Article de méthode

Un outil permettant de créer automatiquement des espaces acellulaires stables et reproductibles afin d’améliorer la fiabilité du dosage de la cicatrisation cellulaire

DOI :

10.3791/65794

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4 octobre 2024

 ,  ,  , 
1Faculty of Art and Communication, Kunming University of Science and Technology, 2The School of Integrated Chinese and Western Clinical Medicine, Anhui University of Chinese Medicine, 3School of Industrial Design, Hubei University of Technology

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Grâce à l’intégration de la conception de l’expérience d’interaction et de l’analyse des exigences de l’utilisateur, nous introduisons un grattoir cellulaire innovant qui améliore les tests de cicatrisation cellulaire en termes de reproductibilité, de fiabilité, de praticité, d’intégrité cellulaire et d’expérience utilisateur.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fiabilité de la mesure de la migration cellulaire dans les essais de cicatrisation des plaies est souvent minée par l’instabilité méthodologique prévalente, c’est-à-dire la méthode basée sur la pointe. Nous introduisons un instrument innovant conçu pour remédier à ces limites. Notre nouveau racleur cellulaire surpasse l’approche actuelle, générant un espace acellulaire plus cohérent et plus stable. Des expériences biologiques répétées révèlent que l’espace acellulaire produit par le racleur cellulaire présente des bords plus droits et une taille et une forme uniformes par rapport à la technique basée sur la pointe (p < 0,05). En termes de conception de produit, le racleur de cellules présente une palette de couleurs raffinée adaptée aux environnements de laboratoire, améliorant le suivi des résultats expérimentaux, et permet la stérilisation par autoclave pour la réutilisation. Notamment, après le traitement, le racleur cellulaire démontre un effet négligeable sur la viabilité et la prolifération cellulaires (97,31 % et 24,41 %, respectivement). À l’inverse, la méthode basée sur la pointe permet une viabilité cellulaire (91,37 %) et une prolifération (18,79 %) plus faibles. Cette étude présente le grattoir cellulaire comme un nouveau dispositif réutilisable capable de générer des espaces acellulaires reproductibles tout en préservant la viabilité cellulaire, augmentant ainsi la fiabilité des tests de cicatrisation des plaies par rapport aux techniques existantes.

Introduction

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Les tumeurs sont caractérisées par des caractéristiques distinctes telles que des avantages de croissance sélective, un recâblage métabolique et une modulation immunitaire, qui contribuent toutes de manière intrigante à l’amélioration de la migration cellulaire, un comportement malin critique des cellules tumorales. Cette caractéristique affecte directement les métastases à distance de la tumeur primitive, compromettant la survie à long terme des patients 1,2,3. Les avantages de la croissance sélective permettent aux cellules cancéreuses de surpasser les cellules normales, tandis que le recâblage métabolique favorise cette prolifération rapide en modifiant les voies énergétiques. Parallèlement, la modulation immunitaire permet aux tumeurs d’échapper aux défenses de l’organisme. Des études soulignent la gravité de ce problème, montrant que les métastases pulmonaires, souvent le résultat d’une migration cellulaire accrue, sont un événement terminal conduisant à la mort de patients atteints de divers cancers4. Par exemple, les cancers du sein5, le carcinome du col de l’utérus4 et l’ostéosarcome6 représentent respectivement 20 %, 9 % et 30 % de ces cas. Par conséquent, l’évaluation de la migration des cellules tumorales est devenue partie intégrante de la recherche actuelle en oncologie, mettant en évidence la nature multidimensionnelle de la progression tumorale.

Le test de cicatrisation des plaies cellulaires est une méthode facile à utiliser pour mesurer la migration cellulaire in vitro , souvent utilisée dans les études oncologiques7. La plupart des expérimentateurs utilisent des pointes de pipette pour créer manuellement des plaies cellulaires8. Bien qu’une telle méthode puisse former des plaies cellulaires rapidement et facilement, elle présente encore de nombreuses limites qui affectent la reproductibilité et la précision de l’évaluation de la migration cellulaire. Tout d’abord, l’utilisation manuelle des pointes de pipette pour créer des rayures est fortement influencée par l’angle de travail, la force et la vitesse de l’opérateur, ce qui affecte la répétabilité de la méthode8. Deuxièmement, les défauts cellulaires générés par les pointes ont généralement des bords dentelés plutôt que des bords droits, car les pointes de pipette sont des produits en plastique avec une certaine élasticité9. Certaines études génèrent des plaies en plaçant des inserts de culture préfabriqués directement dans la plaque de culture cellulaire pour restreindre la plage de prolifération cellulaire10. Cette approche contourne les limites de la méthode basée sur les pointes, telles que les bords dentelés et la reproductibilité. Cependant, même avec des matériaux biocompatibles, la coexistence à long terme de l’intégration avec les cellules a toujours un impact sur la croissance cellulaire11. De plus, l’encastrement peut également provoquer des changements épigénétiques cellulaires dans la zone marginale en raison de la restriction de contact12. De plus, les inserts de contact produits à partir de matériaux biocompatibles sont coûteux et difficiles à réutiliser, ce qui limite leur faisabilité13. Par conséquent, un outil nouveau, reproductible et pratique est nécessaire pour quantifier facilement la migration cellulaire in vitro .

L’objectif principal de cette méthode est d’introduire un outil innovant pour quantifier la migration cellulaire in vitro dans les études oncologiques, en remédiant aux limites des techniques existantes et en améliorant la reproductibilité et la précision de l’évaluation de la migration cellulaire.

