Article de méthode

Quantification du callose dans les tissus végétaux par test immunosorbant lié aux enzymes/spectrophotométrie à immunofluorescence

112 vues

⸱

DOI :

10.3791/65833

⸱

22 mai 2026

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Plant Sciences, Microbiology, and Biotechnology, College of Natural Sciences, Makerere University, 2Department of Plant Biology, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 3The Genome Center, College of Biological Sciences, University of California, Davis, 4International Potato Center (CIP)

Dans cet article

Résumé

Ce protocole quantifie le callose dans les tissus végétaux en utilisant la méthode spécifique à la callose, la spectrophotométrie d’immunofluorescence/ELISA, qui repose sur la liaison du callose dans les échantillons de plantes à des anticorps spécifiques à la callose, suivie de la quantification du callose lié par anticorps de détection marqués par enzymes, en mesurant l’activité enzymatique résultante.

Résumé

Les méthodes existantes de quantification du callose à partir de tissus végétaux incluent la microscopie par épifluorescence, la spectrophotométrie de fluorescence, la microscopie à immunofluorescence et l’évaluation indirecte des activités de la callose synthase et de la β-(1,3)-glucanase. Cependant, certaines de ces méthodes présentent des limites importantes, notamment le fait d’être chronophage, non spécifique à la callosité, exigeant en main-d’œuvre, subjective, haute autofluorescence, faible sensibilité, plus qualitative que quantitative, et nécessitant l’acquisition de ressources logicielles et de compétences techniques. Par conséquent, il est urgent d’explorer des méthodes alternatives pour la quantification de la callose dans les tissus végétaux. Il a été émis l’hypothèse que la spectrophotométrie d’immunofluorescence ou le test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) utilisant des anticorps spécifiques à la callosité pourraient surmonter certaines des limites actuelles des méthodes actuelles de quantification du calose. Le stress biotique a été administré en inoculant des plants de bananier issus de cultures tissulaires avec Xanthomonas vasicola pv. bactéries musacearum (Xvm) qui induisaient la production de calloses. Des échantillons de tissu de corm de banane ont été prélevés 14 jours après l’inoculation (dpi) pour la quantification de la callose à l’aide de la nouvelle méthode de spectrophotométrie à immunofluorescence. La production de callose dans les cormes des groupes inoculés avec Xvm et des groupes témoins a varié significativement dans les deux génotypes de bananes (test t de l’échantillon indépendant, p < 0,05). La méthode de spectrophotométrie par immunofluorescence décrite ici pourrait être appliquée à la quantification du callose dans différents tissus végétaux présentant une forte spécificité en callose, sensibilité, fiabilité et reproductibilité. De plus, l’utilisation d’une plaque à 96 puits rend cette méthode adaptée aux études de quantification de callose à haut débit avec des biais d’échantillonnage et d’analyse minimes.

Introduction

Le callose est un polysaccharide de β-1,3-glucan, un composé naturel présent dans les parois cellulaires de diverses plantes supérieures. La callose est synthétisée par les callose synthases (CalS) et dégradée par les β-(1,3)-glucanases 1,2,3. Elle est impliquée dans plusieurs processus biologiques, notamment la croissance et le développement ainsi que la réponse aux stress abiotiques et biotiques 4,5,6. Lors de l’infection par un pathogène, l’augmentation du dépôt de callose dans les papilles aide à prévenir une colonisation microbienne supplémentaire, agissant comme une barrière de perméabilité entre les cellules végétalesvoisines 2,4,7,8,9,10,11,12 . En ralentissant l’invasion des agents pathogènes dans le tissu attaqué, le dépôt de callose permet l’induction de réponses de défense supplémentaires13. Une quantification spatiotemporelle précise du callose dans les tissus végétaux est essentielle pour comprendre son rôle dans les différents processus physiologiques. Cependant, les méthodes actuelles de quantification des caloses à partir de tissus végétaux, qui incluent la microscopie à épifluorescence, la microscopie à immunofluorescence et la spectrophotométrie à fluorescence, présentent des limites et des défis de quantification importants. Il est donc urgent d’explorer des méthodes alternatives pour la quantification des calouses afin de surmonter ces inconvénients. On a émis l’hypothèse que la spectrophotométrie à immunofluorescence ou le test immunosorbent lié aux enzymes (ELISA) pourrait offrir une méthode plus efficace de quantification du callose dans des échantillons de plantes, incluant une grande spécificité, sensibilité, fiabilité, reproductibilité et une méthode à haut débit.

La méthode de référence pour la quantification du callose consiste à imager des particules de callose colorées en bleu d’aniline par microscopied’épifluorescence 14,15,16,17. Le callose coloré en bleu d’aniline, exposé à l’excitation bleue ou UV, apparaît sous forme de particules fluorescentes jaunes, qui peuvent être soit comptées manuellement pour le nombre de particules de callosefluorescentes fluorescentes, 14,15, soit comptées par un logiciel automatisé de comptage de la calose. Le comptage manuel des particules de calclose est laborieux, chronophage et subjectif pour lechercheur 18, tandis que le comptage automatisé nécessite d’acquérir des ressources logicielles et de solides compétences techniques. Parmi les logiciels utilisés pour le comptage automatisé de la callose figurentImageJ 19,20,21,22, Photoshop23, CalloseMeasurer 24, Icy18,25 et Ilastik 26. Le callose coloré en bleu d’aniline peut également être quantifié à l’aide de la spectrophotométrie de fluorescence 17,19,27,28,29. Cependant, la haute autofluorescence de fond/fluorescence associée à la microscopie à épifluorescence et à la spectrophotométrie à fluorescence rend ces méthodes difficiles et peu fiables en raison du faible rapport signal/bruit de 26. De plus, le bleu d’aniline peut colorer d’autres β-1,3-glucans en plus du callose30, rendant à la fois la microscopie par épifluorescence et les méthodes de spectrophotométrie à fluorescence pour la détection et la quantification du callose partiellement non spécifiques et peu fiables. Une méthode de microscopie à immunofluorescence pour la quantification du calose, basée sur des anticorps spécifiques aux calloses, a également été utilisée dans plusieurs études 31,32,33. Bien que cette méthode présente quelques inconvénients avec la microscopie par épifluorescence de la callosité colorée en bleu d’aniline, elle a l’avantage d’être spécifique à la callose grâce aux anticorps utilisés ici. La quantification de la callose a également été réalisée à l’aide de méthodes basées sur l’activité enzymatique. Les méthodes basées sur l’activité enzymatique pour la quantification des caloses incluent l’évaluation des activités de la callose synthase (CalS)20,33 et de la β-(1,3)-glucanase 34,35. Les méthodes basées sur l’activité enzymatique présentent plusieurs inconvénients par rapport à la microscopie à épifluorescence, à la microscopie à immunofluorescence et à la spectrophotométrie à fluorescence. Cela inclut l’estimation indirecte de la callose, la difficulté d’extraction enzymatique et d’analyse d’activité enzymatique, ainsi que l’absence de distribution uniforme de la callose dans les tissus végétaux.

