Application de la coloration des mitochondries vivantes dans le tri cellulaire pour purifier les hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes induites par l’homme

Résumé

Les hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes peuvent être purifiés par tri cellulaire, en utilisant une combinaison de coloration de la molécule d’adhésion des cellules leucocytaires activées (ALCAM, également connue sous le nom de CD166).

Résumé

Les cellules souches embryonnaires humaines (SE) et les cellules souches pluripotentes induites (iPS) ont des applications potentielles en médecine régénérative cellulaire pour traiter les organes gravement malades en raison de leur prolifération illimitée et de leurs propriétés pluripotentes. Cependant, il est difficile de différencier les cellules ES/iPS humaines en types de cellules cibles 100 % pures en raison de leur grande sensibilité à l’environnement. La tumorigenèse après transplantation est causée par des cellules contaminées, proliférantes et indifférenciées, ce qui rend la technologie de haute purification essentielle pour la réalisation en toute sécurité de la médecine régénérative. Pour atténuer le risque de tumorigenèse, une technologie de purification élevée a été développée pour les hépatocytes dérivés de cellules iPS humaines. La méthode utilise le FACS (tri cellulaire activé par fluorescence) en utilisant une combinaison de contenu mitochondrial élevé et du marqueur de surface cellulaire ALCAM (molécule d’adhésion cellulaire leucocytaire activée) sans modification génétique. 97 % ± 0,38 % (n = 5) des hépatocytes purifiés utilisant cette méthode présentaient une expression protéique de l’albumine. Cet article vise à fournir des procédures détaillées pour cette méthode, telle qu’appliquée à la méthode de différenciation bidimensionnelle la plus récente pour les cellules iPS humaines en hépatocytes.

Introduction

Les cellules souches embryonnaires et pluripotentes induites (ES et iPS, respectivement) sont considérées comme des sources cellulaires prometteuses pour les thérapies régénératives. Cependant, l’efficacité de la différenciation de ces cellules en types de cellules cibles spécifiques peut varier, même en utilisant la même lignée cellulaire, le même protocole et le même expérimentateur 1,2,3,4. Cette variabilité peut être attribuée à la grande sensibilité des cellules ES/iPS humaines à leur environnement. Par conséquent, il est actuellement difficile d’obtenir de manière cohérente des cellules cibles pures. Pour parvenir à une médecine régénérative hautement sûre, il est crucial d’éliminer les cellules prolifératives et les cellules souches indifférenciées dans les cellules thérapeutiques, et une technologie de purification avancée pour les cellules cibles est essentielle ^5,6,7.

Un trieur de cellules est un appareil qui analyse instantanément les cellules individuelles et trie les cellules vivantes d’intérêt en fonction de l’intensité du signal fluorescent, offrant ainsi une solution prometteuse. Cela peut être accompli par la coloration par anticorps de marqueurs de surface spécifiques au type cellulaire ou en utilisant des expressions de gènes rapporteurs spécifiques au type cellulaire. En utilisant cette technique, il existe plusieurs rapports sur les méthodes de purification des cardiomyocytes ^8,9,10 et des hépatocytes^11,12 dérivés de cellules souches pluripotentes. Hattori et al. ont développé une méthode innovante de purification mitochondriale à l’aide d’un trieur de cellules¹³. Tirant parti du fait que les cardiomyocytes ont des besoins énergétiques élevés par le biais de l’activité mitochondriale, la coloration des cellules avec le colorant TMRM (ester méthylique de tétraméthylrhodamine) peut être utilisée pour marquer et purifier fortement les cardiomyocytes par FACS à partir de corps embryoïdes dérivés de cellules ES humaines contenant divers types de cellules. L’absence de tumorigénicité a été confirmée par des tests de formation de tératomes avec les cardiomyocytes purifiés. De plus, Yamashita et al. ont découvert de manière inattendue une méthode pour purifier les hépatocytes des corps embryoïdes dérivés de cellules ES humaines en isolant des fractions à forte activité mitochondriale et à expression ALCAM-positive¹⁴. La raison de cette méthode est que les hépatocytes ont également un nombre relativement élevé de mitochondries en raison de leur forte consommation d’ATP pour le métabolisme des nutriments et la détoxification¹⁵, et les hépatocytes expriment ALCAM, un membre de la superfamille des immunoglobulines, qui joue un rôle dans l’adhésion et la migration cellulaires¹⁶.