La raison d’être du développement de cette technique réside dans l’importance cruciale de l’évaluation de la migration des cellules tumorales en oncologie. Les tumeurs présentent des caractéristiques distinctives, notamment des avantages de croissance sélective, de recâblage métabolique et de modulation immunitaire, contribuant toutes à améliorer la migration cellulaire, un aspect fondamental de la malignité du cancer. Cette méthode vise à fournir un moyen plus fiable d’étudier la migration cellulaire, contribuant ainsi à une compréhension plus profonde du comportement tumoral.

Cette méthode offre des avantages substantiels par rapport aux techniques existantes. Les tests manuels peuvent souffrir d’interférences dépendantes de l’opérateur, tandis que les inserts de culture peuvent avoir un impact sur la croissance cellulaire et l’expression des gènes. En revanche, cette méthode offre une répétabilité, une précision et une praticité améliorées, ce qui représente une solution rentable pour mesurer la migration cellulaire in vitro dans la recherche en oncologie. Il répond à un besoin crucial d’un outil fiable et accessible pour étudier la migration cellulaire dans divers types de cancer, ce qui en fait un ajout précieux au domaine.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les participants ont donné leur consentement éclairé par écrit. L’approbation éthique ne s’appliquait pas puisqu’aucun échantillon de tissu animal ou humain n’a été inclus dans la présente étude.

1. Étudier les besoins de la communauté d’utilisateurs

  1. Remettre des questionnaires aux biologistes ou aux expérimentateurs qui travaillent sur des essais de cicatrisation cellulaire. Rassemblez les questionnaires remplis et utilisez-les pour l’étude. Pour cette étude, du 12 octobre 2021 au 3 février 2022, 100 questionnaires ont été remis à 100 biologistes. Le pourcentage de réponse était de 97 %.
  2. Demandez aux répondants de répondre à des questions telles que : laquelle des expériences de grattage cellulaire vous a le plus dérangé ? Et quel outil a été utilisé pour effectuer le grattage cellulaire ? Faites suivre ces questions de sous-questions pour en identifier les causes.
  3. Étudiez les perceptions des expérimentateurs à l’égard d’outils tels que les pointes de pipette et les inserts de culture cellulaire dans les expériences de cicatrisation des plaies cellulaires. Comprendre et rassembler les raisons pour lesquelles ils choisissent un outil plutôt qu’un autre, en utilisant la théorie de la chaîne finale des moyens basée sur les techniques d’échelonnement dans les sections14 et 15 des questionnaires.
    REMARQUE : La méthode de l’échelle est divisée en deux types : la méthode de l’échelle douce avec des entretiens approfondis et la méthode de l’échelle dure avec des questionnaires ou des quiz papier-crayon16. La méthode de l’échelle dure a été la principale technique utilisée dans cette étude. La théorie de la chaîne finale des moyens suggère que les connaissances explicites détenues par les utilisateurs cibles sont superficielles et concrètes, tandis que les connaissances tacites sont profondes et abstraites 17,18,19.