En raison des inconvénients des méthodes actuelles de quantification du callose qui incluent la microscopie à épifluorescence, la microscopie à immunofluorescence, la spectrophotométrie à fluorescence, les essais CalS et β-(1,3)-glucanase, il a été nécessaire de mettre au point une nouvelle méthode de quantification du callose offrant plusieurs avantages, notamment : 1) une grande spécificité, sensibilité, fiabilité et reproductibilité, et 2) une quantification du callose plus facile avec une capacité de haut débit. L’utilisation de la spectrophotométrie d’immunofluorescence pour la quantification des caloses n’a pas encore été explorée. Ici, une nouvelle méthode de quantification du callose basée sur la spectrophotométrie par immunofluorescence, plus précisément l’Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA), est rapportée. La méthode peut être optimisée pour la quantification du callose dans différentes plantes ou leurs tissus avec un bon degré de spécificité en termes de callosité, de précision, de reproductibilité et une capacité expérimentale à haut débit. Cette méthode peut également être modifiée pour quantifier tout analyte d’origine végétale si l’anticorps contre cet analyte est disponible. Pour garantir une distribution spatiotemporale précise, efficace et fiable du callose dans les tissus végétaux, il est recommandé d’utiliser simultanément différentes méthodes de quantification du callose, incluant la microscopie, la spectrophotométrie et les méthodes basées sur l’activité enzymatique. Par conséquent, cela permettra de comprendre avec précision et efficacité le rôle de la callose dans diverses réponses physiologiques et de stress.

Protocole

1. Inoculation des plantes expérimentales

  1. Isoler, préparer et confirmer l’inoculum Xvm selon les procéduresstandard 36,37. Sélectionnez au hasard 10 plants de Musa balbisiana et Mbwazirume âgés de 2 mois, dérivés de culture tissulaire, et inoculez le côté dorsal du pétiole feuillaire le plus jeune, entièrement ouvert, avec 200 μL (1 x 108 cellules) de l’inoculum Xvm confirmé par PCR (Figure 1)38.
  2. De même, sélectionnez au hasard 10 plants de bananier Musa balbisiana et Mbwazirume et inoculez-les avec 200 μL d’eau distillée stérile (SDW).
  3. Maintenez les bananiers inoculés avec Xvm et contrôlez les bananiers dans des conditions similaires dans la grille avec une photopériode de 12 heures de lumière / 12 heures de photopériode sombre à 25 °C, en les arrosant tous les 3 jours.
    REMARQUE : Consultez le tableau des matériaux et le tableau 1 pour la liste des matériaux et équipements ainsi que la recette des tampons, respectivement.

2. Prélèvement des tissus cormiques et préparation de l’échantillon

  1. Effectuer un échantillonnage destructif pour obtenir des échantillons de cormes auprès des plantes expérimentales (Figure 1).
  2. Préciser rapidement environ 2 g d’échantillons de corme à l’aide de lames chirurgicales stériles à 14 jours après l’inoculation (dpi) et les placer individuellement dans des tubes étiquetés de 50 mL. Faites cela pour les 10 échantillons prélevés sur les plantes inoculées avec Xvm et les plantes témoins.
  3. Immergez immédiatement les tubes de 50 mL contenant les échantillons dans de l’azote liquide.
  4. Transportez les échantillons au laboratoire et stockez-les à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient prêts à continuer. Conservez les échantillons à −80 °C pendant jusqu’à 1 an ou plus avec des cycles de congélation-dégel minimaux.
  5. Lyophilisez les échantillons pendant 72 heures à l’aide d’un lyophilisateur (Figure 1).
  6. Placez exactement 30 mg des échantillons lyophilisés dans des tubes de 2 mL contenant 2 billes d’acier pour bicyclette et pulvérisez-les en une poudre fine, avec la vitesse réglée à 5 pendant 1 minute (Figure 1).
  7. Conservez les échantillons pulvérisés dans un environnement frais et sec à température ambiante, bien scellés jusqu’à ce qu’ils soient prêts à continuer. Conservez les échantillons pulvérisés à température ambiante pendant jusqu’à 4 mois ou à −80 °C pendant jusqu’à 1 an avec des cycles minimaux degel-dégel 39,40.

