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Article de méthode

Modèle d’ischémie-reperfusion rénale bilatérale pour l’insuffisance rénale aiguë chez la souris

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DOI :

10.3791/65838

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2 février 2024

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1Kidney Disease Center, the First Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine, 2International Institute of Medicine, The Fourth Affiliated Hospital, Zhejiang University School of Medicine

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Le modèle d’ischémie-reperfusion (IRI) peut être utilisé à différents stades du développement de l’insuffisance rénale aiguë (IRA), en particulier au cours de la progression de l’IRA vers la progression de l’insuffisance rénale chronique (IRC). Ici, nous décrivons la procédure de développement d’un modèle IRI chez la souris via une approche trans-abdominale, en clampant les pédicules rénaux via un clip vasculaire pour induire une lésion ischémique.

Résumé

L’insuffisance rénale aiguë (IRA) est définie comme un déclin rapide de la fonction rénale, dans lequel un dysfonctionnement rénal persistant évolue progressivement vers une maladie rénale chronique (IRC) en raison de la perte irréversible des néphrons et de leur réparation inadaptée. Au cours des dernières années, l’incidence de l’IRA a augmenté concernant diverses étiologies, notamment l’épuisement volémique, la septicémie, la néphrotoxicité, les lésions musculaires et les traumatismes majeurs, dans lesquels les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI) représentent la plupart des épisodes. Le développement du modèle IRI chez la souris est induit par le clampage chirurgical des pédicules rénaux, qui fournit des outils puissants et contrôlables pour les modèles précliniques d’IRA. Il est important de noter que le modèle IRI est déployé à différentes étapes du développement de l’IRA, en particulier dans les processus de l’IRA à l’IRC. Bien que le modèle IRI soit largement pratiqué dans de nombreux laboratoires, une série de variables influencent encore les résultats de ce modèle. Ici, nous décrivons la procédure de développement du modèle IRI afin de fournir une méthode reproductible et fiable aux chercheurs pour explorer la pathogenèse sous-jacente dans le développement de l’IRA et la progression de l’IRA vers l’IRC.

Introduction

L’insuffisance rénale aiguë (IRA) est un syndrome clinique grave avec une morbidité et une mortalité importantes, défini comme une augmentation de la créatinine sérique de ≥ 0,3 mg/dL (26,5 μM/L) dans les 48 heures ou une augmentation de la créatinine sérique jusqu’à ≥ 1,5 fois la valeur initiale dans les 7 jours, ou un volume urinaire < 0,5 mL/kg/h pendant 6 h1, 2,3. Malgré des décennies de recherche, il n’existe pas de traitement efficace pour atténuer les lésions rénales ou accélérer la récupération rénale, et une proportion considérable de patients atteints d’IRA évolue vers une maladie rénale chronique (IRC)4,5,6. Des molécules et des voies complexes sont impliquées en partie dans l’IRA et sa progression, de sorte que les modèles précliniques fournissent des outils puissants pour démêler ces complexités afin de développer des modalités thérapeutiques efficaces.

Cliniquement, les lésions d’ischémie-reperfusion (IRI) sont la principale cause d’IRA dans diverses conditions, notamment les chirurgies cardiaques et hépatiques, les chocs circulatoires, la déplétion volémique, la septicémie, l’occlusion ou l’obstruction vasculaire rénale, la transplantation rénale, etc. 7. Le modèle de souris IRI-AKI est utilisé depuis les années 1960 ; Ce modèle a été développé par clampage chirurgical des pédicules rénaux avec des clamps non traumatiques chez la souris conduisant à une ischémie et suivi d’une reperfusion du flux sanguin rénal en retirant les clamps. Le modèle IRI-AKI est généralement caractérisé par la mort tubulaire rénale et des lésions progressives du tissu rénal. L’IRI est l’un des modèles les plus couramment utilisés pour la pathogenèse et l’intervention thérapeutique dans l’IRA pour plusieurs raisons : (1) La simplicité et la sécurité de l’intervention chirurgicale améliorent le taux de survie et le taux de réussite du modèle IRI-AKI8 ; (2) Étant donné que l’ischémie est une étiologie majeure de l’IRA humaine, le modèle IRI-IRA est mieux utilisé pour évaluer l’événement cliniqued’IRA 9 ; (3) Le modèle IRI pourrait présenter des lésions rénales et des changements histopathologiques à différents stades de l’IRA, ce qui s’applique également à l’étude de la progression de l’IRA à l’IRC10. Selon le plan expérimental, les modèles d’IRA induits par l’IRI comprennent l’IRA bilatéral, l’IRI unilatéral avec rein controlatéral intact et l’IRI unilatéral avec néphrectomie controlatérale simultanée. Notamment, le modèle IRI bilatéral est considéré comme plus pertinent pour les conditions pathologiques humaines de l’IRA parce que les deux reins ont été affectés par l’approvisionnement en sang11. Le modèle IRI est applicable pour simuler les effets d’une réduction du débit sanguin rénal après une transplantation rénale, un pontage cardiaque, une chirurgie vasculaire rénale ou une chirurgie de conservation du néphron, ainsi que dans le cadre d’une hypotension9. Ici, nous décrivons la procédure d’un modèle IRI bilatéral afin de fournir une méthode cohérente et fiable aux chercheurs pour explorer la pathogenèse sous-jacente de l’IRA induite par l’ischémie.