2. Conception et modélisation tridimensionnelle

  1. Dessinez un croquis à partir des informations recueillies lors de l’enquête par questionnaire précédente et lancez le processus de conception. Utilisez cette esquisse préliminaire comme plan de base.
    1. Élaborez les dimensions et la disposition de chaque composant en appliquant les fonctions Dim, DimRadius et DimDiameter dans le logiciel de modélisation.
    2. Effectuez des mesures avec le pied à coulisse avec une précision de 0,02 mm sur des plaques réelles à 6 puits pour déterminer les dimensions finales du racleur de cellule. Vérifiez qu’ils mesurent 42,1 mm de longueur, 42,1 mm de largeur et 18,5 mm de hauteur. Faites attention aux détails dans la phase de conception, en particulier la hauteur du produit et l’aptitude du puits, pour faciliter un assemblage plus fluide.
  2. Construisez un modèle tridimensionnel et rendez-le.
    1. Commencez la conception 3D dans un logiciel en créant un modèle de base. Cliquez sur des boutons tels que ExtrudeCrv pour l’étirement et Loft pour façonner le design. Affinez le modèle, puis cliquez sur FiletEdge pour lisser les bords.
      REMARQUE : Les autres boutons de fonction utilisés incluent, Lignes - Pour dessiner des segments de lignes droites, Polylignes - Pour créer des lignes continues composées de plusieurs segments, Rectangles - Pour dessiner des formes rectangulaires, Cercles - Pour dessiner des formes circulaires, Arcs - Pour dessiner des formes arcs ou elliptiques, Points - Pour placer des marqueurs de point unique, Texte - Pour ajouter des étiquettes de texte, Dimensions - Pour ajouter des dimensions mesurées aux modèles, Réseau - Pour créer des motifs copiés d’objets, Rotation - Pour faire pivoter les objets aux angles souhaités, Déplacer - Pour déplacer des objets vers de nouveaux emplacements, Échelle - Pour redimensionner des objets plus grands ou plus petits, Trim/Extend - Pour ajuster ou étendre des objets pour les adapter à d’autres géométries, Unité booléenne/Différence/Intersection - Pour combiner, soustraire ou trouver l’intersection d’objets, Calques - Pour organiser les objets sur différents calques, Rendu : pour générer des vues rendues avec des matériaux et un éclairage et Exporter : pour exporter la géométrie du modèle vers d’autres formats de fichier.
    2. Importez le modèle dans un logiciel de rendu 3D. Appliquez des matériaux tels que du plastique, de l’éponge et de l’acier, puis ajustez l’éclairage pour un rendu réaliste.
      REMARQUE : Une liste généralisée de boutons de fonction inclut, Glisser-déposer - Pour appliquer des matériaux directement à des pièces ou à des modèles en faisant glisser un matériau de la bibliothèque et en le déposant sur le composant souhaité dans la vue en temps réel, Clic droit - Lorsque vous cliquez avec le bouton droit sur un matériau dans la bibliothèque, vous verrez généralement les options suivantes : Appliquer à la sélection - Appliquer le matériau à une pièce sélectionnée dans la vue en temps réel. Modifier le matériau - Ajustez les propriétés du matériau. Propriétés du matériau (après avoir sélectionné un matériau) : pour accéder et modifier des propriétés spécifiques du matériau, telles que la couleur, la rugosité, l’indice de réfraction et d’autres attributs. Barre de recherche - Pour trouver rapidement un matériau dans la bibliothèque en tapant son nom ou les mots-clés associés. Catégories/Dossiers - Pour naviguer dans différentes catégories ou dossiers de matériaux tels que les métaux, les plastiques, le verre, etc. Ajouter aux favoris - Pour marquer certains matériaux comme favoris pour un accès facile lors des sessions futures. Raccourcis clavier : certaines opérations sont accessibles via des raccourcis clavier. Par exemple, M est généralement le raccourci clavier permettant d’afficher rapidement les propriétés du matériau d’une pièce sélectionnée.
    3. Enfin, améliorez le contraste (+56) et la saturation de l’image (Vibrance +19, Saturation +7) dans les logiciels de photo et de conception, et ajoutez des éléments d’arrière-plan (informations textuelles et couleur du blanc au dégradé gris clair) pour le contexte afin de garantir une représentation réaliste et de haute qualité du produit.
      1. Utilisez les réglages de > d’image, la luminosité/le contraste pour ajuster le contraste d’une image. Utilisez Image > Teinte/Saturation pour modifier le niveau de saturation de l’image. Utilisez l’outil Texte (icône T) pour ajouter des informations de texte à l’image.
        REMARQUE : Une liste généralisée de boutons de fonction comprend Outil Ellipse (U) - Pour dessiner des points/cercles. Configurez l’outil pour dessiner une forme, choisissez la couleur de remplissage souhaitée, puis cliquez et faites glisser (en maintenant la touche Maj enfoncée pour conserver un cercle parfait) pour créer un point. Outil Ligne (U) - Pour tracer des lignes droites sur l’image. Sélectionnez l’outil, définissez la largeur de ligne souhaitée, puis cliquez et faites glisser pour tracer une ligne. Outil Pinceau (B) - Une autre façon de dessiner des points et des lignes. Sélectionnez la taille et la forme du pinceau, puis cliquez (pour les points) ou cliquez et faites glisser (pour les lignes).
  3. Après avoir terminé le modèle tridimensionnel, procédez à la production du racleur à cellules via la méthode de meulage et d’assemblage 20,21,22.

3. La production

  1. Utiliser la théorie de la couleur, des matériaux et de la finition (CMF) dans l’étude actuelle pour concevoir les prototypes du racleur de cellules. La théorie CMF sert de méthodologie de conception dans la recherche scientifique. Il améliore la convivialité du produit, façonne la perception de l’utilisateur et oriente la sélection des matériaux 23,24,25.
    1. Sélectionnez les couleurs à utiliser dans le grattoir de cellules à partir du système de couleurs standard, notamment Noir 6 C, Gris froid 6 C et 11-0601TPG26,27.
    2. Pour construire le racleur de cellules qui répond aux normes de laboratoire, choisissez des matériaux appropriés, notamment du polypropylène (PP), de l’éponge et de l’acier à haute teneur en carbone. Pour la fabrication de prototypes physiques, commencez par l’utilisation d’une imprimante 3D pour produire la charpente structurelle. Par la suite, utilisez des connecteurs ou des agents adhésifs pour terminer l’assemblage du grattoir.
      REMARQUE : Pour préparer le produit physique du racleur à cellules, broyez et assemblez les matériaux nécessaires. Des protocoles de sécurité doivent être suivis tout au long du processus pour garantir un produit final sûr et efficace.
    3. Passez au processus de finition, qui peut impliquer la découpe, le meulage, le polissage, l’estampage ou d’autres techniques. Commencez par poncer le modèle à l’aide d’un papier de verre de grain moyen de 120 pour éliminer les bords rugueux.
    4. Poursuivez avec un papier de verre à grain fin de grain 220 pour obtenir une surface lisse.
    5. Post-ponçage pour lisser les surfaces, en s’assurant que les connecteurs enfichables ou intégrés sont correctement assortis.
    6. Assemblez solidement les glissières I et II à l’aide des connecteurs (tiges fixes) pour assurer un assemblage robuste et durable du racleur de cellules. Obtenez la forme fixe finale du racleur à cellules grâce à une combinaison de fixation mécanique et de collage. Utilisez des attaches, en particulier une structure à tenon et mortaise, pour fixer les pièces ensemble par la force mécanique. De plus, pour améliorer la résistance de l’assemblage, appliquez de l’adhésif (colle) pour coller davantage les composants.
    7. Autoclavez le grattoir à 121,3 °C pendant 30 min pour vous assurer qu’il conserve sa forme et ses propriétés physiques d’origine.

