Article de méthode

Analyse spatiale à haute résolution des niveaux d’expression génique dans les tendons

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DOI :

10.3791/65852

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8 mars 2024

 , 
1Center for Regenerative Medicine, Department of Orthopedic Surgery, Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Center Of Regeneration and Longevity (CORAL), Tel-Aviv Sourasky Medical Center

Dans cet article

Résumé

Cet article décrit comment réaliser un protocole in situ optimisé pour les tendons. Cette méthode traite de la préparation des tissus, de la perméabilisation des sections, de la conception de la sonde et des méthodes d’amplification du signal.

Résumé

Au cours des dernières années, de nombreux protocoles ont été développés pour la transcriptomique à haute résolution dans de nombreux domaines médicaux et biologiques différents. Cependant, les tissus riches en matrice, et plus particulièrement les tendons, ont été laissés pour compte en raison de leur faible nombre de cellules, de leur faible quantité d’ARN par cellule et de leur teneur élevée en matrice, ce qui les rendait difficiles à analyser. L’un des outils unicellulaires les plus récents et les plus importants est l’analyse spatiale des niveaux d’expression génique dans les tendons. Ces outils spatiaux d’ARN ont une importance particulièrement élevée dans les tendons pour localiser des cellules spécifiques de populations nouvelles et inconnues, valider les résultats du RNA-seq sur cellule unique et ajouter un contexte histologique aux données de RNA-seq sur cellule unique. Ces nouvelles méthodes permettront d’analyser l’ARN dans les cellules avec une sensibilité exceptionnelle et de détecter des cibles d’ARN à molécule unique au niveau de la cellule unique, ce qui contribuera à caractériser moléculairement les tendons et à promouvoir la recherche sur les tendons.

Dans cet article méthodologique, nous nous concentrerons sur les méthodes disponibles pour analyser les niveaux d’expression génique spatiale sur les coupes histologiques en utilisant de nouveaux tests d’hybridation in situ pour détecter l’ARN cible dans des cellules intactes à des niveaux unicellulaires. Tout d’abord, nous nous concentrerons sur la façon de préparer le tissu tendineux pour les différents tests disponibles et sur la façon d’amplifier des signaux spécifiques à la cible sans bruit de fond mais avec une sensibilité et une spécificité élevées. Ensuite, l’article décrira des méthodes de perméabilisation spécifiques, les différents modèles de sondes et les stratégies d’amplification du signal actuellement disponibles. Ces méthodes uniques d’analyse des niveaux de transcription de différents gènes en résolution unicellulaire permettront l’identification et la caractérisation des cellules du tissu tendineux dans des populations jeunes et âgées de divers modèles animaux et tissus tendineux humains. Cette méthode aidera également à analyser les niveaux d’expression génique dans d’autres tissus riches en matrice tels que les os, le cartilage et les ligaments.

Introduction

Les tendons sont des tissus conjonctifs qui permettent la transmission de la force entre le muscle et l’os1. Au cours du développement, les ténocytes axiaux sont dérivés de cellules mésenchymateuses dans le sclérotome des somites2 ; les tendons des membres dérivent du mésoderme de la plaque latérale ; et les tendons crâniens proviennent de la lignée 3,4 de la crête neurale crânienne. Le tendon peut être caractérisé par l’expression du facteur de transcription5 de la sclérexie, bien que plusieurs marqueurs jouent également un rôle clé dans le développement du tendon, notamment la ténomoduline, la mohawk et la réponse de croissance précoce 1/2 6,7,8,9.

Malgré le peu de marqueurs connus du tendon, en général, une caractérisation plus approfondie reste difficile car le tendon contient des cellules qui s’étendent sur un gradient de propriétés biomécaniques. À partir de la jonction myotendineuse, du tendon au milieu du corps et de l’enthèse plus calcifiée, les cellules tendineuses résident dans des matrices extracellulaires dont les propriétés de traction varient. Étant donné que le tendon doit résister à la tension imposée par la différence de résistance mécanique entre les tissus mous et durs, l’organisation spatiale des cellules du tendon est particulièrement importante pour son fonctionnement. Cependant, on sait peu de choses sur ces sous-populations de tendons.

