Développement et caractérisation d’hydrogels à matrice extracellulaire pulmonaire décellularisée

Summary

Le protocole élucide deux méthodologies de décellularisation distinctes appliquées aux tissus pulmonaires bovins natifs, fournissant un compte rendu complet de leurs caractérisations respectives.

Abstract

L’utilisation d’hydrogels dérivés de la matrice extracellulaire (ECM) dans l’ingénierie tissulaire est devenue de plus en plus populaire, car ils peuvent imiter l’environnement naturel des cellules in vitro. Cependant, il est difficile de maintenir le contenu biochimique natif de l’ECM, d’obtenir une stabilité mécanique et de comprendre l’impact du processus de décellularisation sur les propriétés mécaniques des hydrogels ECM. Ici, un pipeline pour la décellularisation du tissu pulmonaire bovin à l’aide de deux protocoles différents, la caractérisation en aval de l’efficacité de la décellularisation, la fabrication d’hydrogels ECM pulmonaires décellularisés reconstitués et l’évaluation de leurs propriétés mécaniques et de cytocompatibilité ont été décrits. La décellularisation du poumon bovin a été poursuivie à l’aide d’une méthode physique (cycles de gel-dégel) ou chimique (à base de détergents). Une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine a été réalisée pour valider la décellularisation et la rétention des principaux composants de la MEC. Pour l’évaluation de la teneur résiduelle en collagène et en glycosaminoglycane sulfaté (sGAG) dans les échantillons décellularisés, les techniques de coloration au rouge de Sirius et au bleu d’Alcian ont été utilisées, respectivement. Les propriétés mécaniques des hydrogels ECM pulmonaires décellularisés ont été caractérisées par une rhéologie oscillatoire. Les résultats suggèrent que les hydrogels pulmonaires bovins décellularisés peuvent constituer une alternative organotypique fiable aux produits ECM commerciaux en conservant la plupart des composants ECM natifs. De plus, ces résultats révèlent que la méthode de décellularisation choisie affecte de manière significative la cinétique de gélification ainsi que la rigidité et les propriétés viscoélastiques des hydrogels résultants.

Introduction

Les conditions de culture monocouches conventionnelles n’offrent pas une représentation fidèle des microenvironnements tissulaires natifs et n’ont pas la capacité de fournir un échafaudage tridimensionnel (3D) avec des ligands instructifs qui permettent des interactions cellule-matrice et cellule-cellule¹. La composition de la matrice extracellulaire (MEC) et les propriétés mécaniques sont très spécifiques aux tissus, dépendent du temps et subissent des altérations dans des conditions pathologiques. Par conséquent, il existe un besoin de modèles tissulaires 3D biomimétiques qui permettent d’ajuster ces caractéristiques, de moduler le comporteme....

Protocol

Des poumons natifs frais de jeunes donneurs bovins (1-2 ans) ont été obtenus d’un abattoir local et transportés dans un récipient en plastique scellé sur de la glace jusqu’au laboratoire. Le sacrifice d’animaux est effectué pour la consommation générale de viande (poumons jetés comme déchets) et n’est pas lié ou dû à l’étude. Nous confirmons que l’abattoir respecte les lois et réglementations nationales en matière de sacrifice d’animaux. De plus, nous confirmons que nous n’avons utilisé que des déchets et que le projet de recherche n’a pas eu d’effet sur le nombre d’animaux sacrifiés.

1. Prélèvement d’organes et préparation des tissus....

Results

Décellularisation
La décellularisation du tissu pulmonaire bovin pour produire des hydrogels dECM qui récapituleraient le microenvironnement pulmonaire natif a été réalisée par des méthodes physiques (gel-dégel) et chimiques (Triton-X-100). Après la dissection, des morceaux de tissu ont été lavés avec des antibiotiques contenant du dH₂O pour éliminer les agents pathogènes qui peuvent ensuite affecter la stérilité des hydrogels dECM. Au total, cinq cycles alternant entre l’azote liquide et l.......

Discussion

Les hydrogels dérivés d’organes sont devenus des modèles prometteurs qui récapitulent la MEC des tissus natifs et imitent la fonction cellulaire organotypique. Bien que la MEC pulmonaire décellularisée ait souvent été utilisée en ingénierie tissulaire, une caractérisation approfondie de la composition et des propriétés mécaniques des biomatériaux permettra de mieux comprendre comment les interactions entre les cellules et la MEC peuvent être modulées pour modéliser les processus biologiques pendant l’homéostasie ou la ma.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Éthanol absolu	ISOLAB	64-17-5
Acide acétique	ISOLAB	64-19-7
Solution de bleu d’Alcian	Sigma-Aldrich	B8438
Désoxyribonucléase I du pancréas bovin	Sigma-Aldrich	DN25
Discovery HR-2 Rhéomètre	TA Instruments
Entellan Medium de montage	Merck	107960
Solution d’éosine	Bright-slide	2.BS01-105-1000
Microscopie électronique au	formaldéhyde	50-980-485
Acide chlorhydrique	Merck	100317
Iode	Sigma-Aldrich	3002
Chlorure de magnésium	Sigma-Aldrich	7786-30-3
Solution de coloration à l’hématoxyline de Mayer	Merck	2.BS01-103-1000
Composé O.C.T	Tissue-Tek	4583
Pénicilline/Streptomycine	Biowest	L0018-100
Pepsine de la muqueuse gastrique porcine	Sigma-Aldrich	P6887
Acide picrique	Polysciences	88-89-1
Sirius Red	Polysciences	09400-25
Hydroxyde de sodium	Sigma-Aldrich	S5881
Saccharose  ;	Sigma-Aldrich	S0389
Triton-X-100	Merck	112298