Article de méthode

Isolement par affinité chimique de vésicules extracellulaires à partir de biofluides pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique

DOI :

10.3791/65844

⸱

27 octobre 2023

 ,  ,  , 
1Department of Biochemistry, Purdue University, 2Tymora Analytical Operations, 3Department of Chemistry, Purdue University, 4Purdue Institute for Cancer Research, Purdue University

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le présent protocole fournit des descriptions détaillées pour l’isolement efficace des vésicules extracellulaires urinaires à l’aide de billes magnétiques fonctionnalisées. De plus, il englobe des analyses ultérieures, y compris le western blot, la protéomique et la phosphoprotéomique.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les vésicules extracellulaires (VE) issues de biofluides ont récemment fait l’objet d’une attention particulière dans le domaine de la biopsie liquide. Libérés par presque tous les types de cellules, ils fournissent un instantané en temps réel des cellules hôtes et contiennent une multitude d’informations moléculaires, y compris les protéines, en particulier celles présentant des modifications post-traductionnelles (PTM) telles que la phosphorylation, en tant que principal acteur des fonctions cellulaires et de l’apparition et de la progression de la maladie. Cependant, l’isolement des VE des biofluides reste difficile en raison des faibles rendements et des impuretés des méthodes actuelles d’isolation des VE, ce qui rend difficile l’analyse en aval de la cargaison des VE, comme les phosphoprotéines des VE. Nous décrivons ici une méthode d’isolement rapide et efficace des VE basée sur des billes magnétiques fonctionnalisées pour l’isolement des VE à partir de biofluides tels que l’urine humaine et l’analyse protéomique et phosphoprotéomique en aval après l’isolement des VE. Le protocole a permis un rendement élevé de récupération des VE urinaires et des profils sensibles du protéome et du phosphoprotéome des VE. En outre, la polyvalence de ce protocole et les considérations techniques pertinentes sont également abordées ici.

Introduction

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Les vésicules extracellulaires (VE) sont des nanoparticules encapsulées dans une membrane sécrétées par tous les types de cellules et présentes dans les biofluides tels que le sang, l’urine, la salive, etc.1,2,3,4. Les VE transportent une cargaison de diverses molécules bioactives qui reflètent l’état physiologique et pathologique de leurs cellules hôtes et fonctionnent donc comme des facteurs cruciaux dans la progression de la maladie 4,5,6. De plus, des études approfondies ont établi que les marqueurs de la maladie basés sur les VE peuvent être identifiés avant l’apparition des symptômes ou la détection physiologique des tumeurs 5,6,7.

La phosphorylation agit comme un mécanisme clé dans la signalisation et la régulation cellulaires. Par conséquent, les phosphoprotéines constituent une source précieuse pour la découverte de biomarqueurs, car les événements de phosphorylation aberrants sont associés à des voies de signalisation cellulaire déréglées et au développement de maladies métastatiques telles que le cancer 8,9,10. Bien que le profilage de la dynamique de phosphorylation permette d’identifier des signatures phosphoprotéiques spécifiques à la maladie en tant que biomarqueurs potentiels, la faible abondance et la nature dynamique des phosphoprotéines posent des défis majeurs dans le développement de phosphoprotéines en tant que biomarqueurs11,12. Notamment, les phosphoprotéines peu abondantes encapsulées dans les VE sont protégées de la digestion enzymatique externe dans l’environnement extracellulaire8. Par conséquent, les VE et les phosphoprotéines dérivées des VE constituent une source idéale pour la découverte de biomarqueurs dans la détection précoce du cancer et d’autres maladies.

Bien que l’analyse de la phosphorylation des protéines dans les VE offre une ressource précieuse pour comprendre la signalisation du cancer et le diagnostic précoce de la maladie, le manque de méthodes efficaces d’isolement des VE constitue un obstacle majeur. L’isolation des VE est généralement obtenue par ultracentrifugation différentielle (DUC)13. Cependant, cette méthode prend du temps et n’est pas adaptée aux implications cliniques en raison d’un faible débit et d’une mauvaise reproductibilité13,14. D’autres approches d’isolement des VE, telles que la précipitation induite par les polymères15, sont limitées par une faible spécificité due à la coprécipitation de protéines non VE. Les approches basées sur l’affinité, y compris la capture d’affinité basée sur les anticorps16 et la filtration d’affinité17, offrent une spécificité accrue, mais sont limitées à un taux de récupération relativement faible en raison du faible volume.

