Method Article

Isolement, identification comportementale et évaluation de la pathogénicité des champignons entomopathogènes d’un xylophage forestier

DOI:

10.3791/65782

⸱

September 29th, 2023

 ,  ,  ,  , 
1School of Forestry and Biotechnology, Zhejiang A&F University, 2Key Laboratory of Vector Biology and Pathogen Control of Zhejiang Province, Huzhou University, 3Department of Biology, Lund University

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici un protocole pour obtenir des champignons entomopathogènes à partir d’un foreur de bois forestier et une manière substitutive d’évaluer leurs activités entomopathogènes à l’aide d’un insecte modèle coléoptère. Cette méthode est efficace et pratique pour explorer les ressources fongiques entomopathogènes des insectes xylophages ravageurs dans les forêts naturelles.

Abstract

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les xylophages forestiers causent de graves dommages aux arbres et des pertes économiques dans le monde entier. La libération de champignons entomopathogènes (FPE) pendant la période d’émergence des FWB est considérée comme une alternative acceptable à la lutte chimique. Cependant, les ressources de l’EPF ont été nettement moins explorées pour les FWB, contrairement aux insectes ravageurs agricoles. Cet article présente un protocole pour explorer les ressources EPF des FWB en utilisant des populations sauvages de Monochamus alternatus à titre d’exemple. Dans ce protocole, l’attribution des pièges appâtés avec M. Les attractifs d’alternatus pour différentes populations ont garanti la collecte d’échantillons adéquats présentant des symptômes naturels d’infection, pendant les périodes d’émergence du coléoptère. Après avoir disséqué finement des téguments et les avoir placés sur un milieu sélectif, des espèces fongiques ont été isolées de chaque partie du corps des coléoptères et identifiées sur la base de traits moléculaires et morphologiques.

Plusieurs espèces fongiques ont été certifiées comme EPF parasites par réinfection de M. alternatus sain avec des suspensions de spores. Leurs phénotypes comportementaux sur M. alternatus ont été observés à l’aide de la microscopie électronique à balayage et comparés à ceux de l’insecte modèle Coléoptère Tribolium castaneum. Pour les EPF qui présentent des phénotypes de parasitisme cohérents sur les deux espèces de coléoptères, évaluation de leurs activités sur T. castaneum a fourni des informations précieuses sur la létalité pour les études futures sur M. alternatus. Ce protocole a permis de découvrir des EPF récemment signalés sur les populations de M. alternatus en Chine, ce qui pourrait être appliqué comme une approche efficace pour explorer davantage de ressources EPF provenant d’autres FWB.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La dévastation causée par les insectes ravageurs a entraîné d’importantes pertes écologiques et économiques dans les écosystèmes forestiers et agricoles. La plupart des ravageurs agricoles s’exposent à des ennemis naturels ou à des agents de contrôle artificiels tout en endommageant les plantes hôtes. Au lieu de cela, les xylophages forestiers terminent presque tous leurs cycles de développement à l’intérieur des troncs d’arbres hôtes1, ce qui pose de grands défis pour l’exploration d’organismes de biocontrôle efficaces dans la nature. Ce qui est encore pire, c’est que les FWB sont porteurs d’un grand nombre de phytopathogènes2 ou ont une relation intime avec ces agents pathogènes en tant que vecteurs potentiels 3,4, amplifiant considérablement les effets négatifs des FWB sur la santé des forêts. L’utilisation excessive d’insecticides chimiques peut atténuer la gravité de la FWB, mais l’émergence d’une résistance aux insecticides 5,6 limite leur application dans l’environnement. Dans certains cas, des insectes parasitoïdes, des arthropodes prédateurs ainsi que des microbes entomopathogènes ont été libérés en tant qu’agents de lutte biologique dans les aires de distribution de FWB7 et se sont avérés être des alternatives efficaces et économiquement acceptables à la lutte chimique 8,9,10.

