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Article de méthode

Génération d’iténocytes induits dérivés de cellules souches pluripotentes via une surexpression combinée de la scléraxie et une tension uniaxiale 2D

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DOI :

10.3791/65837

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1 mars 2024

 ,  , 
1Orthopaedic Stem Cell Research Laboratory, Cedars-Sinai Medical Center, 2Board of Governors Regenerative Medicine Institute, Cedars-Sinai Medical Center, 3Department of Biomedical Sciences, Cedars-Sinai Medical Center, 4Department of Orthopedics, Cedars-Sinai Medical Center, 5Department of Surgery, Cedars-Sinai Medical Center

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit un procédé de production d’iténocytes en générant des cellules stromales mésenchymateuses dérivées d’iPSC avec une surexpression combinée de la sclérax à l’aide d’un vecteur lentiviral et d’un étirement uniaxial via un bioréacteur 2D.

Résumé

Les défis actuels en matière de réparation des tendons et des ligaments nécessitent l’identification d’un candidat approprié et efficace pour la thérapie cellulaire afin de favoriser la régénération des tendons. Les cellules stromales mésenchymateuses (CSM) ont été explorées comme une stratégie potentielle d’ingénierie tissulaire pour la réparation des tendons. Bien qu’ils soient multipotents et aient un potentiel de régénération in vivo, ils sont limités dans leur capacité d’auto-renouvellement et présentent une hétérogénéité phénotypique. Les cellules souches pluripotentes induites (CSPi) peuvent contourner ces limitations en raison de leur grande capacité d’auto-renouvellement et de leur plasticité développementale inégalée. Dans le développement des ténocytes, la sclérax (Scx) est un régulateur moléculaire direct crucial de la différenciation des tendons. De plus, il a été démontré que la mécanorégulation est un élément central guidant le développement et la cicatrisation des tendons embryonnaires. À ce titre, nous avons développé un protocole pour encapsuler l’effet synergique de la stimulation biologique et mécanique qui peut être essentiel pour générer des ténocytes. Les cellules iPS ont été induites à devenir des cellules stromales mésenchymateuses (CSMi) et ont été caractérisées avec des marqueurs de cellules stromales mésenchymateuses classiques par cytométrie en flux. Ensuite, à l’aide d’un vecteur lentiviral, les iMSCs ont été transduits pour surexprimer de manière stable SCX (iMSCSCX+). Ces cellules iMSCSCX+ peuvent ensuite être mûries en iténocytes par charge de traction uniaxiale à l’aide d’un bioréacteur 2D. Les cellules résultantes ont été caractérisées par l’observation de la régulation positive des marqueurs tendineux précoces et tardifs, ainsi que du dépôt de collagène. Cette méthode de génération d’iténocytes peut être utilisée pour aider les chercheurs à développer une source cellulaire allogénique potentiellement illimitée pour les applications de thérapie cellulaire tendineuse.

Introduction

Pour répondre aux problèmes contemporains de réparation des tendons et des ligaments, il est nécessaire de disposer d’un candidat cellulaire pertinent et adapté aux thérapies cellulaires. L’une des pistes de recherche en ingénierie tissulaire pour la réparation des tendons implique l’exploration des cellules stromales mésenchymateuses dérivées de la moelle osseuse (BM-MSC) et des cellules stromales dérivées du tissu adipeux (ASC) en tant que stratégies potentielles. Ces cellules ont une capacité multipotente, une grande abondance et un potentiel de régénération in vivo. De plus, ils ont montré une capacité de guérison accrue et de meilleurs résultats fonctionnels dans des modèles animaux1. Néanmoins, ces cellules présentent des capacités d’auto-renouvellement limitées, une diversité phénotypique et, notamment, une capacité limitée de formation de tendons. La technologie des cellules souches pluripotentes induites (CSPi) offre une solution à ces contraintes en raison de sa remarquable capacité d’auto-renouvellement et de son adaptabilité développementale inégalée. Notre équipe de recherche et d’autres chercheurs ont réussi à différencier les cellules iPS en entités stromales mésenchymateuses de type cellules (CSMi)2,3. En tant que tels, les CSMi ont le potentiel d’être une source allogénique pour les applications de thérapie cellulaire tendineuse.

La sclératie (SCX) est un facteur de transcription essentiel au développement des tendons et est considéré comme le marqueur détectable le plus précoce des ténocytes différenciés. De plus, SCX active les marqueurs de différenciation des tendons en aval, notamment le collagène 1 de la chaîne de type 1a1 (COL1a1), le mohawk (MKX) et la ténomoduline (TNMD), entre autres 4,5,6. D’autres gènes exprimés au cours de la maturation tendineuse comprennent le membre 3 de la famille des protéines favorisant la polymérisation de la tubuline (TPPP3) et le récepteur alpha du facteur de croissance dérivé des plaquettes (PDGFRa)7. Bien que ces gènes soient essentiels au développement et à la maturation des tendons, ils ne sont malheureusement pas propres au tissu tendineux et sont exprimés dans d’autres tissus musculo-squelettiques comme les os ou le cartilage 5,7.