Pour répondre aux enjeux de l’exploration de la dynamique des phosphoprotéines dans les VE, notre groupe a développé une technique de récupération et de purification totale des vésicules extracellulaires (EVtrap) basée sur l’affinité chimique pour capturer les VE sur des billes magnétiques fonctionnalisées18. Des résultats antérieurs ont démontré que cette méthode d’isolement des VE à base de billes magnétiques est très efficace pour isoler les VE d’une large gamme d’échantillons de biofluides et qu’elle est capable d’obtenir un rendement beaucoup plus élevé tout en minimisant la contamination par rapport à la DUC et à d’autres méthodes d’isolement existantes18,19. Nous avons utilisé avec succès EVtrap et une méthode d’enrichissement en phosphopeptide à base de titane développée par notre groupe20 pour profiler le phosphoprotéome des VE dérivés de divers biofluides et pour détecter des biomarqueurs phosphoprotéiques potentiels pour diverses maladies 19,21,22.

Nous présentons ici un protocole basé sur EVtrap pour l’isolement des VE en circulation. Le protocole se concentre sur les VE urinaires. Nous démontrons également la caractérisation de VE isolés à l’aide du western blot. Nous détaillons ensuite la préparation des échantillons et l’acquisition par spectrométrie de masse (MS) pour les analyses protéomiques et phosphoprotéomiques. Ce protocole fournit un flux de travail efficace et reproductible pour le profilage du protéome et du phosphoprotéome urinaires des VE, ce qui facilitera d’autres études sur les VE et leurs applications cliniques23.

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Protocole

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Tous les échantillons d’urine ont été prélevés sur des personnes en bonne santé après consentement éclairé. Les expériences étaient conformes à toutes les normes éthiques impliquant des échantillons humains et aux directives du programme de protection de la recherche humaine de l’Université Purdue.

1. Prélèvement d’échantillons

  1. Centrifuger 12 mL d’échantillon d’urine dans un tube à centrifuger conique de 15 mL pendant 10 min à 2 500 x g, 4 °C pour éliminer les débris cellulaires et les gros corps apoptotiques.
  2. Transvaser 10 mL du surnageant dans un nouveau tube de 15 mL et procéder à l’isolement des VE.
    REMARQUE : Le protocole peut être mis en pause ici, et les échantillons peuvent être conservés à -80 °C et décongelés à 37 °C lors de leur utilisation.

2. Isolation des véhicules électriques à l’aide de l’approche EVtrap

  1. Ajouter 0,5 mL de tampon de chargement (rapport 1 :10 v/v) et 100 μL de boue de billes EVtrap (rapport 1 :50 v/v) à l’échantillon selon les instructions du fabricant.
  2. Incuber l’échantillon par rotation d’un bout à l’autre pendant 30 min à température ambiante.
  3. Pelleter l’échantillon en plaçant le tube conique de 15 mL sur une grille de séparateur magnétique. Retirez le surnageant.
  4. Remettre les billes en suspension dans 1 mL de tampon de lavage et transférer la suspension dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL. Pipeter doucement pour remettre en suspension les billes liées à l’EV.
  5. Placez le tube sur une grille de séparateur magnétique de 1,5 ml de tube microcentrifuge et aspirez le surnageant. Utilisez une pipette P200 pour aspirer complètement le surnageant et éviter d’aspirer les billes.
  6. Lavez les perles avec 1 mL de tampon de lavage. Ajouter le tampon immédiatement après l’aspiration du surnageant pour éviter que les billes ne se dessèchent.
  7. Lavez les billes 2 fois avec 1 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS) à température ambiante.
  8. Incuber les billes avec 100 μL de triéthylamine 100 mM fraîchement préparée pendant 10 min à température ambiante et recueillir la solution éluée contenant des VE à l’aide d’un support de séparateur magnétique à tube microcentrifuge de 1,5 mL.
    REMARQUE : Pour préparer 1 mL de 100 mM de triéthylamine, diluer 14 μL de solution de triéthylamine dans de l’eau.
  9. Répétez l’étape 2.8 et combinez les solutions éluées. Séchez l’éluat à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide à 4 °C.
    REMARQUE : l’expérience peut être mise en pause ici. Les échantillons de VE séchés peuvent être conservés à -80 °C pendant plusieurs mois sans effets indésirables sur les étapes suivantes ou les résultats.