4. Culture cellulaire

  1. Cultiver des cellules HOS dans un milieu essentiel minimum complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine. Cultivez-les à 37 °C avec 5% de CO2.
  2. Changez le milieu de culture tous les 2 jours.
  3. Lorsque la croissance cellulaire dépasse 80 % de confluence, ajouter 1 mL de trypsine avec 0,25 % d’EDTA et digérer pendant 60 s. Ensuite, centrifugez les cellules à 300 x g pendant 5 min pour la sous-culture. Retirer le surnageant et ajouter le milieu de culture pour obtenir une concentration finale de 5 x 104 cellules par puits. Utilisez un compteur de cellules automatisé pour compter les cellules.

5. Évaluation du potentiel de blessure cellulaire du grattoir cellulaire et de la méthode basée sur des pointes

  1. Préparez tous les matériaux pour les blessures et stérilisez-les avec des rayons ultraviolets en les exposant pendant 30 min.
  2. Après la stérilisation, enrouler 100 % de cellules HOS confluentes dans des plaques à 6 puits à une concentration de 5 x 104 cellules par puits en utilisant la méthode du grattoir cellulaire ou la méthode à pointes.
    1. Pour la méthode basée sur la pointe, utilisez une pointe de 100 μL et faites-la glisser sur la cellule contenant le fluide avec 1 trait dans le sens horizontal et l’autre dans le sens vertical.
    2. Pour la méthode du grattoir cellulaire, placez le prototype de grattoir dans l’un des puits et, à l’aide de la pince à épiler, appuyez doucement une fois. Les cellules sont blessées. Réaliser chaque expérience de blessure en trois exemplaires.
  3. Analysez toutes les plaies cellulaires à l’aide d’un système de microscope numérique et d’un logiciel d’imagerie.

6. Mesure de la viabilité et de la prolifération cellulaires

  1. Effectuer tous les tests de viabilité cellulaire en suivant le protocole fourni dans le kit CCK-8.
  2. Incuber les cellules avec une solution de CCK-8 pendant 2 h à 37 °C, puis mesurer leur absorbance à 450 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques pour quantifier la viabilité cellulaire.
  3. Concevoir le test d’incorporation de la 5-éthynyl-20-désoxyuridine (EdU) pour quantifier avec précision la duplication de l’ADN et quantifier directement le taux de prolifération cellulaire. Déterminer l’influence de différentes méthodes pour générer des blessures cellulaires sur la prolifération cellulaire à l’aide du test EdU, en suivant le protocole décrit dans la publication précédente28.
  4. Colorez les cellules et imagez-les à l’aide d’un système de microscope numérique. S’assurer que chaque expérience est réalisée en trois exemplaires.

Résultats

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Dissection des demandes des utilisateurs en matière d’outils pour générer des plaies cellulaires
La méthode expérimentale actuelle de génération de plaies cellulaires nécessite d’être encore améliorée pour résoudre de nombreux problèmes qui compromettent la reproductibilité biologique, la robustesse, la consommation économique et l’expérience utilisateur du test de cicatrisation des plaies cellulaires. Nous avons utilisé la méthode de l’échelle dure pour analyser les besoins des utilisateurs impliqués dans des expériences biologiques via des questionnaires29 (Figure 1A). Les renseignements contenus dans le questionnaire, tels que les noms, ont été anonymisés afin de protéger leur vie privée. Le détail du questionnaire est présenté dans le tableau 1. Au cours des 6 semaines d’enquête auprès de 100 individus, 97 questionnaires entièrement remplis ont été reçus, 3 questionnaires suspects et invalides ont été exclus ; Le taux de réponse a été de 97,00%.

Les résultats démontrent que les problèmes les plus troublants dans les tests de cicatrisation des plaies cellulaires étaient le bord dentelé (non droit) et la largeur ou les zones instables des plaies, représentant respectivement 55,67 % et 29,90 %. Celles-ci étaient significativement plus élevées que celles du taux de croissance cellulaire plus faible, de la contamination cellulaire et d’autres options avec 3,09 %, 5,15 % et 6,19 %, respectivement (p < 0,001, figure 1B). En ce qui concerne le choix des outils pour créer des plaies, l’utilisation de pointes de pipette était beaucoup plus répandue que celle d’inserts de culture cellulaire (Figure 1C). Cela a été principalement attribué au fait que les inserts de culture cellulaire sont plutôt coûteux et non réutilisables (Figure 1D), tandis que les pointes de pipette sont bon marché, présentent une reproductibilité expérimentale (6,59 %) et une viabilité cellulaire (20,88 %, Figure 1E). Il est important de noter que jusqu’à 69,23 % des utilisateurs ont fait valoir que le prix des inserts de culture cellulaire dépassait leur budget (figure 1D). En revanche, seuls 6 sujets ont choisi des inserts de culture cellulaire, dans lesquels seulement 16,67 % ont jugé que leur prix était acceptable (Figure 1F). Enfin, en ce qui concerne l’outil innovant de génération de plaies cellulaires, 86,60 % d’entre eux étaient optimistes, tandis que seuls les utilisateurs étaient moins réticents (4,12 %, figure 1G).