3. Extraction de callose et préparation des standards de laminarine et du blank

  1. Pour extraire la callose des 30 mg de l’échantillon pulvérisé, ajoutez 800 μL de 1 M de NaOH et incubez pendant 30 minutes à 80 °C dans un bain-marie, avec un vortex occasionnel toutes les 10 minutes27,41 (Figure 1, Étape 6).
  2. Laissez refroidir les échantillons à température ambiante (environ 5 minutes) puis centrifugez à 15 294 x g pendant 5 minutes.
  3. Transférez le surnageant (extrait de calose) dans un tube stérile de 2 mL et diluez avec le tampon de blocage (Tableau 1) dans un ratio de 1:2.
    REMARQUE : Choisissez le facteur de dilution en fonction des expérimentations préliminaires et de l’optimisation. La dilution de l’extrait de callose peut être nécessaire ou non. Lorsque nécessaire, la dilution doit être effectuée dans le tampon de blocage et le rapport de dilution doit être optimisé pour que différents types d’échantillons entrent dans la plage de la courbe standard.
  4. Conservez les extraits de callose à -20 °C jusqu’à ce que vous soyez prêt à continuer. Conservez l’extrait de callose jusqu’à 6 mois avec des cycles de congélation-dégel minimaux.
  5. Préparez un stock concentré de laminarine standard à 100 mg/mL dans 1 M NaOH 6,42,43,44,45.
    REMARQUE : La laminarine est un polymère 1-3-β-glucan et peut être utilisée comme standard pour des équivalents calceux en spectrophotométrie d’immunofluorescence.
  6. Incubez la suspension résultante de l’étalon à 80 °C dans un bain-marie, en la secouant doucement à intervalles réguliers, jusqu’à ce que toute la laminarine soit complètement dissoute (environ 20-40 minutes).
  7. Refroidissez le standard dissous à température ambiante (environ 10 minutes).
  8. Préparez des standards de laminarine à des concentrations de 80 mg/mL, 60 mg/mL, 40 mg/mL, 20 mg/mL, 10 mg/mL, 1 mg/mL, 0,5 mg/mL, 0,1 mg/mL et 0,01 mg/mL en utilisant le tampon bloquant, en partant du stock concentré de 100 mg/mL.
  9. Préparez les blanks en mélangeant 1 M NaOH et le tampon de blocage à un ratio de 1:2. Si une dilution est nécessaire, utilisez le même rapport de dilution que celui utilisé pour préparer l’extrait de callose.
  10. Stockez les étalons laminarine et les blancs à −20 °C. Conservez les standards et les blanks jusqu’à 6 mois avec des cycles de congélation-dégel minimaux.

4. Quantification du callose par spectrophotométrie d’immunofluorescence

  1. Ajoutez 100 μL de l’anticorps primaire (IgG de souris dirigé 1-3-β-glucan) préparé à l’aide du tampon de revêtement (Tableau 1) à chacun des 96 puits des plaques ELISA en polystyrène (Figure 2).
  2. Scellez la plaque hermétiquement avec un film de paraffine et faites-la incuber toute la nuit à 4 °C au réfrigérateur.
  3. Le lendemain, posez l’assiette sur le banc et laissez-la atteindre la température ambiante (environ 10 minutes).
  4. Lavez la plaque en utilisant les procédures standard de buvardet de lavage 46. En résumé, ajoutez 200 μL du tampon de lavage (Tableau 1) aux puits, faites-le passer à 500 tr/min pendant 30 secondes à l’aide d’un shaker numérique et tachez sur du papier de soie. Répétez ce processus de lavage deux fois (Figure 2). Veillez à ce que les puits ne sèchent pas complètement et utilisez une pointe de micropipette stérile pour éliminer les bulles dans les puits sans toucher la base ni les parois des puits.
  5. Ajoutez 200 μL de tampon de blocage à chacun des puits (Figure 2) et scellez la plaque hermétiquement avec un film de paraffine. Écouve-la pendant 4 heures à 37 °C. Lavez l’assiette comme mentionné ci-dessus (Figure 2).
  6. Ajoutez 100 μL d’extrait de callose provenant des 10 plantes inoculées à Xvm et 10 usines témoins dans les puits désignés. Ajoutez 100 μL des étalons laminarine à d’autres puits. Ajouter 100 μL du blank à d’autres puits (Figure 2).
  7. Scellez la plaque hermétiquement avec un film de paraffine et incubez toute la nuit à 4 °C au réfrigérateur. Lavez à nouveau l’assiette comme mentionné plus haut (Figure 2).
  8. Ajoutez 100 μL de l’anticorps primaire (IgG de souris dirigé 1-3-β-glucan) préparé à l’aide du tampon de blocage sur chacun des puits (Figure 2).
  9. Scellez la plaque hermétiquement avec un film de paraffine et incubez pendant 4 heures à 37 °C, puis lavez la plaque comme indiqué ci-dessus (Figure 2).
  10. Ajouter 100 μL d’anticorps secondaire anti-IgG de souris - phosphatase alcaline à chaquepuits 46,47 (Figure 2).
  11. Scellez la plaque hermétiquement avec un film de paraffine et incubez toute la nuit à 4 °C au réfrigérateur. Ensuite, lavez l’assiette comme indiqué ci-dessus (Figure 2).
  12. Ajouter 100 μL de solution de phosphate de para-nitrophényle (pNPP) fraîchement préparée à une concentration de 1 mg/mL (Tableau 1) dans les puits (Figure 2)
  13. Faites couver l’assiette sur le paillassard à température ambiante pendant 30min 48.
    REMARQUE : Le temps d’incubation peut varier selon les échantillons de plantes et la norme utilisée. Dans cette étude, la laminarine a donné la meilleure lecture à 30 minutes.
  14. Terminez la réaction en ajoutant 100 μL de solution d’arrêt fraîchement préparée (0,5 M NaOH) à chacun despuits 48 (Figure 2).
  15. Transférez la plaque à un lecteur de microplaques (équilibré à 37 °C), secouez-la à vitesse moyenne pendant 1 minute, et lisez les absorbances à 405nm 48 (Figure 1, Figure 2).

5. Analyse des données

  1. Effectuer une simple régression linéaire de l’absorbance de la laminarine à 405 nm par rapport à la concentration de laminarine (μg/mL) pour obtenir la courbe standard. L’équation de la courbe standard est
    Y = β1X + β0
    où Y représente l’absorbance de la laminarine à 405 nm, β1 est la pente de la droite de régression (coefficient de corrélation de Pearson), X est Log10 (concentration de laminarine en μg/mL) et β0 est l’interception y.
  2. Calculez les concentrations de callose dans les échantillons de cormes en soustrayant l’absorption de l’ébauche de celle des échantillons. Utilisez ensuite la courbe standard pour estimer la concentration de callose en μg/mL comme équivalent laminarine (LE).
  3. Examinez toutes les données pour la normalité de la distribution à l’aide du test de Shapiro-Wilk et vérifiez l’homoscédasticité des variances à l’aide du test de Levene (α > 0,05).
  4. Utilisez le test t d’échantillon indépendant pour comparer la production de callose entre les groupes inoculé en Xvm et le groupe témoin (p≤ 0,05).