En plus de l’expression de marqueurs au cours du développement tendineux, la mécanostimulation est un élément essentiel pour le développement et la cicatrisation des tendons embryonnaires 4,5,6. Les tendons sont mécanosensibles et leurs schémas de croissance changent en réponse à leur environnement. Au niveau moléculaire, les signaux biomécaniques affectent le développement, la maturation, le maintien et les réponses de guérison des ténocytes8. Divers systèmes de bioréacteurs ont été utilisés pour modéliser les charges physiologiques et les signaux biomécaniques. Certains de ces systèmes modèles comprennent la charge tissulaire ex vivo, les systèmes de charge cellulaire 2D appliquant une tension biaxiale ou uniaxiale, et les systèmes 3D utilisant des échafaudages et des hydrogels 9,10. Les systèmes 2D sont avantageux pour étudier les effets de la stimulation mécanique sur les gènes spécifiques des tendons ou sur la morphologie des cellules dans le contexte du destin cellulaire, tandis que les systèmes 3D peuvent reproduire plus précisément les interactions cellule-ECM 9,10.

Dans les systèmes de chargement 2D, la contrainte entre les cellules et le substrat de culture est homogène, ce qui signifie que la charge appliquée sur le cytosquelette des cellules peut être entièrement contrôlée. Par rapport à la charge biaxiale, la charge uniaxiale est plus pertinente sur le plan physiologique, car les ténocytes sont principalement soumis à une charge uniaxiale provenant de faisceaux de collagène in vivo9. On constate que lors des activités quotidiennes, les tendons sont soumis à une charge de traction uniaxiale allant jusqu’à 6% de la contrainte11. Plus précisément, des études antérieures ont montré qu’il a été démontré qu’une charge dans les plages physiologiques de 4 % à 5 % favorise la différenciation ténogénique en préservant l’expression des marqueurs liés aux tendons comme SCX et TNMD, ainsi qu’une augmentation de la production de collagène 9,10. Des souches de plus de 10 % peuvent être traumatiquement pertinentes, mais pas physiologiquement pertinentes12,13.

Ici, un protocole est présenté qui prend en compte l’effet synergique de la stimulation mécanique et biologique qui peut être essentiel pour la génération de ténocytes. Nous décrivons d’abord une méthode reproductible pour induire des CSPi dans des CSMi via une exposition à court terme des corps embryoïdes à des facteurs de croissance, confirmée par des marqueurs de surface CSM utilisant la cytométrie en flux. Nous détaillons ensuite une méthode de transduction lentivirale pour concevoir des iMSC afin qu’ils aient une surexpression stable de SCX (iMSCSCX+). Pour une maturation cellulaire plus poussée, les iMSCSCX+ sont ensemencés dans des plaques de silicone recouvertes de fibronectine et subissent un protocole de tension uniaxiale optimisé à l’aide du bioréacteur CellScale MCFX. Le potentiel ténogénique a été confirmé par l’observation de la régulation positive des marqueurs tendineux précoces et tardifs, ainsi que du dépôt de collagène14. Cette méthode de génération d’iténocytes est une preuve de concept qui peut offrir une source allogénique illimitée prête à l’emploi pour les applications de thérapie cellulaire tendineuse.

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Protocole

Ce protocole de production d’iTénocytes peut être réalisé en trois grandes étapes : iPSCs à iMSCs (10 jours), iMSC à iMSCSCX+ (2 semaines), iMSCSCX+ à iTenocytes (minimum 4 jours). Chaque étape majeure du protocole peut être mise en pause et redémarrée ultérieurement, en fonction de la chronologie expérimentale. Pour les méthodes de culture des cellules, des techniques stériles doivent être utilisées. Toutes les cellules de ce protocole doivent être cultivées à 37 °C, 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.