3. Caractérisation des VE par western blot

  1. Remettre en suspension 5 % de l’échantillon de VE séché (équivalent à 0,5 mL de l’échantillon d’urine) dans 20 μL de tampon d’échantillon 1x dodécylsulfate de lithium (LDS) avec 10 mM de dithiothréitol (DTT).
    REMARQUE : Les VE de 0,5 mL d’urine sont suffisantes pour détecter le signal CD9 (un marqueur EV24) dans le Western blot.
  2. Faites bouillir l’échantillon pendant 5 min à 95 °C. Charger l’échantillon sur un gel de polyacrylamide et effectuer l’électrophorèse et l’immunotransfert en suivant les protocoles standard25.
  3. Après avoir transféré les protéines sur une membrane de fluorure de polyvinylidène (PVDF) à faible fluorescence, bloquez la membrane avec de l’albumine sérique bovine (BSA) à 1 % dans une solution saline tween-20 (TBST) tamponnée au tris pendant 1 h à température ambiante. Pour préparer 1 L de tampon TBST, ajouter 19 mM de base Tris, 137 mM de NaCl et 1 mL de Tween-20 ; ajuster le pH à 7,4 à l’aide de HCl.
  4. Incuber la membrane avec l’anticorps anti-CD9 de lapin dans un rapport de 1 :5 000 dans 1 % de BSA dans du TBST à 4 °C pendant la nuit ou pendant 2 h à température ambiante.
  5. Lavez la membrane 3 fois pendant 5 minutes chacune avec TBST. Incuber la membrane avec des anticorps secondaires anti-IgG de lapin, liés à HRP dans un rapport de 1 :5000 dans 1% BSA dans TBST pendant 1 h à température ambiante.
  6. Lavez la membrane 3 fois pendant 5 minutes chacune avec TBST. Ajoutez les substrats de chimiluminescence améliorée (ECL) obtenus dans le commerce (rapport 1 :1) sur la membrane et détectez les signaux sur un système d’imagerie par chimiluminescence.

4. Préparation d’échantillons pour l’analyse protéomique et phosphoprotéomique

  1. Préparez un tampon de lyse frais contenant 12 mM de désoxycholate de sodium (SDC), 12 mM de lauroylsarcosinate de sodium (SLS), 100 mM de tampon de bicarbonate de triéthylammonium (TEAB), 10 mM de tris-(2-carboxyéthyl)phosphine (TCEP), 40 mM de chloroacétamide (CAA) et 1 cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase.
    REMARQUE : Les solutions mères sont répertoriées dans la description de la table des matériaux. Le tampon de lyse est préparé en ajoutant les solutions mères pour obtenir les concentrations souhaitées en fonction du volume requis.
  2. Solubiliser l’échantillon de VE séché dans 100 μL de tampon de lyse et chauffer l’échantillon pendant 10 min à 95 °C en agitant à 1 100 tr/min.
  3. Après avoir refroidi l’échantillon à température ambiante, diluez-le cinq fois en ajoutant 400 μL de TEAB 50 mM.
  4. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’un kit de dosage BCA selon les instructions du fabricant. Utilisez le tampon de lyse dilué cinq fois avec 50 mM de TEAB comme blanc.
  5. Ajouter le mélange trypsine/Lys-C à un rapport enzyme/protéine de 1 :50 p/p et incuber l’échantillon à 37 °C pendant la nuit en agitant à 1 100 tr/min.
  6. Ajouter 50 μL d’acide trifluoroacétique (AGT) à 10 % pour acidifier l’échantillon.
  7. Ajouter 600 μL d’acétate d’éthyle aux échantillons et faire tourbillonner le mélange pendant 2 min.
  8. Centrifuger l’échantillon pendant 3 min à 20 000 x g et retirer la couche supérieure (couche organique). Évitez de perturber l’interface pendant l’aspiration.
  9. Répétez les étapes 4.7 à 4.8. Séchez la phase aqueuse à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide.
  10. Remettre l’échantillon séché en suspension dans 200 μL d’AGT à 0,1 % pour acidifier les peptides et dessaler l’échantillon à l’aide d’un embout de dessalage C18 selon les instructions du fabricant. Conditionner l’embout avec 200 μL d’AGT à 0,1 % dans de l’acétonitrile à 80 %, puis 2x avec 200 μL d’AGT à 0,1 %. Chargez l’échantillon de peptide acidifié dans l’embout, puis lavez l’embout 3 fois avec 200 μL d’AGT à 0,1 %. Éluer les peptides avec 200 μL d’AGT à 0,1 % dans de l’acétonitrile à 80 %.
  11. Séchez l’éluat à l’aide d’un concentrateur centrifuge sous vide. Séchez séparément 2 % de l’échantillon peptidique (équivalent à 0,2 mL de l’échantillon d’urine) pour l’analyse protéomique. Utilisez le reste (98 %) de l’échantillon pour l’analyse phosphoprotéomique.
  12. Enrichissez les phosphopeptides de l’échantillon à l’aide d’un kit d’enrichissement en phosphopeptides selon les instructions du fabricant. Effectuez les étapes décrites ci-dessous pour l’enrichissement.
    1. Remettre l’échantillon séché en suspension dans 200 μL de tampon de chargement. Ajouter 50 μL de billes à l’échantillon et agiter vigoureusement pendant 20 min à température ambiante. Chargez l’échantillon avec les billes sur la pointe fritted et centrifugez pendant 1 min à 100 x g.
    2. Lavez la buse avec 200 μL de tampon de chargement, puis le tampon de lavage 1, puis le tampon de lavage 2. Effectuez les trois étapes de lavage en centrifugeant une fois pendant 2 min à 20 x g et une fois pendant 1 min à 100 x g.
    3. Placez l’embout avec les billes dans un nouveau tube pour recueillir les phosphopeptides élués. Ajouter 50 μL de tampon d’élution à la pointe et centrifuger une fois pendant 2 min à 20 x g. Ajouter 50 μL de tampon d’élution à la pointe et centrifuger une fois pendant 2 min à 20 x g. Centrifuger une dernière fois pendant 1 min à 100 x g.
  13. Séchez les phosphopeptides élués à l’aide d’un concentrateur de centrifugation sous vide.

