Méthodologie pour inactiver métaboliquement les bactéries pour la recherche sur Caenorhabditis elegans

Résumé

La source de nourriture de Caenorhabditis elegans en laboratoire est Escherichia coli vivant. Étant donné que les bactéries sont métaboliquement actives, elles présentent une variable confondante dans les études métaboliques et médicamenteuses chez C. elegans. Un protocole détaillé pour inactiver métaboliquement les bactéries à l’aide de paraformaldéhyde est décrit ici.

Résumé

Caenorhabditis elegans est un organisme modèle commun pour la recherche en génétique, développement, vieillissement, métabolisme et comportement. Étant donné que C. elegans consomme un régime de bactéries vivantes, l’activité métabolique de leur source de nourriture peut confondre les expériences visant à rechercher les effets directs de diverses interventions sur le ver. Pour éviter les effets confondants du métabolisme bactérien, les chercheurs de C. elegans ont utilisé plusieurs méthodes pour inactiver métaboliquement les bactéries, y compris l’irradiation ultraviolette (UV), l’élimination par la chaleur et les antibiotiques. Le traitement UV est relativement faible et ne peut pas être utilisé en culture liquide car chaque plaque doit être examinée pour une destruction bactérienne réussie. Une deuxième méthode de traitement, la chaleur meurtrière, affecte négativement la texture et la qualité nutritionnelle de la bactérie, conduisant à l’arrêt du développement de C. elegans. Enfin, le traitement antibiotique peut modifier directement la physiologie de C. elegans en plus d’empêcher la croissance bactérienne. Ce manuscrit décrit une méthode alternative pour inactiver métaboliquement les bactéries à l’aide du paraformaldéhyde (PFA). Le traitement PFA réticulant les protéines dans les cellules bactériennes pour empêcher l’activité métabolique tout en préservant la structure cellulaire et le contenu nutritionnel. Cette méthode est à haut débit et peut être utilisée dans la culture liquide ou les plaques solides, car le test de croissance d’une plaque de bactéries traitées au PFA valide l’ensemble du lot. L’inactivation métabolique par traitement PFA peut être utilisée pour éliminer les effets confondants du métabolisme bactérien sur les études de supplémentation en médicaments ou en métabolites, la résistance au stress, la métabolomique et le comportement chez C. elegans.

Introduction

Caenorhabditis elegans a été proposé à l’origine comme organisme modèle en 1965^{1 et} a depuis été largement adopté dans les études sur la génétique, le développement, le comportement, le vieillissement et le métabolisme². En raison de la grande taille de son couvain et de sa cuticule transparente, C. elegans est particulièrement bien adapté au criblage à haut débit avec des rapporteurs fluorescents³. Leur cycle de vie court, leur reproduction hermaphrodite et leur homologie génétique avec l’homme font également de C. elegans un système modèle précieux pour les études sur ....

Protocole

1. Inoculation des bactéries

1. Préparez le bouillon Luria (LB) en dissolvant 10 g de tryptone, 5 g d’extrait de levure et 10 g de chlorure de sodium (NaCl) dans 950 mL d’eau distillée.
2. Ajustez le pH de la LB à 7,0 en ajoutant de l’hydroxyde de sodium (NaOH) 5M. Cela ne devrait nécessiter qu’environ 0,2 mL de NaOH.
3. Autoclaver le média LB ajusté au pH sur un cycle liquide pendant 45 min à 15 psi. Laissez la solution refroidir et conservez-la à température ambiante.
4. Inoculer une seule colonie de bactéries dans 100 mL de LB dans un erlenmeyer de 500 mL. Cultivez les bactéries pendant une nuit dans un incubateur à seco....

Résultats

Un flux de travail détaillé du protocole est illustré à la figure 1. Une méthode à haut débit a été mise au point et optimisée pour inactiver de façon constante la réplication bactérienne (figure 2A) et le métabolisme (figure 2B) pour les études métaboliques et médicamenteuses dans le cadre de la recherche sur C. elegans à l’aide du paraformaldéhyde¹⁶. L’objectif était de déterminer la plus faible co.......

Discussion

Avantages de la destruction des PFA par rapport aux autres méthodes de destruction des bactéries
Le traitement par PFA est une méthode à haut débit pour prévenir le métabolisme bactérien tout en maintenant une source de nourriture nutritive pour C. elegans. L’élimination des bactéries par le biais d’un traitement PFA présente de multiples avantages par rapport aux autres méthodes. Contrairement au traitement UV, où chaque plaque doit être testée pour réussir à tuer, une seule plaque d’un lot .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Agrafes	feuille d’aluminium	2549291
bec Bunsen	VWR	470121-700  ;
Densimètre	Denville	80-3000-45  ;
Centrifugeuse	Eppendorg	5430
Hotte chimique	Labcono	975050411384RG
Tubes conincals (50 mL)	Fisher	339652
Cuvettes  ;	Fisher	14-955-127
E. coli OP50	CGC	OP50
Fioles Erlenmyer	Fisher	250 mL : FB501250 500 mL : FB501500 1000 mL : FB5011000
Boucle d’inoculation	Fisher	22-363-605
LB Agar	Fisher	BP1425500
Bouteille de collecte des déchets liquides	Thomas Scientific	1230G50
Sulfate de magnésium (MgSO4)	Sigma	M7506
Paraformaldéhyde (32 %)	Microscopie électronique Sciences	15714-S	Solution sans paraformaldéhyde &ndash ; sans méthanol
Pipettor	Eppendorf	Eppendorf Easypet 3
Boîtes en plastique (100 mm)	Fisher	FB0875712
Phosphate de potassium monobasique (KH2PO4)	Fisher	P2853
Seahorse XF Calibrant	Agilent	100840-000
Seahorse XFe96 Kit de dosage de flux extracellulaire et microplaque de culture cellulaire	Agilent	101085-004
Pipettes sérologiques (50 mL)	Genesee Scientific	12-107
Incubateur à agitateur	Thermo	11 676 083
Chlorure de sodium (NaCl)	Fisher	S640-3
Hydroxyde de sodium (NaOH)	Fisher	S318500
Phosphate de sodium dibasique anhydre (Na2HPO4)	Sigma	S374-500
Godet de collecte des déchets solides	M& M Industries	; 5,0 gallons M1 Seau
Tryptone	Genesee Scientific	20-251
Vortex	Thermo	11676331
Balance de pesée	C Goldenwall	HZ10K6B
Extrait de levure	Genesee Scientific	20-255

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