Résultats

Les concentrations connues des étalons de laminarine ont été analysées par spectrophotométrie et leurs valeurs d’absorbance correspondantes ont été enregistrées. En utilisant ces données, un graphique de Beer-Lambert a été construit en traçant les concentrations des étalons de laminarine sur l’axe des x et l’absorption sur l’axe des y. L’équation de la droite de régression était y = 0,5079x − 0,04534 (Figure 3)49. Le graphique de Beer-Lambert a donné un coefficient de corrélation élevé (r) de 0,9988 et un coefficient de détermination (r2) de 0,9975, indiquant une forte relation linéaire entre concentration et absorbance, et jusqu’à 0,9975 de la variance de la variable dépendante (absorbance) était expliquée par la variable indépendante (concentration ; Figure 3 ; p<0,0001). Par conséquent, ce modèle était un bon ajustement, précis et fiable pour prédire la concentration de laminarine et de callose. La concentration de callose dans les échantillons de cormes de banane a été déterminée en mesurant l’absorption des échantillons de corme par spectrophotométrie et en utilisant les valeurs d’absorbance pour calculer les concentrations de callose à l’aide de l’équation.

Le test de spectrophotométrie par immunofluorescence a montré une augmentation significative du callose induit chez les plantes inoculées avec Xvm par rapport au groupe témoin dans les deux génotypes de bananes (test t d’échantillon indépendant, p < 0,05 ; Figure 4). La production de callose dans les usines témoins à 14 dpi était de 1474,34 mg/mL et 1037,11 mg/mL pour Mbwazirume et M. balbisiana, respectivement (Figure 4). L’inoculation des plantes avec Xvm a permis de produire 4190,78 mg/mL et 1996,07 mg/mL de callose dans les cormes des plantules de Mbwazirume et M. balbisiana inoculées à Xvm à 14 dpi respectivement (Figure 4). L’inoculation avec Xvm a entraîné une production de callose de 1,9 à 2,8 fois supérieure par rapport aux plantes témoins (test t d’échantillon indépendant, p < 0,001 ; Figure 4).

figure-results-1
Figure 1 : Illustration schématique des principales étapes impliquées dans la quantification du callose par la nouvelle méthode de spectrophotométrie à immunofluorescence. Cette figure illustre les principales étapes impliquées dans la quantification du callose à partir de tissus bananiers, incluant le relevage des plantes issues de culture tissulaire, l’inoculation avec Xvm, l’échantillonnage destructif des tissus cormaticaux, la lyophilisation des échantillons, l’extraction du callose et la quantification du callose par la nouvelle méthode de spectrophotométrie à immunofluorescence. Cette figure a étéréimprimée 50. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-2
Figure 2 : Illustration schématique détaillée de la méthode de spectrophotométrie par immunofluorescence pour la quantification du callose. Cette figure offre une démonstration détaillée de la méthode de spectrophotométrie par immunofluorescence pour la quantification du caloso, montrant comment la plaque ELISA est chargée avec les différents composants et comment le callose est finalement quantifié par spectrophotométrie. Cette figure a étéréimprimée 50. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-3
Figure 3 : Quantification des protéines. Le graphique de Beer-Lambert basé sur les standards de laminarine des concentrations connues et des relevés d’absorbance (à 405 nm) est utilisé pour calculer les concentrations de callose (comme équivalents laminarinés, LE) à partir des lectures d’absorption des échantillons de corme. Cette figure a étéréimprimée à 49 ans. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figurine.

figure-results-4
Figure 4 : Comparaison de la concentration de calose. Comparaison des concentrations moyennes de callose (moyenne ± SEM, n = 9) dans les cormes des plants de bananier M. balbisiana et Mbwazirume inoculés avec Xvm, comme déterminé par la nouvelle méthode de spectrophotométrie à immunofluorescence (test t d’échantillon indépendant, α ≤ 0,05) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

TamponCompositionStockage
Tampon de blocage10 g d’albumine sérique bovine (BSA ; 1 % en va), dissous dans 1 L de PBS.-20 °C jusqu’à 6 mois
Tampon de revêtement1,59 g de carbonate de sodium (Na2CO3), 2,93 g de bicarbonate de sodium (NaHCO3), 0,2 g d’azide de sodium (NaN 3), dissous dans 1 L de H2O déionisé, pH 9,6.-20 °C pendant jusqu’à 12 mois
Tampon conjugué2 g de PVP (2 % en v/v), dissous dans 1 L de tampon bloquant.-20 °C jusqu’à 6 mois
Solution de phosphate de para-nitrophényl (pNPP)Dissoudre le para-nitrophényl phosphate (pNPP) dans un tampon substrat jusqu’à une concentration de travail de 1 mg/mL-20 °C pendant jusqu’à 12 mois
Solution physiologique tamponnée phosphate (PBS)8,0 g de chlorure de sodium (NaCl), 0,2 g de phosphate de potassium monobasique (KH2PO4), 1,15 g de phosphate de sodium dibasique (Na2HPO 4), 0,2 g de chlorure de potassium (KCl), 0,2 g d’azide de sodium (NaN 3), dissous dans 1 L de H2déionisée, pH 7,4.-20 °C pendant jusqu’à 12 mois
Anticorps primaire dans le tampon bloquantReconstituer l’anticorps primaire lyophilisé selon les instructions du fabricant pour obtenir le stock concentré. Diluer le stock primaire d’anticorps reconstitué obtenu dans le tampon de blocage à une concentration de travail de 2 μg/mL.-20 °C jusqu’à 6 mois
Anticorps primaire dans le tampon de revêtementReconstituer l’anticorps primaire lyophilisé selon les instructions du fabricant pour obtenir le stock concentré. Diluer le stock primaire d’anticorps reconstitué obtenu dans le tampon de revêtement à une concentration de travail de 2 μg/mL.-20 °C jusqu’à 6 mois
Anticorps secondaire1:1000 de concentré secondaire d’anticorps : tampon conjugué-20 °C jusqu’à 6 mois
Tampon de substrat97 mL de diéthanolamine, 0,2 g d’azide de sodium (NaN 3), dissous dans 1 L d’H2O déionisé, pH 9,8-20 °C pendant jusqu’à 12 mois
Tampon de lavage0,5 mL de Tween 20 (0,05 % v/v), dissous dans 1 L de PBS, pH 7,5-20 °C pendant jusqu’à 12 mois

Tableau 1 : Recette des tampons.