Les méthodes précédentes de purification élevée pour les hépatocytes dérivés de cellules souches pluripotentes nécessitaient des modifications génétiques, et les méthodes de purification non génétiques avaient une faible efficacité¹⁷. La méthode mitochondriale non génétique a le mérite d’atteindre une grande pureté. Lorsque des cellules progénitrices hépatiques sont nécessaires, il est possible de choisir des méthodes basées sur CD133 et CD13 ou Dlk1^18,19. Bien que la précision de la technologie d’édition du génome ait progressé, le risque potentiel de changements génomiques imprévus (par exemple, la cancérogenèse) ne peut pas être entièrement éliminé. Les méthodes basées sur l’activité mitochondriale, sans impliquer de modification génétique, peuvent être exemptes de tels risques.

À la suite de l’examen de divers indicateurs mitochondriaux dans les cardiomyocytes néonatals de rats, on a observé que la TMRM disparaissait complètement en 24 heures, tandis que les autres colorants restaient pendant au moins 5 jours¹³. De plus, il est important de noter que TMRM et JC-1 n’ont pas eu d’impact sur la viabilité cellulaire lorsqu’ils ont été évalués à l’aide de l’essai au bromure de 3-(4,5-diméthyl-thiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), tandis que d’autres colorants ont démontré des effets variables sur la viabilité cellulaire¹³. TMRM démontre une sécurité accrue.

À ce jour, plusieurs méthodes de différenciation bidimensionnelle (2D) ont été développées comme approches plus efficaces pour induire la différenciation par rapport à la formation de corps embryoïdes tridimensionnels (3D). En effet, les composés ou cytokines induisant la différenciation par étapes peuvent être administrés uniformément aux cellules sur un plan 2D, plutôt que dans un espace 3D. Dans cette étude, la méthode²⁰ précédemment rapportée a été modifiée pour induire la différenciation en hépatocytes dérivés de cellules iPS humaines. Nous décrirons ici les détails des procédures de différenciation et de purification 2D modernes des hépatocytes dérivés de cellules iPS humaines.

Protocole

Cette étude a utilisé des cellules iPS humaines obtenues commercialement (souche 253G1) (voir le tableau des matériaux).

1. Maintenance des cellules iPS humaines

1. Maintenir les cellules iPS humaines dans des conditions exemptes de feeder dans un milieu AK02 sur des boîtes de culture recouvertes de 0,25 μg/cm² iMatrix-511 (voir le tableau des matériaux).

2. Différenciation hépatique des cellules iPS humaines dans des cultures 2D

REMARQUE : Reportez-vous à la figure 1A pour le calendrier quotidien de différenciation hépatique. Tout au long du processus, utilisez des plaques de culture à 6 puits et ajoutez 2 ml du milieu de lavage ou de culture désigné dans chaque puits. Maintenir l’état de culture cellulaire à 100 % d’humidité, 5 % de CO₂ et 20 % d’O2 à 37 °C.