1. Induction de cellules iPS humaines dans les cellules stromales mésenchymateuses induites (CSMi)

  1. Préparation de l’expérience
    1. Préparer le milieu de culture Dulbecco modifié - Corps embryoïdes (IMDM-EB) d’Iscove.
      1. Compléter 50 mL de milieu basal IMDM avec 8,5 mL de sérum de remplacement knock-out, 500 μL d’acides aminés non essentiels Minimal Essential Medium (MEM), 0,385 μL (110 mM de stock) de bêta-mercaptoéthanol et 500 μL de solution antibiotique-antimycosique (SAA) (concentrations finales : 17 %, 1 %, 110 μM, 1 %, respectivement) (voir le tableau des matériaux).
    2. Préparer le milieu des cellules stromales mésenchymateuses (CSM).
      1. Complétez 440 mL de Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) à faible teneur en glucose avec 50 mL de sérum de veau fœtal (FBS), 5 mL de solution antibiotique-antimycosique (SAA) et 5 mL de L-glutamine (concentrations finales : 10 %, 1 %, 2 mM, respectivement).
    3. Préparer des plaques revêtues de poly(2-hydroxyéthylméthacrylate) (poly-HEMA).
      1. Ajouter 10 g de poly-HEMA (voir tableau des matériaux) dans un flacon stérile.
      2. Ajouter un agitateur magnétique dans le flacon et, tout en remuant, ajouter lentement 500 ml d’EtOH à 95 %.
      3. Une fois que tout l’EtOH a été ajouté, allumez le mode d’agitation à 1200 tr/min avec un feu doux supplémentaire pendant au moins 6 h. La solution poly-HEMA peut être conservée à température ambiante jusqu’à un an.
      4. Dans des conditions stériles, ajouter 2,5 μg/cm2 dans 9 mL dans un flacon T75. Ajustez le volume en fonction de la taille du récipient de culture.
      5. En maintenant la stérilité, laissez les récipients sécher à l’air libre pour que l’EtOH s’évapore complètement avant utilisation. Cela prend généralement 24-72 h.
    4. Préparez des flacons enrobés de gélatine.
      1. Lavez une bouteille en verre avec du NaOH et consacrez-la à la préparation de la gélatine. N’utilisez pas de détergent.
      2. Préparez une solution de gélatine à 1 % (5 g de gélatine et 500 mL d’eau exempte d’endotoxines). Autoclaver le flacon en verre avec la solution de gélatine pendant 30 min.
      3. Laissez refroidir la solution de gélatine et conservez-la à température ambiante.
      4. Enrober une fiole T75 de 5 mL de solution de gélatine par fiole et incuber pendant au moins 1 h avant d’ensemencer les cellules. Les flacons gélatineux peuvent être préparés 1 jour à l’avance.
    5. Préparez le tampon de tri cellulaire activé par fluorescence (FACS).
      1. Mélanger le PBS avec 2 % d’albumine sérique bovine et 0,1 % d’azoture de sodium. Conserver à 4 °C.
  2. Génération de corps embryoïdes (EBs)
    REMARQUE : Les cellules iPS doivent être cultivées dans une plaque à 6 puits et doivent atteindre une confluence de 70 % à 80 % avant utilisation.
    1. Le jour 0, apportez une plaque PCR à fond transparent 384 dans la hotte de culture tissulaire et UV pendant 15 min sans couvercle.
    2. Retirez le milieu de culture des cellules iPS (voir le tableau des matériaux) et lavez les puits avec du PBS.
    3. Ajouter 0,5 mL de réactif de dissociation cellulaire doux préchauffé (voir le tableau des matériaux) dans chaque puits et incuber pendant 5 min à 37 °C. Observez les cellules toutes les 5 minutes jusqu’à ce que les cellules iPS soient devenues des cellules individuelles ou de petits agrégats soulevés en suspension.
    4. Remise en suspension de la cellule à l’aide d’une pipette de 1 ml pour assurer une suspension à cellule unique.
    5. Centrifuger les cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    6. Retirer le surnageant, le remettre en suspension dans le milieu IMDM-EB (étape 1.1.1) et compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules.
    7. Calculer le volume approprié de suspension cellulaire nécessaire pour atteindre 5 000 à 25 000 cellules par puits de la plaque de 384 puits avec 25 μL de suspension cellulaire par puits.
      REMARQUE : Généralement, 2 à 3 puits confluents (70 % à 80 %) d’une plaque à 6 puits peuvent produire des EB dans une plaque à 384 puits. La taille des cellules par EB sera déterminée empiriquement. Pour une plaque entière de 384 puits, il faut utiliser 9,6 mL de suspension cellulaire, soit 25 μL par puits.