Discussion

La méthode de spectrophotométrie par immunofluorescence a été appliquée pour la première fois à la quantification du callose dans les cormes de bananier. Il est basé sur l’immunotest enzymatique (EIA), utilisé pour quantifier le callose dans l’extrait brut de NaOH 1 M de banane en utilisant des anticorps spécifiques à lacallose 47,51,52. En résumé, ce nouveau test de quantification spécifique à la callose basé sur la spectrophotométrie par immunofluorescence impliquait un revêtement de la microplaque avec un anticorps spécifique à la callose, qui se lie ensuite au callose dans l’extrait de la plante, suivi d’un anticorps secondaire également spécifique à la callose. La détection d’un anticorps lié à une enzyme (phosphatase alcaline) est ensuite ajoutée et forme un complexe avec l’anticorps secondaire. Un substrat, le para-nitrophénylphosphate (pNPP), est ensuite ajouté. La quantification du callose dans l’échantillon repose sur la capacité de la phosphatase alcaline à cliver les groupes phosphates à partir des molécules de pNPP, ce qui entraîne la formation d’un composé de couleur jaune (p-nitrophénol). La détection de l’intensité de la couleur jaune a été réalisée à l’aide d’un spectrophotomètre à 405 nm, puis l’absorption a été corrélée à l’activité de phosphatase alcaline, qui était directement proportionnelle à la concentration de callose présente dans l’échantillon. La réaction a été stoppée en augmentant le pH par l’ajout de 0,5 M de NaOH, ce qui a empêché une activité supplémentaire de phosphatase alcaline.

En revanche, la méthode standard de l’or pour la localisation et la quantification du callose est la méthode de microscopie par épifluorescence, une méthode bien établie basée sur la coloration du callose avec le bleu d’anilinefluorochrome 53. En résumé, cette méthode repose sur la liaison spécifique du colorant bleu d’aniline aux bêta-1,3-glucanes (callose), formant un complexe. Le bleu d’aniline dans ce complexe est ensuite excité grâce à la lumière ultraviolette (longueur d’onde de 365-375 nm). Lorsque le colorant bleu aniline est excité, il émet une fluorescence bleue capturée pour permettre une visualisation précise de la callose dans les tissusvégétaux 53. La quantification du callose coloré en bleu d’aniline suit une série de techniques d’imagerie qui mesurent la quantité de fluorescence provenant des tissus végétaux. La fluorescence est proportionnelle à la quantité de calclose disponible dans les tissus végétaux. La microscopie à l’épifluorescence a été utilisée pour la visualisation et la quantification du callose dans le stressbiotique 54.

Dans une étude distincte, le dépôt de callose a été déterminé à la fois par microscopie à épifluorescence et par spectrophotométried’immunofluorescence 49. Bien que quelques différences aient été observées dans les données, l’analyse statistique a largement montré une congruence entre la microscopie par épifluorescence et la spectrophotométrie d’immunofluorescence, indiquant la cohérence entre les deux méthodes de détection de callose49. Bien que les résultats des deux méthodes aient été largement congruents, il est conseillé que la microscopie à épifluorescence et la spectrophotométrie à immunofluorescence se complètent pour une évaluation plus fiable. Même si la méthode basée sur ELISA est spécifique aux calloses, sensible et fiable, elle prend initialement beaucoup de temps lors de l’optimisation du protocole et de l’obtention d’une courbe standard la plus adaptée qui correspond à toutes les concentrations et absorbances.

Certaines méthodes de quantification du callose sont laborieuses17,32,55,chronophages 26,56, non spécifiques aux calloses car le bleu d’aniline peut colorer d’autres glucanes β-1,3 en plus du callose30, nécessitent un logiciel de comptage du callosecoûteux et sophistiqué 23,24,26, nécessitent une quantité considérable de compétences techniques et la forte fréquence de fond/autofluorescence associée à la spectrophotométrie à fluorescence rend la quantification du callose difficile et peufiable 26. Les méthodes de quantification Callose basées sur un flux de travail automatisé d’analyse d’images comme le logiciel ImageJ nécessitent une formation appropriée du plug-in d’analyse d’image, comme le Trainable Weka Segmentation (TWS) pour ImageJ, ce qui est trèsencombrant 57.

Les tests basés sur la spectrophotométrie par immunofluorescence sont fortement privilégiés en raison de leur spécificité, sensibilité, facilité d’utilisation et reproductibilité. Cependant, il est important de noter que le système de détection et sa sensibilité peuvent varier selon le protocole d’analyse spécifique et l’équipement utilisé.

Ici, une nouvelle méthode de quantification du callose basée sur la spectrophotométrie d’immunofluorescence est décrite. La méthode décrite ici pourrait être appliquée à la quantification du callose dans différents tissus et espèces végétales avec un niveau satisfaisant de spécificité à la callose, une haute précision et une reproductibilité. Cette méthode s’ajoute aux différentes méthodes de quantification du callose et peut être utilisée pour surveiller les variations des niveaux de callose lors de la croissance et du développement chez les plantes ainsi qu’en réponse à divers stimuli ou traitements. De plus, l’utilisation de plaques à 96 puits réduit l’échantillonnage subjectif et l’analyse, rendant la méthode adaptée à la quantification de la callose à haut débit. Il est à noter que, bien que la callose puisse être facilement extraite des tissus végétauxfraîchement récoltés 17,27,55, l’étape de préparation de l’échantillon impliquant la lyophilisation incluse dans ce nouveau protocole offre un levier pour conserver les échantillons pendant une très longue période (jusqu’à 1 an) et permet le stockage et l’expédition d’échantillons biologiques périssables entre des laboratoires éloignés à température ambiante. Cela permet de répéter des extractions de callose sans avoir à préparer à répétition toute l’expérience pour la collecte d’échantillons frais.