Les champignons entomopathogènes (EPF) sont considérés comme ayant l’avantage de contrôler la FWB par rapport à la plupart des autres groupes microbiens. Leurs spores peuvent être transportées par des insectes hôtes et fixées de manière stable à la surface du corps par pénétration dans la cuticule ou le tégument 8,11. Les EPF présentent également une excellente adaptabilité aux stress environnementaux et certaines espèces colonisent bien les tissus des arbres en tant qu’endophytes12,13, facilitant leur croissance, leur survie et leur transmission. Cependant, par rapport à celle des industries agricoles, la diversité des espèces d’EPF utilisées dans les écosystèmes forestiers naturels est remarquablement limitée 14,15,16. Beauveria bassiana (souche PPRI 5339) s’est avérée être la souche la plus prometteuse pour promouvoir un programme de lutte intégrée contre les charançons de l’eucalyptus en Afrique du Sud17 et la combinaison de deux isolats prometteurs de B. Bassiana a fourni l’occasion de lutter efficacement contre le charançon rouge du palmier, Rhynchophorus ferrugineus, à différents stades de sa vie dans les champs de palmiers18. En plus de Beauveria et du célèbre Metarhizium, d’autres genres EPF de l’ordre des Hypocreales, en particulier les espèces de Lecanicillium (dont beaucoup sont maintenant classées dans le genre Akanthomyces19,20), ont montré une forte pathogénicité et un fort potentiel dans la gestion des ravageurs forestiers, tels que le puceron du cyprès au Chili21.

Le scieur du pin Monochamus alternatus est un ravageur notoire des forêts de pins en Chine et dans les pays voisins, qui s’enfouit dans les branches et les troncs des pins pour entraver le transport des nutriments et de l’eau 22,23,24. De plus, M. alternatus favorise également l’invasion du nématode des bois du pin (Bursaphelenchus xylophilus, PWN) comme principal coléoptère vecteur. Une autre espèce congénère du coléoptère, M. galloprovincialis, a propagé le népontin du poisson dans plusieurs pays d’Europe au cours des dernières années25. Des recherches antérieures ont rapporté plusieurs genres d’EPF naturels de Monochamus spp., tels que Beauveria, Metarhizium et Lecanicillium (Verticillium, un ancien nom de Lecanicillium), en Espagne, au Japon et dans les provinces d’Anhui / Zhejiang en Chine 26,27,28,29. Néanmoins, ces collections d’EPF semblent être généralement limitées à un certain endroit, par rapport à la grande présence de coléoptères Monochamus dans les champs naturels. Comme le coléoptère M. alternatus a une large distribution géographique en Chine, il pourrait être considéré comme un xylophage représentatif pour explorer davantage d’EPF potentiels dans différentes populations.

Dans le présent protocole, nous introduisons une procédure spécifique explorant les EPF de plusieurs populations géographiques de M. alternatus dans le sud de la Chine. Ce protocole utilise un modèle de coléoptère comme substitut pour effectuer des tests d’entomopathogénicité, à condition que l’espèce fongique testée présente un phénotype comportemental cohérent chez les deux espèces de coléoptères. Ce protocole peut également fournir des informations sur l’exploration de l’EPF pour d’autres xylophages forestiers, dans lesquels la diversité de leurs espèces fongiques entomopathogènes est sous-estimée ou moins étudiée.

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Protocol

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Isolement de champignons à partir de M. alternatus (figure 1)