    8. Centrifugez à nouveau les cellules à 300 x g pendant 5 min à température ambiante.
    9. Retirer le surnageant et remettre les cellules en suspension dans un volume approprié de milieu IMDM-EB et 10 μM de chlorhydrate de Y-27632 (stock : 10 mM, 1000x, voir le tableau des matériaux) dans un tube conique pré-refroidi de 15 mL.
    10. Ajouter la matrice de la membrane basale solubilisée à froid (1 mg par plaque de 384 puits d’EB) au cône (voir le tableau des matériaux).
    11. Distribuer 25 μL de la suspension cellulaire dans chaque puits. Placez un couvercle stérile sur l’assiette et essorez à 450 x g à 4 °C pendant 7 min. Incuber à 37 °C pendant 48 h.
    12. Le jour 2, transférez les cellules sur une plaque de 100 mm avec 3 mL de milieu IMDM-EB préchauffé.
    13. Transférez les EB dans les flacons T75 à revêtement poly-HEMA dédiés avec 10 mL d’IMDM-EB. Ajustez le volume en fonction de la taille du récipient de culture. Laissez les EB pousser pendant 3 jours.
    14. Au jour 5, transvaser les EB dans les flacons T75 préparés et enrobés de gélatine avec 10 mL de milieu IMDM-EB. Ajustez le volume en fonction de la taille du récipient de culture. Cultivez les EB pendant 3 jours de plus en suspension.
    15. Le jour 8, assurez-vous que deux types d’EB sont observés : les EB qui sont attachés à la fiole et les EB non attachés. Lavez les EB non attachés de la fiole avec du PBS.
    16. Aux EB attachés, ajouter le milieu IMDM-EB complété par le TGFβ-1 (10 ng/mL) (voir le tableau des matériaux) et les laisser croître pendant 2 jours.
    17. Le jour 10, changez le support en support MSC. Les cellules doivent être nourries deux fois par semaine. Une fois que 70 % de la confluence est effectuée, passez au « protocole standard des cellules de levage » pour replaquer les cellules. Replaquer les cellules sur des plaques enrobées de gélatine.
  3. Protocole standard des cellules de levage
    1. Une fois que les cellules adhérentes ont atteint 70 % de confluence, aspirez le milieu de culture des plaques et lavez-les avec du PBS.
    2. Soulever les cellules en ajoutant 5 mL de trypsine préchauffée à 0,25 % dans chaque plaque de 150 mm et incuber pendant 5 min à 37 °C. Ajustez le volume de trypsine en fonction de la taille du récipient de culture.
    3. Au microscope, vérifiez que la plupart des cellules ont été soulevées de chaque plaque. S’il y a encore des cellules attachées, tapotez doucement les côtés des plaques pour déloger les cellules.
    4. Recueillir les cellules dans un tube conique en ajoutant le double du volume du milieu de culture préchauffé.
    5. Centrifuger les cellules à température ambiante pendant 5 min à 300 x g. Retirez le surnageant et passez aux étapes suivantes.
  4. Évaluation par cytométrie en flux de l’expression des marqueurs MSC
    REMARQUE : Les CSM humaines, comme les CSM de moelle osseuse, doivent être utilisées comme témoin positif.
    1. Effectuez le « Protocole standard des cellules de levage » (étape 1.3).
    2. Remettre le surnageant en suspension avec 3 mL de tampon FACS et transférer tout le volume dans des tubes FACS.
    3. Centrifuger à température ambiante pendant 5 min à 300 x g. Répétez l’étape de lavage avec le tampon FACS deux fois de plus.
    4. Ajouter 2 μL de CD90-FITC antihumain chez la souris, de CD44-APC antihumain chez la souris et de CD105-PE antihumain (voir le tableau des matériaux) et incuber pendant 45 min à 4 °C.
    5. Ajouter 20 μL d’IgG2a-FITC de souris, d’IgG1-PB de souris et d’IgG1-PE de souris (voir le tableau des matériaux).
    6. Incuber à l’obscurité à 4 °C pendant 15 min. Laver tous les tubes en ajoutant 3 mL de tampon FACS et en centrifugeant pendant 5 min à 300 x g (à température ambiante). Remettre les cellules en suspension dans 250 μL de tampon FACS pour chaque tube.
    7. Analyser l’expression des marqueurs de surface des CSM à l’aide de la cytométrie en flux14. Les longueurs d’onde d’excitation et d’émission doivent être : CD90-FITC, pic d’excitation à 495 nm et pic d’émission à 519 nm ; CD44-APC, pic d’excitation à 640 et pic d’émission à 660 nm ; CD105-PE, pic d’excitation à 561 nm et pic d’émission à 574 nm.