De nombreux outils de transcriptomique spatiale à haute résolution peuvent être utilisés pour commencer à élucider les sous-populations cellulaires, y compris, mais sans s’y limiter, le séquençage de l’ARN unicellulaire ou l’hybridation in situ . Cependant, bien que ces tests de profilage spatial aident à découvrir l’expression de l’ARN dans les tissus après la microdissection ou la section, ces méthodes peuvent être difficiles lorsqu’elles sont effectuées sur des tissus tendineux. Les tendons sont des tissus riches en matrice composés de près de 86 % de collagène en masse sèche10, ce qui rend difficile l’extraction des cellules pour le séquençage. En raison des complications liées à l’isolement des cellules de la matrice, de la nature hypocellulaire du tendon11 et du nombre relativement faible d’ARN, le tendon est un tissu difficile à analyser.

Dans cet article, nous présentons une méthode pour optimiser de nouveaux tests d’hybridation in situ afin de les exploiter pour les tendons en fournissant des méthodes de préparation des tissus, de perméabilisation et de conception de sondes. Associé aux technologies de séquençage existantes, cela pourrait aider les chercheurs à caractériser spatialement les sous-populations de tendons en développement, adultes ou blessés avec une sensibilité et une spécificité accrues du dosage.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) et de l’AAALAC. Les expériences ont été réalisées selon un protocole approuvé #2013N000062 au Massachusetts General Hospital. Dans cette étude, des souris C57BL/J6 (âgées de 5 semaines et P0) ont été utilisées. Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux, réactifs et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Préparation et fixation de l’échantillon

  1. Euthanasier des souris dans une chambre de CO2 suivie d’une luxation cervicale comme méthode secondaire d’euthanasie. Ensuite, utilisez des ciseaux pour couper les membres postérieurs de la souris le long de l’articulation de la hanche12. Dans un flacon à scintillation, immerger le membre postérieur de la souris dans une solution de paraformaldéhyde (PFA) à 4 % suffisante pour couvrir complètement l’échantillon et fixer le tissu pendant 24 h.
    REMARQUE : Au lieu de 4 % de PFA, 10 % de formol peut également être utilisé pour la fixation. Après fixation, l’échantillon peut être stocké dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) jusqu’à un traitement ultérieur. En fixant l’ensemble de la patte postérieure, nous sommes en mesure de préserver la tension sur le tendon et avons la possibilité d’examiner l’enthèse, le milieu du corps tendineux ou la jonction myotendineuse.
  2. Après avoir retiré le PFA du flacon à scintillation, laver l’échantillon pendant 3 x 10 min avec 1 x PBS en ajoutant suffisamment de PBS pour couvrir l’échantillon. Ensuite, immergez les membres postérieurs dans 0,5 M d’EDTA à 4 °C avec agitation pendant 1 à 2 semaines, en remplaçant par de l’EDTA frais tous les 2-3 jours.
  3. Après avoir retiré l’EDTA, lavez l’échantillon pendant 3 x 10 min avec 1x PBS, déshydratez les échantillons dans 70 % d’EtOH et incorporez-les dans de la paraffine dans l’orientation souhaitée. Utilisez les techniques conventionnelles de sectionnement FFPE pour sectionner le tissu d’une épaisseur de 3 μm et transférer les coupes sur une lame de microscope traitée et chargée (voir le tableau des matériaux)13.
    REMARQUE : Les sections peuvent être stockées à 4 °C avant de passer aux étapes suivantes.
  4. Déparaffinisation
    1. Faites cuire les diapositives sur une plaque chauffante à 60 °C pendant 1 h, puis laissez les diapositives revenir à température ambiante (RT). Pour retirer la cire de paraffine des lames, placez les lames sur un support à lames et abaissez-les dans un plat de coloration rempli de xylène. Répéter dans le xylène frais pendant 3 x 5 min.
      ATTENTION : Le xylène est dangereux ; manipuler avec précaution.
    2. Pour réhydrater les sections, immergez les lames dans les éléments suivants pendant 5 min par lavage, le tout à RT : laver 2x dans 100 % EtOH, 1x dans 75 % EtOH dilué dans dH2O, 1x dans 50 % EtOH dilué dans PBS, 1x dans 25 % EtOH dilué dans PBS, et 2x dans PBS.
      REMARQUE : Toutes les étapes de réhydratation se font avec les lames sur un support de lames et avec les différentes solutions EtOH dans les plats de coloration.