1. Enduire chaque puits d’une plaque de 6 puits avec 1 mL de matrice de membrane basale (diluée 1/25 dans du PBS (-)), et incuber à 37 °C pendant 1 h.
2. Passage de cellules iPS humaines sur la boîte enrobée à une densité de 20 000 à 30 000 cellules/cm² à l’aide d’un milieu AK02N complété par un inhibiteur de ROCK 10 μM (Y-27632) (voir le tableau des matériaux). Remplacer le milieu sans Y-27632 le lendemain et cultiver pendant 2 jours supplémentaires.
3. Lavez les cellules une fois avec le milieu RPMI-1640. Amorcer la différenciation de l’endoderme en remplaçant le milieu par du RPMI-B27-Glu (RPMI-1640 + 2 % d’insuline B27 + 1 % de dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine) complété par 3-6 μM de CHIR-99021 et 100 ng/mL d’Activin A pendant 24 h (voir le tableau des matériaux).
4. Remplacer le milieu par du RPMI-B27-Glu complété par 50 ng/mL d’Activin A pendant 24 h.
5. Pour induire la différenciation des progéniteurs hépatiques, remplacez le milieu par du RPMI-B27-Glu complété par 1 % de diméthylsulfoxyde (DMSO) pendant 5 jours.
6. Pour favoriser la maturation des hépatocytes, passez au milieu de maturation des hépatocytes : le milieu L-15 de Leibovitz contenant 10 μM d’hydrocortisone 21-hémisuccinate, 8,3 % de bouillon de phosphate tryptose, 100 nM de dexaméthasone (DEX), 50 μg/mL de L-ascorbate de sodium, 0,58 % d’insuline-transferrine-sélénium (ITS), 8,3 % de sérum de veau fœtal (FBS), 2 mM de dipeptide L-Alanyl-L-glutamine et 100 nM de N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino hexanoïque amide (Dihexa) (voir le tableau des matériaux).
7. Changez de milieu tous les 2 jours pendant 20 jours. Triez les cellules environ 27 jours après le début de la différenciation.

3. Préparation cellulaire pour la purification d’hépatocytes dérivés de cellules iPS humaines

1. Laver les cellules hépatiques différenciées avec 2 mL de PBS (-) par puits.
2. Ajouter 1 mL de solution enzymatique par puits, qui comprend 0,1 % de collagénase, 0,083 % de trypsine, 10 μM d’inhibiteur de ROCK (Y-27632), 20 nM de ciclosporine A et 50 μg/mL de sodium-L-ascorbate dans le tampon Ads (116 mM de NaCl, 12,5 mM de NaH₂PO₄, 20 mM d’HEPES, 5,4 mM de KCl, 5,6 mM de glucose et 0,8 mM de MgSO4 ; pH de 7,35) (voir le tableau des matériaux). Détachez les cellules des plaques en les tournant horizontalement à 37 °C pendant environ 2 h.
3. Après avoir vérifié que les cellules sont détachées et arrondies au microscope, dispersez-les dans des cellules uniques par pipetage doux et recueillez-les dans un tube de 50 ml.
4. Centrifuger les cellules à 200 x g pendant 5 min à 18 °C pour les granuler. Retirez le surnageant à l’aide d’un aspirateur.
5. Teinter les mitochondries des cellules en les dispersant dans 5 mL de milieu de maturation hépatocytaire contenant 100 nM de TMRM (tétraméthylrhodamine, ester de méthlique) (voir Tableau des matières). Incuber 30 min à 37 °C à l’abri de la lumière en l’enveloppant dans du papier aluminium.
6. Centrifugez les cellules à 200 x g pendant 5 min à 18 °C pour les granuler. Retirez le surnageant.
7. Remettre les cellules en suspension avec 1 à 5 ml de tampon Ads froid contenant 2 % de FBS.
8. Comptez le numéro de cellule à l’aide d’une solution de bleu de trypan à 0,4 % et d’une plaque de numération cellulaire.
9. Centrifugez les cellules à 200 x g pendant 5 min à 4 °C pour les granuler. Retirez le surnageant.
10. Diluer un anticorps anti-ALCAM (anticorps primaire, voir tableau des matériaux) dans un rapport de 1:50 dans le tampon Ads, et ajouter 100 μL de l’anticorps dilué par 10⁶ cellules. Teintez les cellules pendant 50 min sur de la glace. Préparez des cellules qui ne sont pas colorées avec l’anticorps primaire comme contrôle négatif.
11. Lavez deux fois les cellules avec un tampon Ads froid contenant 2 % de FBS.
12. Diluer une IgG anti-chèvre d’âne Alexa Fluor 488 (anticorps secondaire, voir tableau des matériaux) à un rapport de 1:100 dans le tampon Ads, et ajouter 100 μL de l’anticorps dilué par 10⁶ cellules. Teignez les cellules pendant 30 min sur de la glace. Cellules colorantes qui n’ont pas été colorées avec l’anticorps primaire à l’aide de l’anticorps secondaire.
13. Lavez deux fois les cellules avec un tampon Ads froid contenant 2 % de FBS.
14. Résuspendez les cellules dans la mémoire tampon Ads et filtrez-les à l’aide d’une crépine de cellule à capuchon encliquetable (maille de 35 μm) juste avant le tri par FACS pour éliminer les gros amas de cellules et les débris.