2. Passage et extension d’iMSC

  1. Préparation des réactifs
    1. Préparez le support de congélation MSC.
      1. Combinez 30 mL de DMEM à faible teneur en glucose, 5 mL de DMSO et 15 mL de FBS (concentrations finales : 60 %, 10 %, 30 %, respectivement).
      2. Filtrez la solution à l’aide d’un filtre stérile de 0,45 μm. Conserver à 4 °C.
  2. Passage
    REMARQUE : Après l’induction, les CSMi doivent être cultivées sur des plaques recouvertes de gélatine pendant 2 passages supplémentaires avant d’être sevrées pour se développer sur des plaques de culture de tissus en plastique. De plus, les cellules doivent être traversées avec un rapport de division de 1 :3 lorsqu’elles sont confluentes à 70 %.
    1. Effectuez le « Protocole standard des cellules de levage » (étape 1.3).
    2. Remettre les cellules en suspension dans des milieux MSC et les répartir uniformément dans trois nouvelles plaques de 150 mm de flacons T175 avec 20 mL de milieu par flacon. Remettez les cellules à 37 °C.
    3. Nourrissez les cellules deux fois par semaine en remplaçant le milieu de culture par un milieu MSC préchauffé.
  3. Congélation
    1. Effectuez le « Protocole standard de levage des cellules ».
    2. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de milieu de congélation MSC. Ajouter 1 mL de suspension cellulaire dans un cryoflacon et conserver dans un récipient de congélation pendant 24 h à -80 °C avant de transférer à l’azote liquide pour un stockage à long terme.
  4. Décongélation
    1. Préparer 10 mL de média MSC préchauffé dans un tube conique de 15 mL.
    2. Récupérez le cryoflacon, plongez-le dans un bain-marie à 37 °C et remuez jusqu’à ce qu’il reste une boule de glace de la taille d’un pois (environ 1 à 2 minutes).
    3. Dans la hotte de culture cellulaire, ajoutez lentement 1 mL du milieu préchauffé dans le cryoflacon et pipetez de haut en bas pour mélanger.
    4. Transférer la suspension cellulaire du flacon cryogénique dans le tube conique préparé de 15 mL avec un milieu préchauffé et centrifuger pendant 5 min à 300 x g (à température ambiante).
    5. Retirez le surnageant et remettez-le en suspension avec un support frais. Ajouter la suspension cellulaire dans une plaque de 150 mm d’un volume total de 20 mL. Ajustez le volume en fonction de la taille du flacon de culture.
    6. Incubez les cellules à 37 °C jusqu’au moment de les diviser.

3. Génie génétique des CSMi pour surexprimer SCX à l’aide de la transduction lentivirale

REMARQUE : Cette section du protocole prend deux semaines.