5. Analyse LC-MS/MS

REMARQUE : Différents systèmes/paramètres LC-MS/MS et méthodes d’acquisition de données, telles que l’acquisition dépendante des données (DDA), peuvent être utilisés.

  1. Remettre en suspension les échantillons séchés de protéome/phosphoprotéome dans de l’acide formique à 0,1 % (solvant A) et charger les échantillons conformément aux instructions du fabricant.
  2. Injecter les échantillons dans la spectrométrie MS à temps de vol à mobilité ionique piégée à travers le système de chromatographie en phase liquide (LC) et utiliser la méthode normalisée préréglée Whisper 40 échantillons par jour. Les peptides sont séparés sur une colonne C18 de 15 cm (diamètre intérieur de 75 μm, taille de particule de 1,9 μm) comme mentionné dans le tableau des matériaux.
  3. Pour l’analyse protéomique, acquérir des données à l’aide d’une fragmentation en série à accumulation parallèle combinée à une méthode d’acquisition indépendante des données (dia-PASEF) avec une plage de masse par rampe s’étendant de 300 à 1200 m/z et de 0,6 à 1,50 1/K0 avec un temps de cycle de 1,38 s.
  4. Pour l’analyse phosphoprotéomique, acquérir des données à l’aide d’une méthode d’acquisition dia-PASEF avec une plage de masse par rampe allant de 400 à 1550 m/z et de 0,6 à 1,50 1/K0 avec un temps de cycle de 1,38 s.
  5. Chargez les fichiers bruts dans un logiciel de protéomique et effectuez l’extraction, l’identification et la quantification des signaux à l’aide d’un flux de travail d’acquisition indépendant des données sans bibliothèque.
    1. Pour les paramètres de recherche, utilisez la base de données Homo sapiens , des types de digestion spécifiques avec des enzymes trypsine/P, 7 longueurs de peptides minimales, 52 longueurs de peptides maximum, deux clivages manqués, carbamidométhyl à la cystéine comme modification fixe, N-term de la protéine acétyle, oxydation à la méthionine et phosphorylation à la sérine, à la thréonine et à la tyrosine (pour l’analyse phosphoprotéomique) comme modifications variables, et 5 comme modifications variables maximales. Réglez le FDR au PSM, au peptide et au groupe protéique sur 0,01.
      REMARQUE : Le logiciel Spectronaut a été utilisé dans ce protocole. D’autres logiciels de recherche de données DIA tels que DIA-NN et PEAKS sont également couramment utilisés. Si les données ont été acquises en mode DDA, des logiciels tels que MaxQuant et Proteome Discoverer sont applicables.

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Résultats

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Ce protocole illustre un flux de travail complet allant de l’isolement des VE aux analyses protéomiques et phosphoprotéomiques en aval (Figure 1). Les échantillons d’urine en trois exemplaires ont été soumis à l’isolement des véhicules électriques. Les VE isolés ont été caractérisés par transfert Western, puis traités pour la préparation d’échantillons protéomiques par spectrométrie de masse, y compris l’extraction de protéines, la digestion enzymatique et le nettoyage des peptides. Pour l’a...