  1. Prélever l’échantillon de coléoptère
    1. Collecter les pins scieurs M. À l’aide de pièges commerciaux (voir la table des matières), l’alternatus a appâté avec des attractifs avant les périodes d’émergence prévues des populations de coléoptères dans les forêts de pins naturellement infectées.
      REMARQUE : Dans cette étude, des coléoptères ont été prélevés dans cinq régions géographiques du sud de la Chine (Huzhou/Zhejiang, Liangshan/Sichuan, Xiamen/Fujian, Shaoguan/Guangdong, Yulin/Guangxi). La mise en place du piège de haut en bas est la suivante : un haut rond (50 cm de diamètre), un panneau en forme de croix (35 cm de largeur et 66 cm de longueur), un entonnoir (35,5 cm de diamètre rond supérieur et 5,5 cm de diamètre rond inférieur), un gobelet de collecte (10,5 cm de diamètre et 26,5 cm de longueur). Les substances volatiles de l’hôte (p. ex. l’éthanol et le α-pinène) et la phéromone d’agrégation (2-undécyloxy-1-éthanol) sont utilisées comme appât30.
    2. Étiquetez l’échantillon avant de le transférer au laboratoire. Mettez chaque coléoptère dans des tubes stérilisés individuels avec des brindilles fraîches. Remplacez les brindilles par des brindilles fraîches tous les 2 jours.
    3. Élevez les coléoptères vivants à 25 ± 1 °C dans un incubateur non humidifié (cycles de 16 à 8 L/J) et observez-les quotidiennement.
    4. Enregistrer des échantillons montrant une diminution de l’alimentation et de la mobilité. Transfert mort M. alternatus qui deviennent durcis et rigides jusqu’aux chambres humides pour observer la croissance du mycélium et des conidies fongiques.
      REMARQUE : Une fois infectés par des champignons entomopathogènes, les coléoptères ont montré une diminution de leur alimentation et de leur mobilité au stade initial de l’infection31,32. Après la mort, leur corps est devenu durci et rigide, avec des mycéliums et des conidies apparaissant plusieurs jours après le stockage dans une chambre humide33.
    5. Conservez les cadavres de scarabées atteints d’infections fongiques à 4 °C pour une utilisation future. Pour suivre ce protocole, traitez les échantillons immédiatement en quelques heures pour éviter une contamination par des champignons plus saprotrophes.
  2. Préparation du milieu de croissance
    1. Ajouter 39 g de poudre de gélose au dextrose de pomme de terre (PDA) dans 1 L d’eau pure et autoclaver pendant 30 min à 121 °C.
    2. Laisser refroidir à une température de fonctionnement (~50 °C), ajouter 0,05 g de streptomycine, 0,05 g de pénicilline G et 0,05 g de tétracycline, et agiter pour répartir le milieu.
    3. Plaquez le milieu dans des boîtes de Pétri sous un banc propre et utilisez-le après solidification.
      REMARQUE : Le milieu PDA avec des antibiotiques est utilisé pour l’isolement des coléoptères, ce qui empêche la croissance des bactéries sans affecter la croissance des champignons pendant l’isolement. Cependant, le milieu PDA sans antibiotiques est utilisé pour la culture quotidienne et la conservation.
    4. Mettez 35 g de poudre de bouillon de dextrose de pomme de terre (PDB) dans 1 L de ddH2O et autoclavez-le pendant 30 min à 121 °C. Refroidissez-le pour l’utiliser.
  3. Dissection de l’échantillon de coléoptère présentant des symptômes d’infection fongique
    1. Préparer des ciseaux, des scalpels et des épingles à insectes stérilisés ; Ensuite, travaillez sous un banc propre avec un brûleur à alcool.
      REMARQUE : L’utilisation d’outils de dissection peut être ajustée selon les préférences personnelles. Les épingles à insectes sont plus tranchantes que les aiguilles de dissection standard, et différentes spécifications peuvent répondre au besoin de dissection.
    2. Disséquez les téguments du corps du coléoptère à l’aide d’outils dans des boîtes de Pétri stériles et à usage unique. Veillez à éviter d’endommager les tissus de l’intestin moyen et de l’intestin postérieur qui peuvent exsuder du contenu interne.
    3. Divisez le corps des coléoptères en les positions principales comme suit : antennes, tête, thorax, abdomen, ailes (chaque paire) et pattes.
  4. Purification des champignons
    1. Coupez les téguments de chaque position en petits morceaux avec des ciseaux. Appuyez doucement la surface extérieure sur la surface des plaques PDA contenant des antibiotiques.
      REMARQUE : Assurez-vous que le mycélium fongique sur les téguments a été inoculé à la plaque.
    2. Sceller soigneusement avec du parafilm et cultiver dans un incubateur à 25 ± 1 °C jusqu’à ce que les tissus soient complètement recouverts de mycélium.
    3. Transférer des colonies individuelles en fonction des propriétés phénotypiques (couleur, forme) sur un nouveau PDA avec des antibiotiques pour une culture à 25 ± 1 °C.
    4. Répéter l’étape 1.4.3 deux ou trois fois avec de la PCA avec des antibiotiques jusqu’à ce que les colonies pures soient isolées séparément.
      REMARQUE : Si plusieurs souches fongiques se développent dans les plaques d’origine, choisissez le mycélium avec précision pour faciliter le tri d’autres espèces fongiques.
  5. Conservation des isolats fongiques
    1. Transférer des blocs de gélose (~5 mm de diamètre) des colonies vers de nouvelles plaques de PDA.
    2. Culture en incubateur à 25 ± 1 °C pendant 1 à 2 semaines.
    3. Placer dans un réfrigérateur à 4 °C pour un stockage quotidien en vue d’une utilisation ultérieure.
    4. Inoculer les souches fongiques dans 50 mL de PDB stérile dans une fiole de 250 mL, en agitant à 180 tr/min/min à 25 °C pendant 5 à 7 jours.
    5. Récoltez 1 mL de mycélium fongique fraîchement cultivé et mettez-le en suspension dans 1 mL de glycérol stérilisé à 20 % dans des tubes de congélation stériles de 2 mL (la concentration finale de glycérol est de 10 %).
    6. Scellez les tubes avec du parafilm et prérefroidissez-les à -20 °C et -40 °C. Ensuite, maintenez les tubes à -80 °C comme stocks.