Par la suite, les caractéristiques du produit dont les utilisateurs avaient un besoin urgent ont été disséquées 30,31,32. Ces caractéristiques comprenaient des plaies droites, une largeur et une surface de plaies stables, une reproductibilité élevée et un prix acceptable. En conséquence, des activités de conception ultérieures ont été réalisées.

Décision de concevoir les éléments et les matériaux utilisés dans le développement du racleur cellulaire
Les données ci-dessus montrent que les fournitures de laboratoire mises en œuvre dans la recherche biologique de routine doivent être strictement stériles pour éviter la contamination cellulaire33. Par conséquent, le grattoir cellulaire proposé doit être stérile. Bien que les outils jetables puissent être stérilisés à l’oxyde d’éthylène, le coût expérimental augmentera inévitablement 34,35,36. Par conséquent, au lieu de matériaux jetables, nous proposons de concevoir le racleur cellulaire avec un matériau réutilisable avec une grande tolérance à la stérilisation à la vapeur à haute pression (121,3 °C), afin de réduire le coût et d’augmenter la flexibilité lorsqu’il est appliqué dans différents cas37. Pour répondre à ces exigences, le matériau utilisé pour construire le racleur à cellules doit présenter certaines caractéristiques physiques et chimiques, notamment la résistance à la chaleur, à la haute pression et à la corrosion par vapeur d’eau.

Pour l’utilisation prévue du grattoir à cellules, en plus de répondre aux fonctions de base telles que la réalisation de plaies droites, il doit également avoir un design et une couleur attrayants. En termes de modélisation, compte tenu des domaines ciblés et d’application, le style général devrait être sympathique pour les laboratoires. L’apparence ne doit pas être trop ostentatoire pour empêcher le personnel d’observer la progression expérimentale. De plus, sa taille doit convenir aux plaques à six puits et la surface doit avoir une saillie pour que la pince à épiler puisse la ramasser de manière stable.

Le CMF dans le design est un aspect essentiel de la conception du produit, influençant l’esthétique et l’expérience utilisateur. Le choix des couleurs a un impact sur la réponse émotionnelle, le choix des matériaux affecte la fonctionnalité et la durabilité, et la finition détermine la sensation tactile et l’attrait visuel. Les designers de CMF harmonisent ces éléments, en tenant compte des tendances du marché et de l’identité de marque, pour créer des produits qui résonnent avec les utilisateurs.

Selon la théorie CMF, trois facteurs critiques, notamment la couleur, le matériau et le processus de finition, ont été pris en compte pour déterminer leurs impacts sur la fonction et l’effet visuel24. La sélection des couleurs a été effectuée en premier. Dans ce contexte, la couleur fait référence à la couleur intrinsèque, qui est la couleur inhérente d’un objet ou d’une substance dans des conditions d’éclairage standard, dépourvues de l’influence de sources lumineuses externes ou de reflets. Étant donné que la plaque à six puits est en PP avec une surface transparente, le gris foncé a été choisi comme couleur intrinsèque. Ce choix a été fait pour faciliter l’identification et l’utilisation, car le gris foncé offre un contraste et une visibilité optimaux lorsqu’il est superposé à d’autres couleurs. En outre, le gris foncé est moins susceptible de provoquer une distorsion des couleurs lorsqu’il est combiné avec d’autres couleurs, ce qui est également crucial pour l’observation. Les composants fonctionnels essentiels étaient également distingués par le noir (figure 2A).

Le système commercial de correspondance des couleurs a été sélectionné comme norme pour la sélection des couleurs en raison de son acceptation et de son utilisation généralisées dans diverses industries. S’appuyant sur la capacité de l’entreprise à reproduire des couleurs cohérentes sur différents supports, il a été choisi pour l’étude car cela est crucial pour garantir une représentation précise et cohérente des couleurs.

La sélection du matériel a été effectuée sur la base des résultats susmentionnés des questionnaires. La coque et les composants du grattoir ont été fabriqués à partir d’un plastique résistant à la chaleur, le polypropylène (PP), pour répondre à l’exigence de stérilisation par autoclavage, comme le montre l’exemple de la figure 2B. L’acier à haute teneur en carbone convient aux ressorts, car il est stable dans des environnements de laboratoire résistants à la corrosion et à haute et basse température. Des éponges à haute densité ont été utilisées pour la tampon et placées à l’extrémité de la lame.

Enfin, le processus de finition a été développé. Comme le grattoir cellulaire est fréquemment utilisé et facilement contaminé et que la qualité de la surface affecte la stérilisation, une surface lisse et brillante est préférable pour le grattoir cellulaire car elle aide l’utilisateur à identifier rapidement la source de contamination et à la traiter, donnant ainsi une sensation de propreté. Les pointes sont partiellement poncées pour éviter d’endommager le fond de la boîte de culture, ce qui peut affecter l’environnement de culture et entraîner une restriction de la prolifération cellulaire38.

Conception et prototype du racleur de cellules
Trois prototypes de racleur cellulaire ont été conçus sur la base des résultats mentionnés ci-dessus (Figure 3A). Des études montrent que les plaies cellulaires les plus couramment utilisées dans les plaques de culture cellulaire étaient en forme de croix39, ce qui est très différent du prototype I qui utilisait des plaies rectangulaires ; le prototype I avait donc été abandonné (Figure 3A). Bien que les prototypes II et III puissent tous deux créer des zones exemptes de cellules en forme de croix, le rail coulissant du prototype II était difficile à fixer dans les disques de culture cellulaire et son infrastructure était plutôt compliquée (Figure 3A). Après de longues discussions, le prototype III a été distingué comme le modèle final pour produire un racleur de cellules.