La spectrophotométrie par immunofluorescence est recommandée pour les expériences de quantification à haut débit de callose tandis que la microscopie à épifluorescence et la microscopie à immunofluorescence peuvent être utilisées à la fois pour la quantification du callose et l’histolocalisation du callose dans les tissus végétaux. Pour garantir une distribution spatiotemporale précise, efficace et fiable du callose dans les tissus végétaux, il est recommandé d’utiliser simultanément différentes méthodes de quantification du callose, incluant la microscopie, la spectrophotométrie et les méthodes basées sur l’activité enzymatique. Par conséquent, cela permettra de comprendre avec précision et efficacité le rôle de la callose dans diverses réponses physiologiques et de stress. Des recherches futures pourraient évaluer de manière exhaustive et simultanée plusieurs méthodes de quantification de la calos, notamment la microscopie à épifluorescence, la microscopie à immunofluorescence, la spectrophotométrie à fluorescence, la spectrophotométrie à immunofluorescence et les méthodes basées sur l’activité enzymatique.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent ne pas avoir de conflit d’intérêts.

Remerciements

Cette recherche a été financée par la Fondation Bill & Melinda Gates, subvention numéro INV 009894/OPP1134098. Les bailleurs de fonds n’ont joué aucun rôle dans la conception de l’étude ; dans la collecte, l’analyse ou l’interprétation des données ; dans la rédaction du manuscrit ; ou dans la décision de publier les résultats.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Feuille d’aluminium   ;Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenya
Bilan analytique & nbsp ;Mettler-Toledo AG, Greifensee, SuisseML204/01
Batteur de perles 96BioSpec Products Inc., Bartlesville, OK, États-Unis1001EUR
Papier buvard   ;Kim-Fay EA Limited, Nairobi, Kenya
Albumine sérique bovine (BSA) & nbsp ;Thermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-UnisB14
Centrifugeuse, 5425REppendorf, Hambourg, Allemagne5406000240
Réfrigérateur-congélateur combiné (4 degrés ; C et &moins ; 20 & degrés C)  ;Haier Medical and Laboratory Co. Ltd., Qingda, ChineHYCD-282
Diéthanolamine  ;PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, Espagne191287
Digital Shaker, MixMateEppendorf, Hambourg, Allemagne5353000529
Phosphate d’hydrogène di-sodium (Na2HPO4)PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, Espagne141679
Plaques ELISA, 96 puits, base plate, transparente, polystyrène, haute liaisonSarstedt AG & Co. KG, Nü ; mbrecht, Allemagne82.1581.200
Filtre pour le lecteur de microplaques iMark, iMark 680, 405 nmLasec International Pty. Ltd., Le Cap, Afrique du SudBRD1681011
Lyophilisateur, VirTis&mdash ; BenchTop " K” série ; Modèle : 4KBTXLLabWrench, Canada, États-Unis448053
Acide chlorhydrique (HCl) & nbsp ;PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, Espagne141020
Incubateur à convection forcée à isothermes, IFA-54-8Groupe Esco Lifesciences, Singapour2100002
Laminarine & nbsp ;Alfa Aesar, Massachusetts, États-UnisJ66193
Tubes microcentrifuges 1,5 mL  ;Eppendorf, Hambourg, Allemagne022363204
Tubes de microcentrifuge 2 mL  ;Genesee Scientific Corp., Californie, États-Unis24&ndash ; 283
Micropipette (30&ndash ; 300 & mu ; L), 12 canaux, série 2100 & nbsp ;Eppendorf, Hambourg, AllemagneEP-12-300R
Pointes de micropipette epT.I.P.S.  ; SinglesEppendorf, Hambourg, Allemagne022363204
Micropipettes (0,5 & ndash ; 1000 & mu ; L), Recherche  ; En plusEppendorf, Hambourg, Allemagne3123000900
Lecteur d’absorption micro-plaque, iMarkBio-Rad Laboratories, Inc., Californie, États-Unis1681135EDU
Microplate Manager 6 Version 6 logiciel & nbsp ;Bio-Rad Laboratories, Inc., Californie, États-Unis1689520
ParafilmPaul Marienfeld GmbH & ; Co. KG, Lauda-Kö ; Nigshofen, Allemagne740751
Para-nitrophényl phosphate (pNPP)Merck KGaA, Darmstadt, Allemagne20-106
Mesure de pH, HI9126Hanna Instruments, Woonsocket, RI, États-Unis02310048991
Polyvinylpyrrolidone (PVP) & nbsp ;PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, EspagneA2260
Chlorure de potassium (KCl)PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, EspagneA2939
Potassium di-hydrogène phosphate (KH2PO4)  ;PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, Espagne141509
Bain marie de précision, GP10Thermo Fisher Scientific Inc., Newinton, CT, États-UnisTSGP10
Anticorps primaire (IgG souris dirigé par le glucan 1-3-&bêta ;-glucan)   ;Bio supplies Australia Pty Ltd., Melbourne, Australia400-2
Réservoirs de réactifs   ;Thermo Fisher Scientific Inc., Massachusetts, États-Unis15075
Anticorps secondaire conjugué à la phosphatase alcaline (anti-IgG-phosphatase alcaline de souris) & nbsp ;Sigma Life Sciences, New Jersey, États-UnisA5153
Azide de sodium (NaN3)  ;PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, EspagneA1430
Carbonate de sodium (Na2CO3)  ;PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, Espagne141648
Chlorure de sodium (NaCl) et nbsp ;PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, EspagneA2942
Carbonate d’hydrogène de sodium (NaHCO3)  ;PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, Espagne141638
Hydroxyde de sodium (NaOH)PanReac AppliChem ITW Réactifs, Quí ; mica SLU, Barcelone, Espagne141687.1210
Préadolescent-20Biomatik Corporation, Ontario, CanadaA4031
Eau distillée ultrapureThermo Fisher Scientific, Massachusetts, États-Unis10-977-015