2. Identification moléculaire et morphologique des isolats fongiques

  1. Extraction de l’ADN génomique fongique
    1. Cultiver des champignons dans la PDB comme décrit à l’étape 1.5.4.
    2. Récoltez le mycélium et filtrez-le pour le séparer de la PDB. Homogénéiser dans l’azote liquide à l’aide d’un mortier et d’un pilon prérefroidis.
    3. Extrayez l’ADN génomique à l’aide du kit d’isolement de l’ADN génomique des champignons selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
  2. Amplification PCR et séquençage de l’ADN
    1. Préparez le mélange réactionnel PCR comme suit : 25 μL d’ADN polymérase Taq, 1 μL de matrice, 2 μL d’amorces avant et inverse et ddH2O pour un volume total de 50 μL.
    2. Amplifier la région ADNr-ITS de l’échantillon d’ADN à l’aide des paires d’amorces ITS1 et ITS434 (voir Tableau 1) avec la procédure suivante : dénaturation initiale à 95 °C pendant 4 min, suivie de 35 cycles de dénaturation à 94 °C pendant 60 s, recuit à 58 °C pendant 60 s, allongement à 72 °C pendant 2 min, et un allongement final à 72 °C pendant 10 min.
    3. Électrophorèse de produits amplifiés à l’aide d’un gel d’agarose à 1,5 % à 100 V, 100 mA.
    4. Séquencez la PCR.
    5. Alignez la séquence à l’aide de Clustal X2.0 et MEGA 6.0.
      REMARQUE : Lors de l’alignement de séquence, les sites dont l’alignement est ambigu sont exclus et les lacunes sont traitées comme des données manquantes.
    6. Comparez la séquence obtenue avec celles de la base de données de séquences ITS de GenBank à l’aide de BLAST sur le site Web du National Center for Biotechnology Information (NCBI). Identifiez les informations préliminaires sur l’espèce de souche fongique.
  3. Identification morphologique
    1. À l’aide d’un appareil photo, vous pouvez capturer la morphologie de la colonie fongique mature pure à l’avant et à l’arrière des plaques PDA.
    2. Cueillez les conidies des colonies fongiques de culture pure à l’aide d’une aiguille d’inoculation et transférez-les sur une lame de verre avec une goutte d’eau stérile.
    3. Tenez la lamelle et posez-la lentement à un angle de ~45°, de sorte que la lamelle puisse couvrir l’échantillon sans bulles.
    4. Découpez un bloc degélose de 5 mm à l’aide d’un scalpel dans les colonies situées au bord de la colonie fongique et transférez-le sur une lame de verre propre avec une goutte d’eau stérile. Séparez soigneusement les champignons à l’aide d’une aiguille fine pour voir des structures spécifiques.
    5. Répétez l’étape 2.3.3.
    6. Observez la forme asexuée des champignons au microscope optique (MO), y compris la forme, la transparence et la posture des hyphes, des conidiophores, des phialides et des conidies. Enregistrez et mesurez la forme et la taille des caractéristiques asexuées afin de distinguer les différents isolats fongiques les uns des autres.
      REMARQUE : Pour maximiser la capacité d’observer les structures fongiques, utilisez des colorants et un support de montage35.