Notamment, étant donné que la forme des pointes pouvait affecter directement la zone sans cellules en termes de bords et de tailles, trois croquis ont été conçus pour la sélection. L’esquisse que j’avais avait une partie pointue, qui pouvait fournir des bords très droits ; cependant, l’interface de culture permettant la prolifération cellulaire peut être altérée si les pointes sont trop pointues (Figure 3B). Sketch II offrait un sommet carré, ce qui pourrait éviter de détériorer les plaques de culture cellulaire. Cependant, comme la surface de contact entre l’extrémité et le fond de la plaque de culture est carrée, elle est instable lors de son utilisation (Figure 3B). Le croquis III a fourni une pointe arrondie émoussée, évitant ainsi les problèmes ci-dessus (figure 3C). Par conséquent, il a été sélectionné comme design final.

La conception a été optimisée sur trois aspects : la méthode de fixation du fixateur, l’éponge de coussin intégrée et la facilité de préhension, respectivement. Tout d’abord, les méthodes de fixation attendues du produit comprenaient le flambage40, le tenon mortaise41 et le pivotement42. Compte tenu du coût de production réel et de l’opérabilité, une griffe a été conçue sous le fixateur en forme de croix pour faciliter le serrage du bord du puits. De plus, dans le test de cicatrisation des rayures cellulaires, nous avons observé que les pointes rebondissaient après avoir touché la paroi près de la fin en raison de la longueur et de la dureté fixes des lames, ce qui affectait l’état de rayure. Par conséquent, nous avons ajouté une éponge d’amortissement à l’extrémité de la glissière pour stabiliser le mouvement des pointes. (Figure 3A,C). Enfin, une dépression de surface a été ajoutée à la saillie pour faciliter la prise de la pince à épiler.

Un modèle tridimensionnel a ensuite été construit à l’aide du logiciel de conception 3D. Son rendu est illustré à la figure 4A. Le graphique explosif élabore les structures internes détaillées du racleur de cellules, ce qui montre ses caractéristiques nécessaires discutées ci-dessus (Figure 4B). De plus, pour atteindre l’objectif d’un glissement en douceur des pointes et des carres droites, la structure interne de transmission mécanique de la puissance est adoptée. L’ensemble de l’unité fonctionnelle du racleur de cellules est composé de la partie de commande. Dans le travail réel, le levier de liaison à l’intérieur du racleur de cellule est relié au bouton supérieur, et l’extrémité se déplace vers le bas après avoir appliqué une pression pour faire plier l’extrémité. Le ressort à l’intérieur de la glissière est relâché pour pousser les pointes à se déplacer. Enfin, il s’arrête au niveau de l’éponge avec une fente étroite pour terminer le grattage, puis bascule pour se réinitialiser lorsqu’il est utilisé à nouveau (Figure 5A). De plus, la facilité d’apprentissage et la facilité d’utilisation sont les critères d’un biologiste pour mesurer la qualité d’un produit. Par conséquent, pour la conception de l’apparence du produit, la disposition de la surface a suivi le principe de symétrie et de netteté43,44, distinguant et mettant en valeur les différents composants à travers différentes nuances de couleurs noires, blanches et grises (Figure 5A).

Le grattoir cellulaire est supérieur à la méthode de grattage des pointes dans la pratique
Le produit physique du racleur à cellules a été préparé à l’aide de la méthode de broyage et d’assemblage (figure 5B). Comme prévu, le racleur de cellules s’intégrait parfaitement à la plaque à six puits, le support supérieur en forme de croix s’adaptant étroitement au bord de la plaque, assurant une fixation solide (Figure 5C). De plus, les pointes s’adaptaient précisément au fond de la plaque à six puits, ce qui facilitait la génération en douceur de zones sans cellules. Enfin, le racleur cellulaire a été autoclavé pour tester s’il pouvait être réutilisable. Comme le montrent les résultats de la figure 5D, le racleur à cellules actuel a conservé sa forme et ses performances physiques d’origine même après un autoclave sous 121,3 °C pendant 30 min.

Le racleur cellulaire a surpassé la méthode existante de création de plaies cellulaires dans le test de référence. Après des tests répétés, le grattoir cellulaire a montré une stabilité et une reproductibilité élevées dans la préparation de la plaie, a présenté une faible fluctuation de la surface de chaque plaie et des bords presque droits, avec un écart-type de la surface libre de cellules de 483,73 et un écart par rapport au bord droit de 5041,33 ± 2420,00. En revanche, la zone de chaque plaie préparée par les pointes de pipette a montré une fluctuation plus élevée, avec un écart-type de la surface libre de 3905,80 et un écart par rapport au bord droit de 19562,33 ± 1068,39 (figure 6A-C).

Enfin, l’effet sur la viabilité cellulaire après les plaies cellulaires a été évalué (Figure 6D). Les résultats ont démontré que 12 h après la fin de l’enroulement cellulaire, la viabilité cellulaire était légèrement mais significativement plus élevée dans le groupe des racleurs cellulaires que dans le groupe des pointes. Un test EdU a été réalisé pour confirmer davantage ces résultats et clarifier l’impact des différentes méthodes de préparation des plaies cellulaires sur la prolifération cellulaire, c’est-à-dire la réplication de l’ADN. Les résultats de l’essai EdU ont montré que le pourcentage de cellules proliférantes dans le groupe racleur cellulaire (24,41 % ± 0,48) était significativement plus élevé que celui de la méthode des pointes (18,79 % ± 1,46) après 12 h (Figure 6E,F).

