Explantation de membrane de fenêtre ronde de cobaye pour études ex vivo

Résumé

Ce protocole décrit une méthode d’explantation de la membrane de la fenêtre ronde des os temporaux de cobaye, fournissant une ressource précieuse pour les études ex vivo .

Résumé

L’administration efficace et peu invasive de médicaments dans l’oreille interne est un défi de taille. La membrane de fenêtre ronde (RWM), étant l’un des rares points d’entrée de l’oreille interne, est devenue un centre de recherche essentiel. Cependant, en raison de la complexité de l’isolement du RWM, notre compréhension de sa pharmacocinétique reste limitée. Le RWM comprend trois couches distinctes : l’épithélium externe, la couche de tissu conjonctif moyen et la couche épithéliale interne, chacune possédant potentiellement des propriétés d’administration uniques.

Les modèles actuels d’étude du transport à travers le RWM utilisent des modèles animaux in vivo ou des modèles RWM ex vivo qui reposent sur des cultures cellulaires ou des fragments de membrane. Les cobayes servent de modèle préclinique validé pour l’étude de la pharmacocinétique des médicaments dans l’oreille interne et constituent un modèle animal important pour le développement translationnel des véhicules d’administration à la cochlée. Dans cette étude, nous décrivons une approche d’explantation d’un RWM de cobaye avec l’os cochléaire environnant pour des expériences d’administration de médicaments sur paillasse. Cette méthode permet de préserver l’architecture RWM native et peut fournir une représentation plus réaliste des obstacles au transport que les modèles de paillasse actuels.

Introduction

De nouvelles classes de traitements ont vu le jour pour le traitement de la perte auditive neurosensorielle. L’application de ces thérapies aux populations cliniques est limitée par des voies de transport sûres et efficaces dans l’oreille interne. Les méthodes actuelles d’administration in vivo dans les études animales reposent soit sur la fenestration dans l’oreille interne, soit sur la diffusion à travers la membrane de la fenêtre ronde (RWM), une barrière non osseuse qui sépare l’espace de l’oreille moyenne de la cochlée¹.

La fenestration chirurgicale et la micro-injection dans l’oreille interne sont toutes deux invasives et peuvent présenter des risques pour la fonction résiduelle de l’oreille interne². Par conséquent, le RWM est une voie importante pour l’administration locale des médicaments, et les cobayes sont le principal modèle animal préclinique utilisé pour étudier la pharmacocinétique locale des médicaments dans le RWM et dans l’oreille interne pour le développement pharmaceutique ^3,4. Bien que plus mince que le RWM humain, le RWM du cobaye partage une structure identique à trois couches. Il mesure environ 1 mm de diamètre, 15 à 25 μm d’épaisseur et est composé de deux couches de cellules épithéliales prenant en sandwich une couche de tissu conjonctif⁵. La couche épithéliale faisant face à l’oreille moyenne est densément tassée et reliée par des jonctions serrées, tandis que la couche faisant face à l’oreille interne et à la rampe tympanique a une architecture plus lâche et n’a pas d’adhérences intercellulaires significatives.

Les études précliniques actuelles portant sur la perméabilité aux médicaments chez le cobaye RWM reposent sur des injections in vivo dans l’oreille moyenne suivies d’un prélèvement du liquide périlymphatique dans l’oreille interne, ce qui ne permet pas l’étude spécifique du transport RWM ^6,7. Des fragments d’explants de RWM ont été utilisés dans des études précliniques, mais en raison de leur fragilité et de leur petite taille, ils ne conviennent pas aux études microfluidiques systématiques du transport de médicaments et de véhicules nécessitant une étanchéité à travers le RWM². D’autres groupes ont utilisé des modèles in vitro avec des cellules épithéliales humaines en culture pour approximer le RWM ^8,9,10. Cependant, la majorité de ces constructions se concentrent uniquement sur la couche épithéliale externe et ne capturent pas la complexité de l’architecture tissulaire native. Pour une compréhension plus détaillée des mécanismes de transport dans l’ensemble de la RWM, des études ex vivo ciblées sont nécessaires.