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Protocole

Des souris C57BL/6J mâles âgées de 8 semaines et pesant 25 g ont été utilisées pour établir le modèle d’IRA par ischémie-reperfusion bilatérale. Selon les études précédentes, nous maintenons la température corporelle à environ 36,5 °C-37 °C, et la durée de l’ischémie rénale est de 30 min dans la chirurgie IRI12,13. Au total, 6 souris étaient nécessaires pour chaque groupe, et des souris simulées servaient de témoins. Les expériences sur les animaux de cette étude ont été approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux (IACUC) de l’Université du Zhejiang afin de protéger le bien-être des animaux. Toutes les procédures de recherche sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives et principes éthiques de l’Université du Zhejiang.

1. Préparation préopératoire

  1. Stérilisez à haute pression tous les instruments chirurgicaux.
  2. Préparez la solution anesthésique en ajoutant 2 ml de kétamine et 0,4 ml de xylazine dans 7,6 ml de solution saline stérile. Anesthésier la souris avec un mélange de kétamine (80 mg/kg) et de xylazine (16 mg/kg) par injection intrapéritonéale. Évaluez la profondeur de l’anesthésie à l’aide du réflexe de pincement des orteils.
  3. Placez la souris anesthésiée sur la couverture homéotherme pour vous assurer que ses voies respiratoires ne sont pas obstruées. Maintenez la température corporelle dans la plage de 36,5 à 37 °C.
  4. Couvrez les yeux de la souris avec une pommade oculaire au chlorhydrate de tétracycline à 1 % pour prévenir la sécheresse sous anesthésie.
  5. Rasez les poils de l’abdomen avec une tondeuse à cheveux et nettoyez la peau de la zone chirurgicale avec une solution de povidone iodée pendant 3x.

2. Chirurgie

  1. Faites une incision abdominale médiane d’environ 1 à 1,5 cm avec des ciseaux chirurgicaux à travers la peau et la couche musculaire et ouvrez la cavité abdominale avec un écarteur.
  2. Exposez le rein en déplaçant la graisse rétropéritonéale et en poussant les intestins et autres organes vers l’extérieur avec un coton-tige. Le rein est situé dans l’espace rétropéritonéal, à environ 0,5 cm latéralement de la colonne vertébrale et en dessous de la 13e côte.
  3. Disséquez le pédicule rénal à l’aide d’une pince fine et pointue pour séparer et retirer le fascia et le tissu adipeux et exposer les pédicules rénaux gauches.
  4. Clampez les pédicules rénaux à l’aide d’un clip vasculaire à l’aide d’une pince de maintien et assurez-vous que les lésions vasculaires sont aussi mineures que possible. Évitez de clamper la graisse redondante du sinus rénal, ce qui pourrait entraîner une ischémie rénale incomplète.
  5. Réglez la durée de l’ischémie rénale, en commençant par un clampage de 30 min. La caractéristique d’une ischémie réussie est que le rein passe progressivement du rouge au violet foncé en quelques minutes.
  6. Déplacez le rein dans l’espace rétropéritonéal. Répétez la procédure du côté controlatéral pour exposer et clamper les pédicules rénaux droits.
  7. Notez le temps d’ischémie de chaque côté séparément pour vous assurer que les deux reins reçoivent la durée exacte de l’ischémie. Rouvrez l’incision et relâchez le clip vasculaire à la fin de la durée de l’ischémie.
  8. Replacez le rein dans l’espace rétropéritonéal, puis suturez le muscle et la peau couche par couche avec la suture Vicryl 4-0.
    REMARQUE : Les procédures chirurgicales doivent être effectuées dans des conditions stériles. Nettoyez la table et les instruments chirurgicaux avec de l’éthanol à 75 % pendant le fonctionnement si nécessaire.