3. Induction des symptômes de l’infection fongique sur M. alternatus pour observer leurs phénotypes comportementaux

  1. Préparation de la suspension conidique
    1. Préparez 0,01% de Tween-80 avec de l’eau pure et autoclavez-le pendant 25 min à 121 °C. Utiliser après refroidissement.
    2. Ajouter une quantité appropriée de petites billes de verre stériles et une solution de Tween-80 à 0,01 % dans un tube à centrifuger de 2 ml.
    3. Grattez les colonies fongiques dans le tube et secouez-le suffisamment avec un agitateur vortex jusqu’à ce que la colonie soit brisée. Filtrez à travers deux couches de gaze pour enlever le mycélium.
      REMARQUE : On agite pour assurer la suspension du conidiospore dans une solution de Tween-80 à 0,01 %.
    4. Compter le nombre de spores sous la MO à l’aide d’un hémocytomètre, ajuster à 1 ×10 8 conidies/mL avec du Tween-80 stérile à 0,01 %, et maintenir à 4 °C pour l’utilisation.
  2. Préparation des coléoptères
    1. Autoclavez les brindilles de pin (à peu près de la même taille) et faites-les sécher au four (~ 60 °C).
    2. Conserver le M collecté sur le terrain. alternatus adultes avec des rameaux de pin dans un incubateur à 25 ± 1 °C.
    3. Affamez les coléoptères pendant 24 h et stérilisez-les à la surface avec de l’eau de Javel, de l’éthanol et de l’eau distillée [10:10:80 (v :v)] avant de les utiliser.
  3. Induction de l’infection fongique
    1. Travaillez sous un banc propre, plongez les brindilles de pin dans une suspension conidiale pendant 10 s et séchez-les à l’air.
    2. Tremper les coléoptères dans une suspension conidique pendant 10 s, puis transférer dans des tubes stériles de 50 mL (un coléoptère et une brindille par tube). Remplacez les brindilles par des neuves tous les 2 jours.
    3. Pour un contrôle négatif, remplacer la suspension conidique par une solution stérile de Tween-80 à 0,01 %. Faites cinq répétitions pour chaque souche fongique et groupe témoin.
    4. Évaluer l’activité des coléoptères en fonction de la quantité d’excréments produite sur les brindilles de pin. Lorsque l’alimentation cesse, considérez-les comme morts.
    5. Transférez les coléoptères morts dans de nouveaux tubes stériles de 50 ml et placez un morceau de coton humide stérile. Incuber à 25 ± 1 °C.
      REMARQUE : Le coton humide est utilisé pour maintenir l’humidité, car la croissance des champignons nécessite une humidité appropriée, mais pas trop.
    6. Observez et photographiez le changement de surface des coléoptères à la même heure chaque jour.
  4. Réisolement et confirmation des espèces fongiques
    1. Jusqu’à ce que des phénotypes d’infection fongique clairs apparaissent à la surface des coléoptères, prélevez le mycélium de différents tissus individuellement dans de nouvelles plaques PDA.
    2. Cultiver à 25 ± 1 °C et observer pour s’assurer que la morphologie est cohérente avec celle des champignons inoculés.
  5. Traitement du coléoptère modèle
    1. Répéter les étapes 3.2.1 à 3.3.6 sur le scarabée modèle Tribolium castaneum, en utilisant du son de blé comme nourriture, et stériliser le son de blé à l’aide d’une lumière UV.
    2. Touchez légèrement les coléoptères avec une pince à épiler stérile. Supposez qu’ils sont morts s’il n’y a pas de réponse.