Dans cette étude, nous démontrons l’explantation d’un RWM de cobaye avec un support osseux environnant pour préserver l’intégrité de la membrane et illustrons leur utilisation dans un paradigme expérimental conçu pour l’étude spécifique du transport RWM des véhicules d’administration de médicaments.

Protocole

Toutes les procédures relatives aux animaux ont été approuvées par le Comité institutionnel de protection et d’utilisation des animaux (GP18M226). Des cobayes Hartley albinos (mâles et femelles, pesant de 500 à 700 g) ont été utilisés dans la présente étude.

1. Mise en place et préparation de la procédure

1. Stérilisez tous les instruments avec de l’oxyde d’éthylène avant de commencer l’expérience.
2. Euthanasier les animaux en suivant le protocole approuvé par l’institution.
   REMARQUE : Dans la présente étude, une chambre non préchargée a été utilisée pour libérer 100 % de dioxyde de carbone (CO₂) à partir d’une bouteille commerciale. Un limiteur en ligne a été utilisé pour réguler le débit de gaz, le maintenant dans la plage de 30 % à 70 % du volume par minute de la chambre, conformément aux directives^{AVMA 2020 11}.
3. Placez l’animal dans la chambre et distribuez du dioxyde de carbone pendant 5 min. Le débit de CO₂ est maintenu pendant 1 min après l’arrêt respiratoire.
4. Effectuer la décapitation après un arrêt respiratoire pour assurer l’euthanasie.

2. Approche chirurgicale et explantation

1. Extrayez l’os temporal du crâne de cochon d’Inde de la manière habituelle¹². Retirez l’excédent de tissu mou avec un rongeur. Identifiez le méat acoustique externe, la bulle temporale et le canal facial¹³ (Figure 1).
2. Percez les faces ventrales de la bulle temporale avec un embout diamanté de 6 mm (voir Tableau des matériaux), en exposant l’espace de l’oreille moyenne et le conduit auditif externe sur la circonférence.
3. À l’aide de rongeurs, retirez délicatement le conduit auditif externe et l’anneau tympanique, en séparant simultanément l’articulation incudomalléolaire. Identifiez l’incus, l’articulation incudostapediale, la cochlée, le canal semi-circulaire horizontal et le canal facial¹³ (Figure 2A).
4. Séparez l’articulation incudostape-médiale et retirez l’invagination à l’aide d’une pince. Identifiez la niche osseuse de la fenêtre ronde.
5. Utilisez un foret diamanté de 6 mm pour percer la lame osseuse reliant la cochlée à la paroi médiale de la cavité tympanique vers le canal tenseur du tympan. Décompressez soigneusement le canal osseux du tenseur du tympan et retirez le muscle tenseur du tympan à l’aide d’une aiguille de 28 G.
   REMARQUE : La paroi médiale de la fosse tensorielle du tympan se connecte directement à l’os cochléaire autour de la RWM, et on prend soin de ne pas provoquer de fractures pouvant s’étendre à la fenêtre ronde.
6. Percez la lame osseuse reliant la cochlée à la paroi inférieure de la cavité tympanique jusqu’à ce qu’il reste 1 mm de rebord osseux attenant à la cochlée (Figure 2B).
7. À l’aide d’un foret diamanté de 2 mm (voir tableau des matériaux), faites une cochléostomie à la tour basale de la cochlée, en laissant environ 2 mm d’os à la fenêtre ronde. Poursuivre la cochléostomie vers le bas dans un plan parallèle à la membrane de la fenêtre ronde pour séparer la base de l’apex de la cochlée.
8. Étendre la coupe de cochléostomie à travers la base du crâne, qui est beaucoup plus dense, ce qui donne une vue en coupe transversale de la rotation basale de la cochlée.
   REMARQUE : Diriger la perceuse vers le méat du conduit auditif interne permet d’obtenir une trajectoire qui maximise l’élimination osseuse tout en évitant de traverser trop près de la fenêtre ronde.
9. Examinez le spécimen du côté de la base du crâne et, si ce n’est pas déjà fait, identifiez le conduit auditif interne et percez jusqu’à l’ouverture cochléaire. Retirez le nerf cochléaire avec une aiguille de 28 G.
10. Examinez l’échantillon du côté intracochléaire. Identifiez et retirez le limbe osseux en spirale dans le tour basal et le modiolus restant avec une pince ou une aiguille de 28 G.
11. Irriguer copieusement la cavité unifiée de la rampe tympanique-rampe vestibulaire pour éliminer les débris. La fenêtre ronde doit être clairement visible depuis la cochectomie sans aucun débris sus-jacent (Figure 2C).
12. Ensuite, examinez l’échantillon du côté de l’oreille moyenne. Percez le canal semi-circulaire latéral et le canal facial jusqu’au niveau de la fenêtre ovale. Retirez délicatement l’étrier à l’aide d’une pince, exposant la niche ovale de la fenêtre. Il convient de noter qu’il y a un pont osseux entre la crura de l’étrier connu sous le nom de crista stapedis.
13. À l’aide d’une perceuse diamantée de 1 mm (voir le tableau des matériaux), ouvrez davantage le vestibule en prolongeant la fenêtre ovale le long de la face de la fenêtre ronde, en prenant soin de maintenir 1 à 2 mm d’os cochléaire attenant à la niche de la fenêtre ronde (figure 2D).
14. Complétez les coupes de l’os temporal en reliant les coupes de la fenêtre ovale avec les coupes de cochlectomie de chaque côté de la fenêtre ronde.
    REMARQUE : En raison de la fragilité de l’os cochléaire, la préservation de la fosse tympanique tensorielle dans l’échantillon et l’évitement des coupures aidera à prévenir les fractures de l’os cochléaire qui s’étendent à la MRS et compromettent son intégrité.
15. Effectuez les dernières attaches à l’os dense de la base du crâne adjacent au conduit auditif interne et rasez-vous doucement pour obtenir un échantillon RWM excisé (Figure 3A).