Ces données ont fortement attesté que le générateur de plaies cellulaires actuel surpassait la méthode actuelle pour créer des plaies cellulaires en termes de stabilité et de reproductibilité biologique. Il a eu un faible impact sur la viabilité et la prolifération cellulaires. Tous ces avantages remarquables du générateur de bobine cellulaire ont confirmé son potentiel à améliorer les dosages actuels de bobinage cellulaire en assurant la fiabilité et la répétabilité des données résultantes.

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Figure 1 : Analyses des demandes de l’utilisateur. (A) Le diagramme de Sankey présente le flux de travail de l’investigation basée sur des questionnaires pour les expérimentateurs. (B) à (G) présenter les résultats des questionnaires, y compris les questions 1 à 6. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Conception du produit avec les couleurs et les matériaux utilisés. (A) Sélection des couleurs. (B) Autoclave utilisé dans les expériences biologiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Conception de structures détaillées. (A) Trois prototypes candidats de racleur de cellules. (B) Trois croquis de conception de la pointe. (C) Dessin en trois vues du prototype III sélectionné présentant sa conception globale et les paramètres physiques et spatiaux. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Rendu du modèle tridimensionnel et affichage des structures internes. (A) Rendu du modèle tridimensionnel. (B) Tracé explosif démontrant les structures internes du racleur de cellules proposé. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Mécanismes de fonctionnement du grattoir cellulaire. (A) Les croquis montrent comment fonctionne le grattoir cellulaire. (B) Produit physique du racleur de cellules. (C) Le racleur de cellule s’insère dans une plaque à 6 puits. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Validation expérimentale d’un racleur cellulaire. (A) Les plaies cellulaires générées par différentes méthodes et leurs résultats de comparaison groupés ont été présentés en (B) et (C), la barre d’échelle est de 100 μm. (D) Résultats de viabilité cellulaire. (E) et (F) Résultats du test Edu, la barre d’échelle est de 50 μm. Pour l’évaluation statistique, un test t a été effectué pour une comparaison groupée, et la valeur p originale a été ajustée par le test de Holm-Bonferroni pour éviter les résultats faussement positifs. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

I) Lequel des énoncés suivants est le problème le plus troublant pour vous dans l’expérience de grattage cellulaire ?
A) Pas de bords droits
B) Largeur instable
C) Prolifération lente
D) Contamination cellulaire
E) Autres
II) Quels outils utilisez-vous pour générer des plaies cellulaires
A) Pointes de pipette (passer à la question III)
B) Inserts de culture cellulaire (passer aux questions IV-V)
III) Pourquoi ne choisissez-vous pas des inserts de culture cellulaire ?
A) Viabilité cellulaire
B) Non réutilisable
C) Coût
D) Autres
IV) Pourquoi avez-vous choisi les inserts de culture cellulaire ?
A) Coût
B) Répétabilité
C) Autres
V) Selon vous, quels sont les problèmes les plus graves liés aux inserts de culture cellulaire ?
A) État de la cellule
B) Non réutilisable
C) Coûteux
D) Autres
E) Satisfait
VI) S’il existait un outil de grattage bon marché, réutilisable (autoclavable) et hautement reproductible, dans quelle mesure seriez-vous prêt à l’acheter et à l’utiliser ?
A) Très disposé
B) Volontaire
C) Pas sûr
D) Réticent

Tableau 1 : Le questionnaire utilisé dans cette étude comprend six questions destinées à comprendre les situations rencontrées par les biologistes lors des tests de cicatrisation des plaies cellulaires.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La présente étude visait à développer un outil mécanisé automatique pour le dosage de la cicatrisation des plaies cellulaires. À notre connaissance, il s’agit de la première tentative d’application d’une structure motorisée pour créer automatiquement des plaies cellulaires en un clic. Grâce à cela, nous visons à remédier aux lacunes de la méthode traditionnelle basée sur les pointes, telles que la faible reproductibilité et l’état de rayure instable. Bénéficiant des résultats positifs et des retours encourageants de la communauté des utilisateurs, le racleur cellulaire devrait fournir aux expérimentateurs une alternative efficace et stable pour créer des plaies cellulaires, améliorant ainsi considérablement le niveau de confiance des résultats de l’analyse expérimentale.

Pour l’utilisation du grattoir de cellules actuel, l’utilisateur doit 1) préparer les cellules en attente pour créer un espace libre similaire aux méthodes traditionnelles telles que la méthode basée sur la pointe, c’est-à-dire l’ensemencement des cellules sur une plaque à six puits à une densité donnée ; 2) attendre que le taux de convergence cellulaire atteigne > 90 % ; 3) placez le grattoir à cellules stériles dans un puits de plaque, cliquez sur le bouton comme illustré à la figure 5, et l’espace sans cellules sera automatiquement créé en 1 à 2 s.