4. Confirmer les phénotypes d’infection des champignons sur M. alternatus et le coléoptère modèle

  1. Préparation de l’échantillon pour l’observation
    1. Disséquez le M infecté. Cadavres Alternatus avec soin, comme à l’étape 1.3.
    2. Choisissez T. corps castaneum présentant des symptômes évidents d’infection fongique.
    3. Coupez des bouchons de disque de 5 mm de quatre colonies fongiques matures poussant sur de la PDA.
  2. Prétraitement de l’échantillon
    1. Placez les bouchons, les tissus et les corps de coléoptères infectés dans du glutaraldéhyde à 2,5 % pré-refroidi à 4 °C pendant 2 jours.
    2. Laver les échantillons trois fois dans un tampon phosphate à 0,1 % (pH 7,2-7,4) pendant 5 min et déshydrater dans 30 %, 50 %, 70 %, 80 %, 90 %, 95 %, 100 % d’éthanol pendant 10 min.
    3. Faites sécher les échantillons dans un lyophilisateur sous vide.
      REMARQUE : L’ensemble du processus de prétraitement doit être soigneux, y compris la coupe, le trempage, la déshydratation, le lavage et le séchage, pour éviter d’endommager l’échantillon.
  3. Observation en microscopie électronique à balayage (MEB)
    1. Enduire les échantillons prétraités de platine à l’aide d’une machine à verdir et observer au microscope électroniqueà balayage 36.
    2. Enregistrez les caractéristiques morphologiques des hyphes et des conidies poussant sur PDA, M. tissus alternatus et des corps de coléoptères modèles.
    3. Comparer si les résultats sont cohérents avec ceux de la MO à l’étape 2.3.

5. Évaluation de l’activité entomopathogène

  1. Préparation de la suspension conidique
    1. La préparation de la suspension conidique est la même que dans les étapes 3.1.1 à 3.1.4.
  2. Prétraitement du coléoptère modèle
    1. Cultivez, nourrissez, stérilisez et affamez T. Castaneum comme à l’étape 3.5.1.
    2. Stérilisez le son de blé par UV et placez le même poids sur les boîtes de Pétri stériles.
  3. Test d’activité entomopathogène
    1. Traitez le son de blé avec la suspension conidique et séchez-le à l’air libre sous un banc propre à température ambiante.
    2. Immerger T. castaneum en suspension conidique pendant 10 s et transférez-les dans une boîte de Pétri (n = 20 dans chaque boîte de Pétri). Remplacez le son de blé neuf par le même traitement conidique tous les 4 jours.
    3. Pour un contrôle négatif, appliquer uniquement une solution stérile de Tween-80 à 0,01 %.
      REMARQUE : Réserver au moins trois répétitions pour chaque groupe de traitement et le témoin.
    4. Comptez les coléoptères morts tous les jours.
      REMARQUE : Touchez légèrement les coléoptères avec une pince à épiler stérile. Supposez qu’ils sont morts s’il y a un manque de réponse.
  4. Analyse phylogénétique multigénique
    1. Extraire l’ADN génomique fongique entomopathogène comme décrit à l’étape 2.1.
      REMARQUE : L’identification multigénique est effectuée pour les EPF parasites qui présentent des phénotypes d’infection significatifs et de fortes activités entomopathogènes contre le coléoptère modèle.
    2. Amplifiez les gènes suivants, y compris une région couvrant le gène ribosomique nucléaire SSU34, un segment du gène de l’ARNr de la grande sous-unité (LSU37,38), une partie du gène du facteur d’élongation 1-alpha (tef-1α39), la deuxième plus grande séquence de sous-unité de l’ARN polymérase ІІ (rpb240) et une partie de la β-tubuline41 à l’aide des paires d’amorces NS1/NS4, LR7/LROR, EF-983F/EF-2218R, RPB2-5'F/RPB2-5'R et TUB1/TUB22 (voir le tableau 1), respectivement.
      1. Préparez le mélange réactionnel PCR comme à l’étape 2.2.1.
      2. Effectuer l’amplification comme suit : dénaturation initiale à 95 °C pendant 4 min, suivie de 35 cycles (tef-1α, rpb2, SSU), 38 cycles (LSU) ou 39 cycles (β-tubuline) de dénaturation à 94 °C pendant 60 s, recuit à 47 °C pendant 60 s (LSU), 55 °C pendant 60 s (tef-1α), 54 °C pendant 40 s (β-tubuline) et 50 °C pendant 30 s (rpb2, SSU), un allongement à 72 °C pendant 1 min, et un allongement final à 72 °C pendant 10 min.
    3. Séquencez et alignez en suivant les mêmes étapes que celles indiquées aux étapes 2.2.4 et 2.2.5.
    4. Effectuer l’analyse phylogénétique par MEGA 6.0 sur la base de la méthode du maximum de vraisemblance (ML)42.