  1. Préparation des milieux et des réactifs
    1. Préparez les milieux cellulaires HEK293T/17.
      1. Complétez 445 mL de milieu minimum essentiel (EMEM) d’Eagle avec 50 mL de FBS et 5 mL d’AAS (concentrations finales : 10 %, 1 %, respectivement).
    2. Préparez les supports d’emballage MSC.
      1. Préparez le sérum inactivé par la chaleur en chauffant 50 mL de FBS à température ambiante dans un bain-marie à 60 °C pendant 30 min.
      2. Combinez 445 mL de DMEM à faible teneur en glucose avec le FBS inactivé par la chaleur et 5 mL de L-glutamine (concentrations finales : 10 %, 2 mM, respectivement).
    3. Préparer le complexe de transfection.
      1. Permettre la décongélation des composants complexes de transfection (voir le tableau des matériaux) sur la glace : conditionnement des plasmides VSV-G et Delta, plasmide SCX et BioT15,16.
      2. Tourbillonnez doucement et faites tourner les plasmides. Mesurez les concentrations d’ADN.
      3. Sur la base des concentrations d’ADN et du nombre de flacons destinés à la transfection, calculez le volume de chaque composant nécessaire : pour un flacon T75, le complexe de transfection sera constitué de 750 μL de milieu sans sérum (comme le DMEM ou le PBS sans sérum), de 7,5 μg de plasmide SCX, de 0,75 μg de plasmide VSV-G, de 6,75 μg de plasmide Delta et de 22,5 μL de BioT. Pensez à un supplément pour l’erreur de pipetage.
      4. Mélangez en pipetant doucement de haut en bas. Essorer brièvement dans une centrifugeuse. Incuber à température ambiante pendant 15 min et utiliser immédiatement.
  2. Transfection et production de lentiviraux
    ATTENTION : À partir du jour 3, le protocole implique de travailler avec des lentivirus, et par conséquent, le travail doit être effectué en utilisant des procédures opérationnelles de niveau de confinement 2+. Les travailleurs doivent porter de l’équipement de protection individuelle, y compris deux couches de gants, des couvre-poignets, des lunettes de sécurité, un masque, des pantalons longs et des chaussures fermées. Tous les déchets et matériaux, y compris les pointes de pipette, les flacons et le milieu liquide, doivent être décontaminés avec de l’eau de Javel (hypochlorite de sodium final à 1 %) pendant au moins 20 minutes. N’utilisez pas l’aspirateur.
    1. Graine HEK293T/17 cellules.
      1. Environ 18 à 24 h avant la transfection (jour 0), soulevez et plaquez les cellules 293T dans des flacons T75. Les volumes suivants supposent que T75 est le récipient de culture. Ajustez le volume en fonction du récipient de culture cellulaire utilisé.
      2. Retirer le milieu de culture des flacons et laver avec 5 mL de PBS.
        REMARQUE : Les cellules se soulèvent très facilement de la surface du flacon. Ajouter du PBS sur le côté de la fiole et éviter l’ajout direct de solution aux cellules.
      3. Ajouter 3 mL de trypsine préchauffée à 0,25 % dans chaque flacon et incuber à 37 °C pendant 5 min. Recueillir les cellules dans un tube conique et centrifuger à température ambiante pendant 5 min à 300 x g.
      4. Retirez le surnageant, remettez-le en suspension dans un milieu 293T et comptez les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules.
      5. Plaquer les cellules à 5,3 x 104 cellules/cm2 et incuber à 37 °C pendant la nuit.
      6. Le lendemain (jour 1), préparez le complexe de transfection. Remplacer le milieu de culture des cellules par 5 mL de milieu d’emballage en lenti MSC préchauffé (étape 3.1.2).
      7. Ajouter le complexe de transfection goutte à goutte aux cellules. Inclinez doucement la boîte pour assurer une exposition uniforme du complexe de transfection aux cellules. Remettez les cellules dans l’incubateur pendant 48 h.
        NOTA : La toxicité doit être observée après 24 h (jour 2).
      8. Après 48 h (jour 3), prélever soigneusement le milieu contenant le virus dans un tube conique séparé à l’aide d’une pipette et centrifuger pendant 5 min à 300 x g (à température ambiante).
      9. Ajouter 5 mL de milieu d’emballage lenti MSC préchauffé dans le flacon T75 de cellules 293T et remettre dans l’incubateur pendant la nuit.
      10. Après centrifugation, filtrer le surnageant à l’aide d’un filtre stérile de 0,45 μm en pipetant directement le surnageant à travers le filtre. Conservez le milieu contenant le virus à 4 °C pendant la nuit.
      11. Après 24 h supplémentaires (jour 4), collectez à nouveau soigneusement le milieu contenant le virus dans un tube conique séparé à l’aide d’une pipette et centrifugez pendant 5 min à 300 x g (à température ambiante).
      12. Combinez le virus avec le virus du jour de prélèvement précédent et mélangez pour obtenir une solution homogène. À ce stade, le protocole peut être mis en pause et redémarré ultérieurement, en fonction de la chronologie expérimentale. Le lentivirus peut être aliquote et congelé à -80 °C, ou le lentivirus peut être stocké sur de la glace tout en procédant à la « Transduction des iMSCs avec SCX » (étape 3.3).
        REMARQUE : Une fois que les aliquotes de lentivirus sont congelées et décongelées, ne les recongelez pas.
  3. Transduction d’iMSCs avec SCX
    1. Effectuer la transduction de la plaque de titre.
      1. Le jour 0, effectuez le « Protocole standard de levage des cellules ».
      2. Remettre les cellules en suspension dans un milieu MSC et compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules.
      3. Dans une assiette à 6 puits, ajouter 4 x 103 cellules/cm2. Replaquer le reste dans une plaque supplémentaire de 150 mm avec 20 mL de média MSC (il s’agira de la plaque de contrôle). Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C.
      4. Le lendemain (jour 1), les cellules devraient être confluentes à ~40%. Préchauffer le milieu de culture de lenti-packaging et décongeler le polybrène et environ 3 mL de lentivirus sur de la glace (ou si cela est fait le même jour que la collecte du virus, conserver sur de la glace jusqu’à utilisation).
      5. Ajouter le milieu de croissance à enti et le lentivirus dans les puits en fonction des titres désirés (c.-à-d. 12,5 %, 25 %, 50 %, 75 %, 100 %). Ajouter 0,5 μL de polybrène pour obtenir une concentration finale de 5 μg/mL (concentration de base : 10 mg/mL, voir le tableau des matériaux).
      6. Faites tourner la plaque pour assurer une exposition uniforme à toutes les cellules. Remettez la plaque dans l’incubateur à 37 °C pendant 48 h.
    2. Évaluez l’efficacité du titre de lentivirus SCX par cytométrie en flux.
      1. Après 48 h, effectuez le « Protocole standard des cellules de levage ».
      2. Remettre les cellules en suspension dans le PBS et compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules. Centrifuger les cellules à température ambiante pendant 5 min à 300 x g.
      3. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans 3 mL de tampon FACS pour le laver. Transférez la suspension cellulaire dans des tubes de cytométrie en flux et centrifugez pendant 5 min à 300 x g.
      4. Répétez le lavage du tampon FACS deux fois de plus et remettez en suspension les pastilles cellulaires finales dans 300 μL de tampon FACS. Évaluer l’expression de la GFP pour chaque titre à l’aide d’un appareil de cytométrie en flux.
      5. Sur la base des titres et du nombre de viabilités cellulaires, déterminez le titre de lentivirus approprié pour procéder à la transduction. À ce stade, le protocole peut être mis en pause et redémarré ultérieurement, en fonction de la chronologie expérimentale.
    3. Effectuez une transduction SCX à grande échelle.
      REMARQUE : Les volumes indiqués sont par 1x plaque de 150 mm ou 1x flacon T175. Cela peut être ajusté en conséquence en fonction de la taille du vaisseau souhaité et de l’échelle de transduction.
      1. Le jour 0, effectuez le « Protocole standard de levage des cellules ».
      2. Remettre les cellules en suspension dans un milieu MSC et compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules. Ensemencer les cellules à 4 x 103 cellules/cm2. Incuber les cellules pendant 24 h à 37 °C.
      3. Le lendemain (jour 1), les cellules devraient être confluentes à ~40%. Préchauffer le milieu de culture de lenti-packaging et décongeler le polybrène et la quantité précalculée de lentivirus sur de la glace.
      4. Sur la base du titre décidé, ajoutez la quantité désirée de milieu de culture et de lentivirus dans les puits. Ajouter 5 μg/mL de polybrène (concentration de base : 10 mg/mL).
      5. Le jour 3, observez les cellules au microscope à fluorescence. L’iMSCSCX+ nouvellement produit devrait être fluorescent GFP. Remplacez le milieu contenant le virus par un milieu MSC préchauffé. À ce stade, le protocole peut être mis en pause et redémarré ultérieurement, en fonction de la chronologie expérimentale.