Références

  1. Kelly, R., Register, E., Hsu, M. J., Kurtz, M., Nielsen, J. Isolation of a gene involved in 1,3-beta-glucan synthesis in Aspergillus nidulans and purification of the corresponding protein. J Bacteriol. 178 (15), 4381-4391 (1996).
  2. Ellinger, D., Voigt, C. A. Callose biosynthesis in arabidopsis with a focus on pathogen response: What we have learned within the last decade. Ann Bot. 114 (6), 1349-1358 (2014).
  3. Jacobs, A. K., et al. An Arabidopsis callose synthase, GSL5, is required for wound and papillary callose formation. Plant Cell. 15 (11), 2503-2513 (2003).
  4. Piršelová, B., Matušíková, I. Callose: the plant cell wall polysaccharide with multiple biological functions. Acta Physiol Plant. 35 (3), 635-644 (2013).
  5. Nedukha, O. M. Callose: Localization, functions, and synthesis in plant cells. Cytol Genet. 49 (1), 49-57 (2015).
  6. Chen, X. Y., Kim, J. Y. Callose synthesis in higher plants. Plant Signal Behav. 4 (6), 489-492 (2009).
  7. Beckman, C. H., Mueller, W. C., Tessier, B. J., Harrison, N. A. Recognition and callose deposition in response to vascular infection in Fusarium wilt-resistant or susceptible tomato plants. Physiol Plant Pathol. 20 (1), 1-10 (1982).
  8. Cheval, C., Faulkner, C. Plasmodesmal regulation during plant-pathogen interactions. New Phytol. 217 (1), 62-67 (2018).
  9. Cohen, Y., Eyal, H., Hanania, J. Ultrastructure, autofluorescence, callose deposition and lignification in susceptible and resistant muskmelon leaves infected with the powdery mildew fungus Sphaerotheca fuliginea. Physiol Mol Plant Pathol. 36 (3), 191-204 (1990).
  10. Kashyap, A., Planas-Marques, M., Capellades, M., Valls, M., Coll, N. S. Blocking intruders: inducible physico-chemical barriers against plant vascular wilt pathogens. J Exp Bot. 72 (2), 184-198 (2021).
  11. Nishimura, M. T., et al. Loss of a callose synthase results in salicylic acid-dependent disease resistance. Science. 301 (5635), 969-972 (2003).
  12. Underwood, W. The plant cell wall: A dynamic barrier against pathogen invasion. Front Plant Sci. 3, 85(2012).
  13. Wang, Y., Li, X., Fan, B., Zhu, C., Chen, Z. Regulation and function of defense-related callose deposition in plants. Int J Mol Sci. 22 (5), 2393(2021).
  14. Ali, M. A., Abbas, A., Kreil, D. P., Bohlmann, H. Overexpression of the transcription factor RAP2.6 leads to enhanced callose deposition in syncytia and enhanced resistance against the beet cyst nematode Heterodera schachtii in Arabidopsis roots. BMC Plant Biol. 13 (1), 47(2013).
  15. Böhlenius, H., Morch, S. M., Godfrey, D., Nielsen, M. E., Thordal-Christensen, H. The multivesicular body-localized GTPase ARFA1b/1c is important for callose deposition and ROR2 syntaxin-dependent preinvasive basal defense in barley. Plant Cell. 22 (11), 3831-3844 (2010).
  16. Currier, H. B., Strugger, S. Aniline blue and fluorescence microscopy of callose in bulb scales of Allium cepa L. Protoplasma. 45 (4), 552-559 (1956).
  17. Voigt, C. A., Schäfer, W., Salomon, S. A comprehensive view on organ-specific callose synthesis in wheat (Triticum aestivum L.): glucan synthase-like gene expression, callose synthase activity, callose quantification and deposition. Plant Physiol Biochem. 44 (4), 242-247 (2006).
  18. Kohari, M., Yashima, K., Desaki, Y., Shibuya, N. Quantification of stimulus-induced callose spots on plant materials. Plant Biotechnol. 33 (1), 11-17 (2016).
  19. Mason, K. N., Ekanayake, G., Heese, A. Staining and automated image quantification of callose in Arabidopsis cotyledons and leaves. Methods Cell Biol. 160, 181-199 (2020).
  20. Ellinger, D., et al. Elevated early callose deposition results in complete penetration resistance to powdery mildew in Arabidopsis. Plant Physiol. 161 (3), 1433-1444 (2013).
  21. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  22. Zavaliev, R., Epel, B. L. Imaging callose at plasmodesmata using aniline blue: quantitative confocal microscopy. Methods Mol Biol. 1217, 105-119 (2015).
  23. Luna, E., et al. Callose deposition: A multifaceted plant defense response. Mol Plant Microbe. 24 (2), 183-193 (2011).
  24. Zhou, J., Spallek, T., Faulkner, C., Robatzek, S. CalloseMeasurer: a novel software solution to measure callose deposition and recognise spreading callose patterns. Plant Methods. 8 (1), 49(2012).
  25. Kimori, Y., Baba, N., Morone, N. Extended morphological processing: a practical method for automatic spot detection of biological markers from microscopic images. BMC Bioinformatics. 11, 373(2010).
  26. Welker, S., Levy, A. Comparing machine learning and binary thresholding methods for quantification of callose deposits in the citrus phloem. Plants (Basel). 11 (5), 624(2022).
  27. Kohler, A., Schwindling, S., Conrath, U. Extraction and quantitative determination of callose from Arabidopsis leaves. Biotechniques. 28 (6), 1084-1086 (2000).
  28. Tahara, K., Norisada, M., Hogetsu, T., Kojima, K. Aluminum tolerance and aluminum-induced deposition of callose and lignin in the root tips of Melaleuca and Eucalyptus species. J For Res. 10 (4), 325-333 (2005).
  29. De Ascensao, A. R., Dubery, I. A. Panama disease: Cell wall reinforcement in banana roots in response to elicitors from Fusarium oxysporum f. sp. cubense Race Four. Phytopathology. 90 (10), 1173-1180 (2000).
  30. Smith, M. M., McCully, M. E. A critical evaluation of the specificity of aniline blue induced fluorescence. Protoplasma. 95 (3), 229-254 (1978).