2. Adaptation du protocole 14 du RNAscope (ISH commercialisé)

  1. Préparation des solutions et des sondes
    1. Préparez une solution TEG pour le prétraitement des échantillons sectionnés en combinant 25 mM de Tris-HCl à pH 8, 10 mM d’EDTA et 50 mM de glucose. Faire un volume suffisant pour tous les échantillons à traiter ou préparer l’excédent ; filtrer-stériliser et stocker à RT ; Mélangez correctement la solution avant de l’utiliser.
    2. Préparez suffisamment de 1x tampon de lavage (voir le tableau des matériaux) pour tous les lavages et rangez-le chez RT.
    3. Dans un bain-marie à 40 °C ou un incubateur, réchauffez les sondes d’intérêt pendant 10 min. Ensuite, préparez les sondes selon le protocole ISH14.
  2. Prétraitement des échantillons
    1. Plutôt que d’utiliser la solution de prétraitement recommandée, plongez les lames dans une boîte de coloration contenant un tampon TEG pendant 4 h à 60 °C.
      REMARQUE : L’incubation du tampon TEG peut être prolongée jusqu’à 6 h si le tissu est particulièrement dense ou si la récupération de l’antigène du motif de liaison à l’ARN d’intérêt est difficile. Dans ce cas, un point d’arrêt peut être ajouté ici, les lames séchées et conservées dans un réfrigérateur à 4 °C pendant la nuit.
    2. Retirez les échantillons du tampon et laissez-les sécher. Ensuite, prélevez les échantillons à l’aide d’un stylo barrière hydrophobe, plongez-les dans un autre plat de coloration contenant de la protéase IV et incubez-les dans un four pendant 45 min à 40 °C.
      REMARQUE : Nous recommandons la protéase IV pour les souris adultes. Si vous utilisez des souris plus jeunes, comme la P0, nous vous recommandons d’utiliser une enzyme plus douce, comme la protéase III, pendant 30 min. Lors du dépannage pour différents âges, observez l’intégrité du tendon et vérifiez qu’il n’y a pas de dégradation. Si le tissu se dissocie ou se dégrade, diminuez le temps d’incubation ou changez la protéase utilisée.
    3. Laver à nouveau les échantillons dans le tampon TEG pendant 30 min puis hybrider les sondes selon le protocole ISH14.
    4. Ajouter 50 à 100 μL de réactif de montage sur l’échantillon. Placez une lamelle sur les échantillons pour la microscopie. Lors de l’imagerie, utilisez un grossissement élevé (objectif 40x ou plus) pour visualiser le signal.