4. Transmission et extension d’iMSCSCX+

  1. Effectuez le passage, l’expansion, le gel et la décongélation de l’iMSCSCX+ de la même manière que pour les iMSC, comme décrit à l’étape 2 du protocole.

5. Chargement mécanique

REMARQUE : Cette section prend un minimum de 4 jours, mais peut être plus longue selon que la contraction cellulaire est observée ou non.

  1. Préparation de l’expérience
    1. Préparez les plaques en silicone.
      1. Autoclave 2 plaques de silicone (voir tableau des matériaux). Ensuite, dans des conditions stériles, retirez les plaques de silicone du sac de l’autoclave et placez-les dans des plaques de 150 mm.
      2. Combiner 130 μL de fibronectine (100x, voir le tableau des matériaux) avec 13 mL de PBS stérile dans un tube conique de 15 mL. Retournez le tube plusieurs fois pour mélanger.
      3. Ajouter 400 μL de solution de fibronectine dans chaque puits des plaques de silicone. Incuber les plaques à 37 °C pendant au moins 2 h ou toute la nuit.
      4. Avant utilisation, aspirez la solution de fibronectine et laissez les plaques sécher à l’air libre dans la hotte de culture cellulaire pendant au moins 30 minutes pour laisser la solution de fibronectine s’évaporer complètement.
        REMARQUE : La solution de fibronectine peut être retirée des puits à l’avance, et les plaques maintenant revêtues peuvent rester à 37 °C jusqu’à quelques semaines jusqu’à l’utilisation.
    2. Préparez le support étirable MSC.
      1. Préparer le milieu étirable MSC en ajoutant 140 μL d’acide ascorbique (stock : 100x, concentration finale : 50 μg/mL) à 14 mL de média MSC préchauffé dans un tube conique de 15 mL.
        REMARQUE : L’acide ascorbique doit être ajouté frais au milieu MSC avant chaque changement de milieu.
  2. Ensemencement de l’iMSCSCX+ dans les plaques de silicone
    1. Effectuez le « Protocole standard des cellules de levage » (étape 1.3).
    2. Remettre les cellules en suspension dans un milieu MSC et compter les cellules viables à l’aide d’un hémocytomètre ou d’un compteur de cellules.
    3. Calculer le volume de suspension cellulaire nécessaire pour obtenir 1,25 x 104 cellules/cm2.
    4. Retirez ce volume de média étirable MSC du tube conique de 15 mL. Ajoutez les cellules cibles. Inverser à l’homogène la nouvelle suspension cellulaire.
    5. Ajoutez 400 μL de la nouvelle suspension cellulaire à chaque puits des deux plaques de silicone.
    6. Remettez le couvercle sur les plaques de 150 mm et remettez-les dans l’incubateur à 37 °C pendant 24 h.
  3. Tension uniaxiale
    1. Le lendemain, rincez l’appareil d’étirement (voir tableau des matériaux) avec du ddH2O suivi de 70 % d’éthanol. Essuyez l’appareil, placez-le dans la hotte de culture cellulaire et faites des UV pendant 15 minutes.
    2. Récupérez les plaques ensemencées et vérifiez que les puits sont bien fixés aux cellules.
    3. Laissez une plaque dans l’incubateur (contrôle statique) et placez la plaque de silicone de deuxième graine dans l’appareil d’étirement en alignant les vis avec les trous de la plaque de silicone. Replacez le couvercle de l’appareil pour assurer la stérilité.
    4. Fixez l’appareil avec la plaque de silicone ensemencée à la source électronique (voir tableau des matériaux) et placez-le dans l’incubateur à 37 °C.
    5. Au programme, réglez le protocole d’étirement cyclique sur une contrainte sinusoïdale de 4 %, 0,5 Hz, 2 h par jour. Commencez l’étirement en appuyant une fois sur le bouton de démarrage . Les étirements doivent commencer immédiatement.
    6. Étirez les cellules pendant au moins 3 jours. Surveillez les cellules quotidiennement et arrêtez le protocole d’étirement si une contraction cellulaire peut être observée. Changez le support pour un nouveau support étirable MSC tous les deux jours.