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Discussion

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L’isolement efficace des VE est une condition préalable essentielle à la détection de protéines et de phosphoprotéines peu abondantes dans les VE. Malgré le développement de nombreuses méthodes pour répondre à ce besoin, la majorité d’entre eux souffrent encore de limitations telles qu’une mauvaise récupération ou une faible reproductibilité, ce qui entrave leur utilisation dans les études à grande échelle et les contextes cliniques de routine. Le DUC est généralement considéré comme la méthode la plus courante pour l’is...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs déclarent un intérêt financier concurrent. Anton Iliuk et W. Andy Tao sont les cofondateurs de Tymora Analytical Operations, qui a développé les billes EVtrap et commercialisé le kit d’enrichissement en phosphopeptide PolyMAC.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces travaux ont été financés en partie par les subventions 3RF1AG064250 et R44CA239845 du NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tube de microcentrifugation de 1,5 mLProduits des sciences de la vieM-1700C-LB
Rack séparateur magnétique de tube de 1,5 mLSergi Lab Supplies1005
Tube de centrifugeuse conique de 15 mLCorning  ;
Rack séparateur magnétique à tube de 15 mLSergi Lab Supplies1002
IgG anti-lapin, technologie de signalisation cellulaire d’anticorps liée à la HRP7074P2
Agitateur incubé de paillasseBioerDIS-87999-3367802Bloc de mélange Bioer Thermocell MB-101
CD9 (D3H4P)Technologie de signalisation cellulaire13403S
ChloroacétamideSigma -AldrichC0267-100GUtilisé pour l’alkylation des groupes sulfures réduits. Préparez fraîchement 400 mM dans de l’eau comme solution mère.
Acétate d’éthyle  ;Fisher Scientific  ;E145-4Précipite les détergents
Evosep One  ;EvosepSystème de chromatographie liquide
EvotipsEvosepEV2013Chargement d’échantillons pour le système Evosep One  ;
EVtrapTymora AnalytiquePerles magnétiques fonctionnalisées, tampon de chargement et tampon de lavage  ;
Immobilon-FL Membrane PVDFSigma -AldrichIPFL00010Membrane buvard  ;
NuPAGE 4-12 % Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOXInvitrogen NuPAGE 4 à 12 %, Bis-Tris, 1,0 mm, Mini Protein Gel, 12 puits
NuPAGE LDS Sample Buffer (4X)InvitrogenNP0007
PBSThermoFisher10010023
Pepsep C18 15 x 75 x 1.9Bruker  ;1893473Colonne de séparation  ;
Inhibiteur de la phosphatase Cocktail 2Sigma -AldrichP5726-5ML100X, inhibiteur de la phosphotase.
Cocktail d’inhibiteurs de la phosphatase 3Sigma -AldrichP0044-1ML100X,  ; Inhibiteur de la phosphotase.
Kit de dosage des protéines Pierce BCAThermoFisher23225
Substrat de transfert Western Pierce ECLThermoFisher32106Substrat HRP  ;
Kit d’enrichissement en phosphopeptide PolyMACTymora AnalyticalCapture d’affinité ionique métallique à base de polymère (PolyMAC) pour l’enrichissement en phosphopeptide
Désoxycholate de sodium  ;Sigma -AldrichD6750-10GDétergent pour tampon de lyse. Préparer 120 mM dans de l’eau sous forme de solution mère.
Lauroyl sarcosinate de sodiumSigma -AldrichL9150-50GDétergent pour tampon de lyse. Préparer 120 mM dans de l’eau sous forme de solution mère.
timsTOF HTBrukerSpectrométrie de masse à temps de vol à mobilité ionique piégée
TopTip C-18 (10-200 &mu ; L) conseils  ;GlygenTT2C18.96Méthode de dessalage
TriéthylamineSigma -Aldrich471283-100MLPour élution EV.
Tampon de bicabonate de triéthylammoniumSigma -AldrichT7408-100ML1 M
Acide trifluoroacétiqueSigma -Aldrich302031-100ML
Chlorhydrate de tris-(2-carboxyéthyl)phosphineSigma -AldrichC4706Utilisé pour la réduction des liaisons disulfure. Préparer 200 mM dans de l’eau sous forme de solution mère. Aliquote la solution mère en petit volume et stockez-la à -20° ; C (éviter plusieurs cycles de gel-dégel).
Trypsine/Lys-C MIX ThermoFisherPIA41007
352097 mAb rabbit

Références

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Extracellular VesiclesEV IsolationBiofluid ProteomicsPhosphoproteomics AnalysisMagnetic Bead IsolationUrinary EVsLiquid BiopsyMass SpectrometryPhosphopeptide EnrichmentPost Translational Modifications

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