3. Adaptation du protocole 15 du HCR ISH

  1. Post-fixation
    1. Préparer une solution de PFA à 4 % (dans du PBS), une solution de PBT (0,1 % de Tween-20 dans du PBS) et de la protéinase K dans du PBS (concentration mère de 10 mg/mL, concentration finale de 5 μg/mL).
    2. Pour commencer la première étape de postfix, plongez les lames dans un plat de coloration contenant 4 % de PFA pendant 5 min. ensuite, retirez la solution de PFA à 4 % et stockez-la pour l’utiliser dans les étapes ultérieures. Rincez les lames pendant 2 x 5 minutes dans une solution PBT et retirez la solution PBT. Placez les lames dans un plat de coloration contenant une solution de protéinase K (5 μg/mL) pendant 5 min et rincez-les dans la solution PBT 2 x 5 min.
    3. Commencez la deuxième étape postfix et plongez les lames dans le PFA à 4 % pendant 5 min.
      REMARQUE : Il s’agit du même PFA de 4 % économisé à l’étape 3.1.2.
    4. Rincer les lames pendant 3 x 5 min dans la solution PBT.
      REMARQUE : Toutes les étapes de post-fixation sont effectuées avec les lames sur un support à lames et dans des plats de coloration contenant les solutions respectives.
  2. Acétylation
    1. Préparez la solution d’acétylation contenant 625 μL d’anhydride acétique, 3,3 mL de tampon 1 M de triéthanolamine (TEA) et 246 mL de ddH2O. Assurez-vous de bien mélanger et d’utiliser immédiatement après la préparation.
    2. Placez les lames dans la solution d’acétylation pendant 10 minutes, puis rincez 3 x 5 min dans une solution PBT. Rincez les lames au jdH2O et laissez-les sécher à l’air libre pendant 30 min. Ensuite, dessinez autour des échantillons avec un stylo barrière hydrophobe.
      REMARQUE : Toutes les étapes d’acétylation sont effectuées avec les lames sur un support de lames et dans des boîtes de coloration contenant les solutions respectives
  3. Hybridation
    1. Préchauffez le tampon d’hybridation à 37 °C et préchauffez une chambre humidifiée à 37 °C.
      ATTENTION : Le tampon contient du formamide, une matière dangereuse. Si les lames ne sont pas suffisamment sèches, épongez les bords avec une lingette de laboratoire pour éliminer l’excès de dH2O.
    2. Préparez les solutions de sonde en ajoutant 0,4 pmol de chaque mélange de sonde à 100 μL de tampon d’hybridation.
      REMARQUE : Si vous utilisez l’imagerie dHCR, utilisez une concentration plus élevée de sonde pour améliorer l’efficacité de l’hybridation de la sonde.
    3. Préparez 4 L de tampon de citrate de sodium (20x SSC) en combinant 3 M de NaCl (701,1 g de NaCl dans un volume final de 4 L) et 0,3 M de Na3CH6H5O7•2H2O (352,8 g), puis ajustez le pH final à 7 en ajoutant du HCl ou 10 N NaOH. Ajouter suffisamment de H2O pour atteindre 4 L. Préparer 5 fois SSCT en diluant 20 fois SSC à 5 fois et en ajoutant suffisamment de 10 % de Tween 20 pour obtenir 0,1 % du volume total.
    4. Ajoutez 200 μL de tampon d’hybridation à l’échantillon, placez les lames dans une chambre humidifiée et laissez les lames incuber pendant 10 min. Retirez la solution d’hybridation et égouttez l’excédent de tampon sur la lame en épongeant les bords avec une lingette de laboratoire.
    5. Ajouter 100 μL de la solution de sonde préparée sur l’échantillon et placer une lamelle sur l’échantillon. Incuber au four pendant la nuit ou pendant environ 12 à 16 h dans une chambre humidifiée avec une solution contenant 5x SSC et 50 % de formamide. Réglez la température à 37 °C.
      REMARQUE : Comme l’incubation dure toute la nuit, l’ajout de lamelles vise à minimiser l’évaporation.
    6. Laisser une aliquote de 5x solution SSCT dans un bain-marie à 37 °C et une deuxième aliquote à RT. Anticiper les volumes de ces aliquotes nécessaires en fonction du nombre d’échantillons et du nombre de lavages à l’étape suivante.
  4. Lavage
    1. À l’aide de la solution 5x SSCT préalablement préchauffée, préparez des solutions à 75 % de tampon de lavage/25 % de 5x SSCT, 50 % de tampon de lavage/50 % de 5x SSCT et 25 % de tampon de lavage/75 % de 5x SSCT.
    2. Pour éliminer l’excès de sondes, immergez les lames en série pendant 15 min par lavage à 37 °C dans 75 % de tampon de lavage/25 % 5x SSCT, 50 % de tampon de lavage/50 % 5x SSCT et 25 % de tampon de lavage/75 % 5x SSCT. Laissez les lamelles se détacher des échantillons.
    3. Incuber les lames 2 x 15 min avec 100 % 5x SSCT puis les immerger dans 5x SSCT pendant 5 min à RT.
      REMARQUE : Les étapes de lavage peuvent être effectuées avec les lames sur un support à lames et dans des plats tachés contenant les solutions respectives ou avec les solutions ajoutées sous forme de gouttelettes.
  5. Amplification
    1. Préparez 6 pmol d’épingle à cheveux h1 et 6 pmol d’épingle à cheveux h2 en refroidissant par pression 2 μL d’un stock de 3 μM (chauffer à 95 °C pendant 90 s et refroidir à RT). Protégez les épingles à cheveux de la lumière pendant ce processus.
      REMARQUE : Les épingles à cheveux HCR h1 et h2 sont fournies dans un tampon de stockage en épingle à cheveux et sont prêtes à être refroidies par enclenchement. Enclenchez les épingles à cheveux h1 et h2 dans des tubes séparés.
    2. Séchez les lames en épongeant leurs bords avec une lingette de laboratoire. Ensuite, ajoutez 200 μL de tampon d’amplification sur l’échantillon et placez-le dans une chambre humidifiée pendant 30 min à RT. Préparez le mélange d’épingles à cheveux en ajoutant des épingles à cheveux h1 refroidies et des épingles à cheveux h2 refroidies à 100 μL de tampon d’amplification à RT.
    3. Retirez le tampon d’amplification et égouttez l’excès de liquide sur la lame en épongeant les bords avec une lingette de laboratoire. Ajouter 100 μL du mélange d’épingles à cheveux préalablement préparé et placer du parafilm sur l’échantillon. Incuber les lames pendant au moins 4 h ou toute la nuit dans une chambre sombre et humidifiée à RT.
    4. Pour éliminer l’excès d’épingles à cheveux, plongez les lames dans 5x SSCT dans une boîte de coloration et incubez à RT pendant 30 min. Répétez le lavage dans 5 fois SSCT frais pendant 30 min, et une troisième fois pendant 5 min.
    5. Séchez les lames en épongeant les bords avec une lingette de laboratoire et ajoutez 50 à 100 μL de réactif de montage sur l’échantillon. Placez une lamelle sur les échantillons pour la microscopie. Lors de l’imagerie, utilisez un grossissement élevé (objectif 40x ou plus) pour visualiser le signal.