Résultats

Comme le montre la figure 3A, cette méthode permet d’explanter la membrane intacte de la fenêtre ronde du cobaye avec un anneau d’os rigide qui l’entoure. Le RWM doit être entièrement connecté à l’anneau osseux sur la circonférence. Aucune fracture de l’os cochléaire ne doit être appréciée. Par rapport aux spécimens humains à fenêtre ronde, le cobaye RWM n’a pas de pseudomembrane sus-jacente. De plus, contrairement aux humains, il existe un pont osseux entre la crura de l’étrier du cobaye, q...

Discussion

Dans l’administration locale de médicaments à l’oreille, le RWM est la principale voie de passage pour que les thérapies atteignent l’oreille interne. Un modèle de paillasse précis et fiable est nécessaire pour mieux comprendre les mécanismes de transport et la perméabilité à travers les nouveaux véhicules d’administration et pour le développement de médicaments. Dans cette étude, nous démontrons que l’explantation RWM de cobaye est une procédure réalisable et fiable pour permettre des études systématiques des interactio...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Mèche à billes diamantées de 1 mm	Anspach	1SD-G1
Mèche à billes diamantées de 2 mm	Anspach	2SD-G1
Mèche à billes diamantées de 6 mm	Anspach	6D-G1
ANSPACH EMAX 2 Plus System	Anspach	EMAX2PLUS	Tout système de perçage d’os peut fonctionner
Aiguille BD Eclipse 27 G x 1/2 po avec seringue BD Luer-Lok amovible de 1 ml	Becton, Dickinson et Cie.	382903057894	N’importe quelle aiguille de 27-28 g
Gorilla Epoxy	Gorilla	4200101
Kwik-CAST	World Precision Instruments	KWIK-CAST