  31. Herburger, K., Holzinger, A. Aniline blue and Calcofluor white staining of callose and cellulose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium. Bio Protoc. 6 (20), 1969(2016).
  32. Meikle, P. J., Boing, I., Hoogenraad, N. J., Clarke, A. E., Stone, B. A. The location of (1→3)-β-glucans in the walls of pollen tubes of Nicotiana alata using a (1→3)-β-glucan-specific monoclonal antibody. Planta. 185 (1), 1-8 (1991).
  33. Shedletzky, E., Unger, C., Delmer, D. P. A microtiter-based fluorescence assay for (1,3)-β-glucan synthases. Anal Biochem. 249 (1), 88-93 (1997).
  34. Piršelová, B., Mistrikova, V., Libantova, J., Moravcikova, J., Matusikova, I. Study on metal-triggered callose deposition in roots of maize and soybean. Biologia. 67 (4), 698-705 (2012).
  35. Siefert, F., Grossmann, K. Induction of chitinase and β-1,3-glucanase activity in sunflower suspension cells in response to an elicitor from Phytophthora megasperma f. sp. glycinea (Pmg). Evidence for regulation by ethylene and 1-aminocyclopropane-1-carboxylic acid (ACC). J Exp Botany. 48 (12), 2023-2029 (1997).
  36. Tripathi, L., Tripathi, J. N., Tushemereirwe, W. K., Bandyopadhyay, R. Development of a semi-selective medium for isolation of Xanthomonas campestris pv. musacearum from banana plants. Eur J Plant Pathol. 117 (2), 177-186 (2007).
  37. Adriko, J., et al. Molecular diagnostic tools targeting different taxonomic levels of Xanthomonads aid in disease management. Uganda J Agri Sci. 13 (2), 1-19 (2015).
  38. Ssekiwoko, F., Tushemereirwe, W. K., Batte, M., Ragama, P. E., Kumakech, A. Reaction of banana germplasm to inoculum with Xanthomonas campestris pv. musacearum. African Crop Sci J. 14 (2), 151-156 (2006).
  39. de Castro, M. D., Izquierdo, A. Lyophilization: a useful approach to the automation of analytical processes. J Automat Chem. 12 (6), 267-279 (1990).
  40. Pearson, G., Lago-Leston, A., Valente, M., Serrao, E. Simple and rapid RNA extraction from freeze-dried tissue of brown algae and seagrasses. Eur Journal Phycol. 41 (1), 97-104 (2006).
  41. Khaledi, N., Taheri, P., Falahati-Rastegar, M. Evaluation of resistance and the role of some defense responses in wheat cultivars to Fusarium head blight. J Plant Protection Res. 57 (4), 398-408 (2017).
  42. Zhang, H., et al. Transgenic Arabidopsis thaliana plants expressing a β-1,3-glucanase from sweet sorghum (Sorghum bicolor L.) show reduced callose deposition and increased tolerance to aluminium toxicity. Plant Cell Environ. 38 (6), 1178-1188 (2015).
  43. Nelson, T. E., Lewis, B. A. Separation and characterization of the soluble and insoluble components of insoluble laminaran. Carbohydr Res. 33 (1), 63-74 (1974).
  44. Zvyagintseva, T. N., et al. A new procedure for the separation of water-soluble polysaccharides from brown seaweeds. Carbohydr Res. 322 (1), 32-39 (1999).
  45. Rioux, L. E., Turgeon, S. L., Beaulieu, M. Characterization of polysaccharides extracted from brown seaweeds. Carbohydr Polymers. 69 (3), 530-537 (2007).
  46. Hosseini, S., Vazquez-Villegas, P., Rito-Palomares, M., Martinex-Chapa, S. O. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA) From A to Z. , Springer Nature. Singapore. (2017).
  47. Engvall, E., Perlmann, P. Enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Quantitative assay of immunoglobulin G. Immunochemistry. 8 (9), 871-874 (1971).
  48. Reen, D. J. Enzyme-Linked Immunosorbent Assay (ELISA). Methods Mol Biol. 32, 461-466 (1994).
  49. Mustafa, A. S., et al. Xanthomonas campestris pv. musacearum bacterial infection induces organ-specific callose and hydrogen peroxide production in banana. PhytoFrontiers. 2 (3), 202-217 (2022).
  50. Mustafa, A. S., et al. Sandwich Enzyme-Linked Immunosorbent Assay for quantification of callose. Methods Protoc. 5 (4), 54(2022).
  51. Van Weemen, B. K., Schuurs, A. H. Immunoassay using antigen-enzyme conjugates. FEBS Lett. 15 (3), 232-236 (1971).
  52. Anderson, G. L., McNellis, L. A. Enzyme-linked antibodies: A laboratory introduction to the ELISA assay. J Chemical Edu. 75 (10), 1275(1998).
  53. Stone, B. A., Evans, N. A., Boing, I., Clarke, A. E. The application of Sirofluor, a chemically defined fluorochrome from aniline blue for the histochemical detection of callose. Protoplasma. 122 (3), 191-195 (1984).
  54. Chowdhury, J., et al. Down-regulation of the glucan synthase-like 6 gene (HvGsl6) in barley leads to decreased callose accumulation and increased cell wall penetration by Blumeria graminis f. sp. hordei. New Phytol. 212 (2), 434-443 (2016).
  55. Dahiya, P., Brewin, N. J. Immunogold localization of callose and other cell wall components in pea nodule transfer cells. Protoplasma. 214 (3), 210-218 (2000).
  56. Herburger, K., Holzinger, A. Localization and quantification of callose in the streptophyte green algae Zygnema and Klebsormidium: Correlation with desiccation tolerance. Plant Cell Physiol. 56 (11), 2259-2270 (2015).
  57. Leslie, M. E., Rogers, S. W., Heese, A. Increased callose deposition in plants lacking DYNAMIN-RELATED PROTEIN 2B is dependent upon POWDERY MILDEW RESISTANT 4. Plant Signal Behav. 11 (11), 1244594(2016).

Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Quantification de la calloseanticorps sp cifiques de la callosespectrophotom trie de fluorescencemicroscopie pifluorescencetissu de cormes de bananierstress biotiquequantification haut d bit
Vidéo bientôt disponible
Contactez-nous
Recommander à la bibliothèque

Confidentialité

Conditions d'utilisation

Politiques

Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. Tous droits réservés.