Résultats

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Figure 1 : Expression de l’ARN Poly A dans le tendon d’Achille de souris adulte à l’aide de RNAScope. Image représentative d’un marquage réussi de Poly A dans le tendon d’Achille de souris (panneau de gauche) à l’aide du test ISH commercialisé. La colocalisation avec DAPI confirme la spécificité de la sonde (panneaux du milieu et de droite), permettant le contrôle du bruit de fond. Les images ont été prises à 63x avec un microscope confocal Leica SPE. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : ISH = hybridation in situ ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Expression de l’ARN Poly A dans le tendon d’Achille de souris P0 à l’aide de RNAScope. Image représentative d’un marquage réussi de Poly A dans le calcanéum de souris P0 (panneau de gauche) à l’aide du test ISH commercialisé. La colocalisation avec DAPI et un bruit de fond minimal confirment la spécificité de la sonde (panneaux central et droit). Le tendon est marqué par une ligne pointillée. Les images ont été prises avec un microscope ZEISS Axio Imager. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : ISH = hybridation in situ ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Ce protocole aidera les chercheurs à utiliser les outils d’hybridation in situ disponibles dans le commerce et à les adapter pour une utilisation dans les tissus tendineux adultes. Cela nous permet finalement d’analyser les niveaux de transcription de différents gènes dans une résolution unicellulaire informée dans l’espace. Une exécution réussie d’un test ISH aura une spécificité élevée pour les cibles d’intérêt et un bruit de fond minimal. Le protocole peut être utilisé dans les tendons d’Achille adultes et néonatals (Figure 1, Figure 2, Figure 3 et Figure 4). Poly A peut être utilisé comme contrôle pour aider à valider une exécution réussie en confirmant qualitativement qu’il y a des niveaux attendus d’ARN dans l’échantillon.

Toutefois, les protocoles ISH peuvent nécessiter un dépannage de plusieurs manières. Par exemple, la figure 5 montre une hybridation insuffisante de la sonde de Poly A dans le tendon, de sorte que plusieurs zones du tendon n’avaient pas de signal Poly A, malgré la contre-coloration DAPI montrant que des cellules étaient effectivement présentes. De plus, si le tissu est surdigéré dans les étapes postfixes dans HCR par le temps d’incubation prolongé de la protéase K (Figure 6) ou dans les étapes de prétraitement dans RNAScope par l’incubation prolongée de la protéase IV, la morphologie du tissu peut être perturbée. Enfin, la figure 7 est un exemple de ce à quoi ressemblerait un contrôle négatif si la sonde d’hybridation de l’ARN n’était pas ajoutée, mais qu’une contre-coloration nucléaire était toujours utilisée.