4. Analyses FACS et tri des hépatocytes dérivés de cellules iPS humaines

1. Configurez la machine FACS pour le tri des cellules en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
   REMARQUE : Utilisez une buse de 85 μm ou 100 μm et un filtre ND de 2,0 pour les hépatocytes. Utilisez le canal FITC pour détecter Alexa Flour 488 pour ALCAM et le canal PE pour détecter la fluorescence TMRM pour les mitochondries.
2. Ajustez les tensions FSC (diffusion directe) et SSC (diffusion latérale) pour visualiser correctement la population de cellules.
3. Ajustez les tensions des canaux fluorescents FITC et PE. Commencez par les cellules non étiquetées et centrez la population de cellules au bas de chaque graphique de canaux. Assurez-vous que les cellules étiquetées sont correctement positionnées dans le tracé.
4. Utilisez une stratégie de contrôle courante pour éliminer les doublets : Gate le FSC-A majeur vs. Population du CSS-A (figure 2A), suivie de la population FSC-H c. -W, puis SSC-H vs. -W (Figure 2B,C).
5. Gate la population TMRM^hi et ALCAM⁺ (P2 sur la figure 2E) pour trier les hépatocytes. Gate la population TMRM^hi et ALCAM^- (P1 dans la figure 2E) pour trier les non-hépatocytes. Prélever les hépatocytes et les non-hépatocytes triés dans des tubes de collecte de 15 ml contenant du milieu de maturation des hépatocytes.
6. Centrifuger le tube de prélèvement contenant les cellules triées à 200 x g pendant 5 min à 18 °C.
7. Retirez le surnageant et remettez les cellules en suspension dans le milieu de maturation des hépatocytes.
8. Ensemencez les cellules sur des fibroblastes embryonnaires de souris (MEF) traités à la mitomycine C ou sur une matrice de membrane basale semblable à un gel avec un milieu de maturation hépatocytaire complété par 10 μM d’Y-27632 et 20 nM de ciclosporine A. Cultivez les cellules dans un incubateur de_CO2 à 37 °C pendant 5 jours.

5. Immunocytochimie pour la détection des hépatocytes dérivés de cellules iPS humaines

1. Laver les cellules cultivées pendant 5 jours après le tri avec du PBS (-).
2. Fixez les cellules avec 4% de paraformaldéhyde pendant 5 min à température ambiante.
3. Lavez deux fois les cellules avec un tampon TBS-T (1x TBS avec 1% de Tween 20) pour éliminer le paraformaldéhyde.
4. Incuber les cellules avec 0,1 % de tampon TBS-T dilué Triton X-100 pendant 5 min à température ambiante.
5. Lavez deux fois les cellules avec le tampon TBS-T pour retirer le Triton X-100.
6. Ajouter une solution de blocage disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) dans les cellules pendant 30 minutes à température ambiante.
7. Ajouter des anticorps primaires contre l’albumine (marqueur hépatocytaire) et l’antigène nucléaire humain (hNA, voir tableau des matériaux), dilués 1:50 dans une solution bloquante.
8. Incuber les cellules à 4 °C pendant la nuit. Lavez deux fois les cellules avec le tampon TBS-T.
9. Ajouter des anticorps secondaires : Alexa Fluor 488 âne anti-IgG lapin et Alexa Fluor 546 âne anti-souris IgG, dilués 1:100 dans une solution bloquante (voir tableau des matériaux).
10. Incuber les cellules à température ambiante pendant 30 min. Lavez deux fois les cellules avec le tampon TBS-T.
11. Évaluez la pureté des hépatocytes en comptant les cellules positives à l’albumine et aux hNA positives au microscope à fluorescence. Calculez le pourcentage de cellules positives à l’albumine par cellule hNA positive pour les populations P1 et P2.