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Results

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Isolement et identification d’isolats fongiques de M. Alternatus
À l’aide de pièges attractifs, un grand nombre (environ 500 coléoptères au total) de M. Alternatus ont été collectés dans cinq régions géographiques. Des cadavres de coléoptères présentant des symptômes typiques d’infection par des champignons entomopathogènes ont été cueillis ; Ensuite, les téguments corporels de chaque coléoptère ont été disséqués en plusieurs positions, comme décrit à l’étape 1.3 d...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Différentes populations géographiques de FWB peuvent développer des interactions variées avec les champignons entomopathogènes naturels, en raison de l’adaptation environnementale à long terme des espèces EPF aux facteurs climatiques locaux et de la population génotypique spécifique de l’insecte hôte44,45. L’extension des sites d’échantillonnage à plusieurs régions d’occurrence d’insectes permet d’augmenter la possibilité d’acqué...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette recherche a été soutenue par le Programme national de recherche et de développement clés de la Chine (2021YFC2600100) et la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang (LY21C040001).

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Tubes à centrifuger de 1,5 mL, 2 mLBiosharpBS-15-M
10 & micro ; L pointes de pipetteSangon BiotechF601216
10 & micro ; L, 20 et micro ; L, 100 et micro ; L, 200 et micro ; L, 1 000 et micro ; Pipettes LRainin
1 000 & micro ; Pointes de pipetteL Sangon BiotechF630102
flacons cryogéniques de 2 mLCorning430659
20x tampon PBSSangon BiotechB548117-0500
200 µ ; Embouts de pipette LSangon BiotechF601227
2 000 pbmaker TaKaRarSD0531
Tubes de 50 mLNest602052
solution de glutaraldéhyde à 50 %Sangon BiotechG916054
50x tampon TAESangon BiotechB548101
6x tampon de chargementTaKaRarSD0503
AgaroseSangon BiotechA610013
Éthanol anhydreJkchemicalLB10V37
Biochemistry Cultivation CabinetShanghaiyihengLRH-250F
ChloroformJuhua61553
Pièges à coléoptères commerciauxFEIMENGDIBF-8www.yinyouji.com
Imageur gelBio-RadGelDoc XR+
GlycérolSangon BiotechA600232
Centrifugeuse réfrigérée à grande vitesseSigmaD-37520
Pot de stérilisation à la vapeur à haute pressionMettler ToledoJA5003
Alcool isopropyliqueRéactif généralG75885B
Colorant d’acide nucléiqueSangon BiotechA616696
Microscope optique, OMLeicaDM2000
ParafilmParafilm PM996
PCR meterHeal ForceTrident960
Pénicilline GMarklinGB15743
Gélose dextrose de pomme de terre, PDAOxoidCM0139
Bouillon de dextrose de pomme de terre, PDBSolarbioP9240
AmorcesSangon Biotech/
Amorces TaqTaKaRarRR902A
Kit d’isolement d’ADN génomique Rapid FungiSangon BiotechB518229
Microscope électronique à balayage, MEBHitachiS-3400N
StreptomycineMarklinS6153
TétracyclineMarklinT829835
Tween-80MarklinT6336
Lyophilisateur sous videYamatoDC801
Vortex ShakerHLDWH-861
&beta ;-MercaptoethanolMarklinM6230

References

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