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher ScientificGibco
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher Scientific,MA, États-UnisGibco
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher Scientific
, MA, États-UnisP3813-1PAK1x PBS, pH 7,4
Proline  ;Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Lame de bistouri Taille 15  ;Swann-Morton Ltd, Sheffield, S6 2BJ,UKBDF-6955C
Hypochlorite de sodiumHiMedia Laboratories  ; Ltd.Mumbai, IndeAS1024 % p/v solution
Tubes à centrifuger stérilesTarsons Products Pvt. Ltd.
Récipient stérile -20 mL3M Center, MN 55144-1000,USA3 M
Solution saline stérile tamponnée au phosphate (PBS)Sigma Aldrich, USAP3813-1PAK1x PBS, pH 7,4
Pipettes stériles (2, 5 et 10 mLEppendorf AG,22339 Hambourg,Allemagne
Pipettes et pointes stérilesEppendorf India Limited
Surgical Blade PoignéeBecton, Dickinson and Co., NJ, USA371030BP Poignée 3
Facteur de croissance transformant-bêta 3 (TGF-&beta ; 3)R & D Systems, Inc.MN 55413, États-Unis
Facteur de croissance transformant-bêta 3 (TGF-&beta ; 3)R & D Systems, Inc.MN 55413, États-Unis
Bleu trypan 0,4 %Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USA
Bleu trypan 0,4 %  ;Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Bleu trypan 0,4 %  ;Sigma-Aldrich Co. St. Louis, MO 63103.USATCL046
Trypsine-EDTA  ;Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,États-Unis
Trypsine-EDTA 0,25 %Gibco-Thermo Fisher Scientific Inc.,MA 02451,États-Unis
Bain d’eauThermo Fisher Scientific ,MA 02451,États-UnisBSW-01D
de stockage Flacon )

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