Résultats

La chronologie des processus induisant les cellules iPS humaines à se différencier en hépatocytes par culture 2D (Figure 1A) et les caractéristiques cellulaires représentatives (Figure 1B) sont présentées. Approximativement au 12e jour de différenciation, les cellules ont commencé à présenter des formes cellulaires polygonales et des noyaux ronds, caractéristiques des hépatocytes. Certains hépatocytes ont également montré une multinucléation.

Discussion

En raison de leurs fonctions dans le métabolisme des nutriments et la détoxification, les hépatocytes possèdent un nombre relativement important de mitochondries par rapport aux autres types de cellules¹⁵. ALCAM fait partie de la superfamille des immunoglobulines et joue un rôle dans l’adhésion et la migration cellulaires. Il est exprimé dans divers types de cellules, notamment les cellules hépatiques, épithéliales, lymphoïdes, myéloïdes, fibroblastiques et neuronales¹⁶. En...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
253G1 lignée cellulaire humaine iPS	recherche RIKEN BioResource	HPS0002
4 % de paraformaldéhyde	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	163-20145
Activine A Solution, humaine, recombinante	NACALAI TESQUE, INC.	18585
Anticorps anti-noyaux, clone 235-1	Chemicon	MAB1281	contre l’antigène nucléaire humain
B-27 Supplément (50x), sans sérum	Thermo Fisher Scientific	17504044
BD FACSAria III	BD Biosciences		Trieur de cellules
CHIR-99021	MedChemExpress	HY-10182  ;
Ciclosporine A	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	035-18961
Collagénase	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	034-22363
Corning Matrigel Facteur de croissance réduit (DFG) Matrice de membrane basale	Corning	354230	Matrice de membrane basale de type gel
CultureSure Y-27632	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	036-24023	Inhibiteur de ROCK
Dexaméthasone	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-18863
Diméthylsulfoxyde (DMSO)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	047-29353
Anticorps secondaire anti-chèvre IgG (H+L) d’âne, Alexa Fluor 488 Thermo	Fisher Scientific	A-11055
Anticorps secondaire anti-souris Donkey (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 546 Thermo	Fisher Scientific	A10036
IgG anti-lapin Donkey (H+L) Anticorps secondaire à adsorption croisée élevée, Alexa Fluor 488 Thermo	Fisher Scientific	A-21206
Falcon 5 mL Tube à essai en polystyrène à fond rond, avec filtre cellulaire Snap Cap	Corning	352235
sérum	de bovin fœtalBiowest	51820-500
Supplément GlutaMAX	Thermo Fisher Scientific	35050061	Dipeptide L-Alanyl-L-Glutamine
Humain/Souris/Rat/Canin ALCAM/CD166 Anticorps	R& D Systems	AF1172
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sel sodique	Sigma-Aldrich	H2270
iMatrix-511 soie	Nippi	892021
ImmunoBlock	KAC	CTKN001	Solution bloquante
ITS-G Supplement(× ; 100)	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	090-06741
Leibovitz’s L-15 Medium	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	128-06075
N-Hexanoic-Try-Ile-(6)-amino Hexanoic amide (Dihexa)	Toronto Research Chemicals	H293745
Polyclonal Rabbit Anti-Human Albumin	Dako	A0001
Polyoxyéthylène Sorbitan Monolaurate (préadolescent de 20 ans)	NACALAI TESQUE, INC.	28353-85
RPMI-1640	FUJIFILM Wako Pure Chemical Corporation	189-02025
L-ascorbate de sodium	NACALAI TESQUE, INC.	03422-32
StemFit AK02N	REPROCELL	RCAK02N
TBS (10x)	NACALAI TESQUE, INC.	12748-31
Tétraméthylrhodamine, ester méthylique (TMRM)	Thermo Fisher Scientific	T668
Triton X-100	NACALAI TESQUE, INC.	28229-25
Trypan Blue Solution	NACALAI TESQUE, INC.	20577-34
TRYPSINE 250	Difco	215240
Solution de bouillon de phosphate de tryptose	Sigma-Aldrich	T8159