3. Soins postopératoires

  1. Administrer 0,5 à 1 mL de solution saline chaude et stérile par injection intrapéritonéale pour compenser la perte de liquide.
  2. Maintenez la position couchée sternale avec attention jusqu’à ce que la souris ait repris suffisamment de conscience. Mettez la souris sur la couverture homéothermique jusqu’à ce qu’elle reprenne pleinement conscience, puis retournez dans sa cage. Ne remettez pas la souris en compagnie d’autres animaux avant d’être complètement rétablie.
  3. Donnez de la buprénorphine 0,05-0,10 mg/kg toutes les 12 h pendant les 3 premiers jours pour soulager la douleur post-chirurgicale. Surveillez les souris chirurgicales tous les jours.

4. Évaluation du modèle

  1. Coloration à l’hématoxyline-éosine (HE)
    1. Euthanasier les animaux à l’aide de pentobarbital sodique par injection intrapéritonéale les jours 1, 3, 7 ou 14 après l’IRI.
    2. Fixez les tissus rénaux frais avec 4 % de paraformaldéhyde (PFA) pendant la nuit et stockez-les dans de l’éthanol à 75 % à 4 °C.
    3. Après déshydratation et enrobage, coupez les échantillons obtenus en 8 μm d’épaisseur pour la coloration.
    4. Déparaffiné les sections de tissu dans du xylène, puis réhydratez-le avec des concentrations décroissantes d’éthanol.
    5. Teindre les coupes de tissus avec de l’hématoxyline et de l’éosine.
    6. Déshydratez les sections de tissus en augmentant les concentrations d’éthanol et de xylène.
  2. Dosage de la fonction rénale
    1. Prélevez des échantillons de sang à l’aide de la méthode de prélèvement de sang dans le globe oculaire après l’anesthésie.
    2. Centrifuger les échantillons de sang à 12000 x g pendant 10 min pour séparer le sérum.
    3. Déterminez la créatinine sérique et l’azote uréique du sang (BUN) à l’aide de l’analyseur automatique de chimie sèche pour surveiller la fonction rénale.
  3. PCR en temps réel (RT-PCR)
    1. Extrayez l’ARN total des tissus rénaux à l’aide d’un kit d’extraction rapide d’ARN, puis synthétisez l’ADNc avec un kit de mélange de transcriptase inverse. Effectuez une RT-PCR avec le kit de prémélange SYBR Green et exécutez-la sur un instrument RT-PCR. Les séquences d’amorces utilisées ici ont été rapportées avant14 : KIM1 en avant, 5'-GCTGCTACTGCTCCTTGTGA-3' ; revers 5'-GGAAGGCAACCACGCTTAGA-3' ; NGAL avant, 5'-GGCCAGTTCACTCTGGGAAA-3 ; revers 5'- TGGCGAACTGGTTGTAGTCC-3' ; GAPDH en avant, 5'-GGTGAAGGTCGGTGTGAACG-3' ; inversé 5'-CTCGCTCCTGGAAGATGGTG-3'.

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Résultats

État du rein pendant la chirurgie

La caractéristique d’une ischémie réussie est que le rein passe progressivement du rouge au violet foncé en 1 à 2 minutes, et la reperfusion réussie se caractérise par le fait que le rein passe progressivement du violet foncé au rouge en 1 à 2 minutes.

Histologie du rein après la chirurgie

L’EH et la coloration périodique à l’acide Schiff (PAS) sont les moyens directs de ...

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Discussion

Dans cet article, nous avons fourni une procédure détaillée sur le modèle IRI rénal, soulignant par la suite qu’il s’agit d’un modèle robuste pour la progression de l’IRA et de l’IRA vers l’IRC. De plus, nous démontrons l’impact des deux principaux critères de l’insuffisance rénale, notamment l’histologie et la fonction rénales.

Plusieurs points clés des procédures chirurgicales doivent être soulignés pour un modèle reproductible et fiable. Pour la chirurgie a...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Nous exprimons notre gratitude à tous les participants pour leur collaboration à la présente étude. Cette étude a été financée par le financement de la Fondation provinciale des sciences naturelles du Zhejiang de Chine (LZ22H050001) et du programme provincial du Zhejiang pour la culture de talents innovants de haut niveau en matière de santé à Weiqiang Lin.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tondeuse à poils d’animauxFEIYUBIO19-7002
Seringues de 1 mlLongreenSR60061
ÉthanolMacklin E885996
GauzeFEIYUBIO19-5022
Système de moniteur homéothermiqueWarmmate40 x 50
Porte-aiguilleDKBTCZQ-00160
ÉcarteurRWDR22029-03
Solution saline stérileBiosharpBL158A
Ciseaux à tissusDKBTDC-YKJ1002
Pince à épiler pour tissusDKBTDK079904
Clip vasculaireFine Science Tools18055-02
Suture vicrylShanghai Jinhuan4 -0  ;

Références

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