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Résultats

Différenciation des cellules iPS humaines par rapport aux cellules iMS
Comme décrit précédemment, le protocole actuel pour différencier les cellules iPS en CSMi implique la formation de corps embryoïdes2. Ce processus prend environ dix jours pour induire des CSMi à partir de CSPi (Figure 1A). Cependant, il est fortement recommandé de passer les iMSC nouvellement générés au moins deux fois. Cela permet non seulement d’éliminer le besoin de plaques r...

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Discussion

Dans ce protocole, les iTénocytes sont générés par trois étapes principales : (1) l’induction des CSPi en CSMi, (2) la surexpression de SCX à l’aide d’un vecteur lentiviral, et (3) la maturation des cellules par tension uniaxiale 2D.

Le protocole présenté pour différencier les CSPi en CSPi a déjà été décrit par notre groupe2. Depuis cette publication, de nombreux protocoles ont été développés, y compris un protocole établi pour l’utilisation des CSMi dans les essais cli...

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Déclarations de divulgation

Tous les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Cette étude a été partiellement financée par le NIH/NIAMS K01AR071512 et CIRM DISC0-14350 à Dmitriy Sheyn. Les deux plasmides d’emballage de lentivirus ont été offerts par le laboratoire Simon Knott (Département des sciences biomédicales, Centre médical Cedars-Sinai).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
2-mercaptoéthanol  ;Sigma AldrichM3148
AccutaseStemCell Technologies7920réactif de dissociation cellulaire
Solution antibiotique-antimycosiqueThermofisher15240096
Anti-CD105Ancell326-050
Souris APC anti-humaine CD44BD Biosciences559942
Souris APC Contrôle des isotypesBD Biosciences555745
BenchMark sérum fœtal bovinGeminiBio100-106
BiglycaneThermofisherHs00959143_m1
Albumine sérique bovineMillipore SigmaA3733
Collagène type I alpha 1 chaîne humaine Taqman amorceThermofisherHs00164004_m1
Collagène type III alpha 1 chaîne humaine Taqman amorceThermofisherHs00943809_m1
Dimethyl sulfoxideMillipore SigmaD8418
DMEM, faible teneur en glucose, pyruvate, sans glutamine, sans rouge de phénolThermofisher11054020
Eagle’s minimum essential medium (EMEM)ATCC30-2003
Fibronectine plasma bovinSigma AldrichF1141
FITC souris anti-humaine CD90BD Biosciences555595
Gélatine de peau porcineSigma AldrichG1890
Chèvre anti souris IgG1-PEBio-RadSTAR117
HEK 293T/17ATCCCRL-11268
IMDM, sans rouge de phénolThermofisher21056023
iPSC : 83i-cntr-33n1Cedars-Sinai iPSC PlateformeN/Ahttps://biomanufacturing.cedars-sinai.org/product/cs83ictr-33nxx/
Contrôle des isotypes Anticorps de souris IgG2a-FITCMiltenyi Biotec130-113-271
KnockOut sérum de remplacementThermofisher10828010
Acide L-ascorbiqueSigma AldrichA4544
L-GlutamineThermofisher2503081
MatrigelCorning354230matrice de membrane basale
MechanoCulture FXCellScaleN/Aappareil d’étirement
MEM solution d’acides aminés non essentielsThermofisher11140050
Mohawk humain Taqman amorceThermofisherHs00543190_m1
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276
PBSThermofisher10010023
Récepteur du facteur de croissance dérivé des plaquettes Une amorce Taqman humaineThermofisherHs00998018_m1
Poly(2-hydroxyethyl méthacrylate)Sigma Aldrich192066
Polybrene réactifs d’infection/transfectionMillipore SigmaTR-1003
Recombinant humain  ; TGF-bêta 1 protéine humaine Amorce TaqmanRnD Systems240-B
Sclérosaxe humaine Amorce TaqmanThermofisherHs03054634_g1
SCXA (SCX) (NM_00108050514) humain étiqueté ORFOriGeneRC224305L4
Plaques de siliconeCellScaleN/A
Azoture de sodiumMillipore SigmaS2002
Tenascin C amorce Taqman humaineThermofisherHs00370384_m1
Tenomodulin amorce Taqman humaineThermofisherHs00223332_m1
Thrombospondin 4 amorce Taqman humaineThermofisherHs00170261_m1
réactif de transfection, BioTBioland Scientific LLCB01-01
Trypsine-EDTA (0,25 %)Thermofisher25200072
Protéine favorisant la polymérisation de la tubuline membre de la famille 3ThermofisherHs03043892_m1
dichlorhydrate Y-27632Biogems1293823
clone

Références

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