Le test de cicatrisation des plaies cellulaires a été largement utilisé pour mesurer la capacité de migration cellulaire. En règle générale, les expérimentateurs utilisent des pointes de pipette pour créer des plaies cellulaires. Par exemple, Tariq et al. ont utilisé une pointe de pipette pour créer des plaies cellulaires afin d’évaluer la capacité de migration cellulaire45 ; ce n’est pas une coïncidence si Rahimi et al. ont utilisé une pointe de pipette dans un essai pour observer la capacité migratoire des cellules PC346 ; dans l’essai de migration cellulaire mésenchymateuse chez la souris, Cormier et al. ont également utilisé un pistolet à pipette47 ; pour démontrer l’effet de l’arsenic sur la migration des cellules cutanées, Pinto et al. ont utilisé une pointe de pipette pour le grattage vertical48, entre autres.

Cependant, comme mentionné précédemment, l’utilisation d’une pointe pour créer des plaies cellulaires présente plusieurs problèmes, tels qu’une surface acellulaire variable, des bords déchiquetés et une dépendance à la force et à l’angle de rayure de l’opérateur, ce qui entraîne une faible reproductibilité49. Les résultats actuels des questionnaires ont également prouvé que la méthode basée sur les pointes présente des avantages plus apparents par rapport aux inserts de culture cellulaire, notamment en termes de prix, de taux de survie cellulaire et de réutilisation de l’outil. Alternativement, les inserts de cellules sont trop coûteux et sont difficiles à réutiliser, alors que l’un ou l’autre outil présente des défauts. Par conséquent, la communauté des utilisateurs est généralement optimiste et disposée à essayer des outils innovants. Cette étude a conçu et développé un nouvel outil de préparation de zone acellulaire pour faciliter et stabiliser la création de plaies cellulaires.

La contribution la plus importante de la présente étude réside dans le développement et la validation expérimentale du grattoir cellulaire. Par rapport aux études précédentes, les améliorations du grattoir cellulaire actuel comprennent les trois points principaux suivants. 1) Fabrication stable et pratique des plaies cellulaires. Cette étude a montré que, par rapport à la méthode traditionnelle basée sur les pointes, les plaies cellulaires fabriquées par le grattoir cellulaire actuel avaient des bords droits et pouvaient créer des plaies similaires lors d’expériences répétées, ce qui améliorait considérablement la reproductibilité et la fiabilité des expériences de cicatrisation des plaies cellulaires. 2) Le grattoir cellulaire actuel a eu moins d’effet sur l’état de la cellule. Il n’a pas affecté la viabilité et la prolifération cellulaires (amplification de l’ADN), ce qui était nettement meilleur que la méthode basée sur les pointes. Par conséquent, ce racleur cellulaire devrait réduire davantage l’influence des facteurs externes sur le test de cicatrisation des plaies cellulaires dans les expériences de routine. 3) Ce racleur de cellules est en bon accord avec les demandes de la communauté des utilisateurs. Les résultats de l’enquête précédente par questionnaire ont montré que les exigences des utilisateurs pour le nouvel outil de plaies cellulaires comprennent principalement une largeur de course uniforme, une reproductibilité élevée, une procédure d’utilisation simple et un prix modéré, qui ont été obtenus dans le grattoir cellulaire actuel. De plus, le grattoir à cellules est conçu dans des couleurs neutres pour transmettre le concept de design simple et pratique de ce produit. Dans le même temps, le fort contraste noir et blanc met efficacement en valeur ses zones fonctionnelles. Le style général est une forme de croix formée par l’articulation arrondie de la surface incurvée, faisant référence à la forme conventionnelle de la plaie et suggérant le rôle du produit. La difficulté de l’opération est réduite grâce à la simplification de l’opération et à la fonction de réinitialisation manuelle. En résumé, les résultats indiquent un outil alternatif prometteur pour les expérimentateurs afin de préparer des rayures cellulaires en un clic, de manière automatisée et robuste, améliorant ainsi la reproductibilité des résultats scientifiques.

Il faut reconnaître les limites de cette étude. La taille de l’échantillon des personnes interrogées dans le questionnaire limite la généralisabilité de cette étude ; Par conséquent, nous augmenterons encore la taille de l’échantillon dans une étude de suivi afin d’améliorer le racleur cellulaire. Deuxièmement, le grattoir de cellules doit être inclus dans une étude bien planifiée avec une plus grande population d’utilisateurs afin que les performances de ce grattoir de cellules puissent être évaluées de manière plus complète.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude est soutenue par la subvention de la Fondation nationale des sciences sociales (22FYSB023), de la Fondation de recherche du Centre de design industriel du Hubei (08hqt201412046) et de la Fondation des sciences humaines et sociales du Département de l’éducation de la province du Hubei (15Y054).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
CCK-8 KitBeyotime Company, ChineC0037
système de microscope numériqueOlympusIX81
sérum fœtal bovinGibco, États-Unis16000044
HOS  ;Procell Life Science & Technology Co., LtdCL-0360
Image-Pro PlusMedia Cyberneticsversion 6.0
KeyShotLuxionversion 11.0Logiciel de rendu 3D
lecteur de microplaquesBioTek, allemandELX808
Minimum Essential MediumGibco, États-Unis11095080
Pantone matching systemPantonecorrespondance des couleurs commerciale
pénicilline-streptomycineBeyotime Company, ChineST488
PhotoshopAdobephoto et logiciel de conception
Rhinoceros 3DRobert McNeel & Associatesversion 7.0Logiciel de conception 3D
TC20 Compteur de cellules automatiséBio-RadTC20
TrypsineCytiva  ; HyClone, États-UnisSH30042.01

Références

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