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Figure 3 : Expression de l’ARN de la sclérose dans le tendon d’Achille de souris adulte à l’aide de la HCR. Image représentative d’un marquage réussi de l’ARN de la scléroxie dans le tendon d’Achille de souris adulte (panneau de gauche) à l’aide de la HCR. Le DAPI est utilisé comme contre-coloration nucléaire (panneau central). La colocalisation avec DAPI permet de confirmer la spécificité de la sonde (panneau de droite). Les images ont été prises à 63x avec un microscope confocal Leica SPE. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : HCR = réaction en chaîne d’hybridation ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Expression de l’ARN Poly A dans le tendon d’Achille de souris P0 à l’aide de HCR. Image représentative du marquage de l’ARN Poly A dans le tendon d’Achille de souris P0 à l’aide de HCR. DAPI et Poly A marquent à la fois l’os et le tendon d’Achille au calcanéum (panneaux gauche et droit, respectivement). La colocalisation des sondes DAPI et Poly A dans les deux tissus et un bruit de fond minimal confirment le succès de l’analyse du HCR (panneau de droite). Les images ont été prises avec un microscope ZEISS Axio Imager. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : HCR = réaction en chaîne d’hybridation ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Exécution infructueuse de HCR avec des sondes d’ARN Poly A dans le tendon d’Achille de souris P0. Image représentative de l’échec du marquage de l’ARN Poly A dans le tendon d’Achille de souris P0 à l’aide de HCR. Le DAPI a marqué des noyaux dans l’os et le tendon du calcanéum (panneau de gauche), mais la sonde Poly A HCR n’a pas pénétré dans tout le tendon (panneau du milieu et de droite, voir les pointes de flèches blanches). Cependant, Poly A a réussi à marquer la majeure partie de l’os. Les images ont été prises avec un microscope ZEISS Axio Imager. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : HCR = réaction en chaîne d’hybridation ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 6 : Exemple de marquage du HCR Poly-A dans le tendon d’Achille de souris adulte surdigéré. Image représentative du marquage de l’ARN Poly A dans le tendon d’Achille d’une souris adulte surdigérée à l’aide de la HCR. Poly A et DAPI colocalisent correctement dans cet échantillon (panneau de droite), mais la morphologie uniaxiale typique du tendon est perturbée (pointes de flèches blanches). Les images ont été prises avec un microscope ZEISS Axio Imager. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviations : HCR = réaction en chaîne d’hybridation ; DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 7 : Contrôle négatif de l’ARNASCOPE Poly A dans le tendon d’Achille de souris adulte. Image représentative du contrôle négatif pour le marquage de l’ARN Poly A dans laquelle la sonde Poly A n’a pas été ajoutée, mais les sondes d’amplification l’ont été. Comme prévu, DAPI a réussi à étiqueter le noyau (panneau gauche), mais il n’y avait aucun signal présent pour Poly A (panneau central). Les images ont été prises avec un microscope ZEISS Axio Imager. Barres d’échelle = 20 μm. Abréviation : DAPI = 4',6-diamidino-2-phénylindole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Dans cet article, nous décrivons les modifications apportées pour tirer parti des outils ISH existants afin qu’ils puissent être utilisés dans les tissus tendineux avec un haut degré de spécificité et de sensibilité. Étant donné que le tendon est un tissu très dense en matrice, des ajustements de protocole doivent souvent être effectués pour obtenir des degrés similaires de pénétration et de spécificité de la sonde. Ces méthodes spécifiques de perméabilisation et d’amplification du signal du tissu tendineux font partie intégrante de l’amélioration de l’efficacité des protocoles ISH discutés. Sans ces étapes, il est difficile pour les sondes d’avoir une interaction forte et spécifique avec l’ARN du tendon.

Dans le RNAscope14, des ajustements doivent être apportés au tampon de prétraitement utilisé pour que le protocole fonctionne plus efficacement dans les tissus tendineux. Plus précisément, l’utilisation du tampon TEG comme prétraitement améliore l’accès des sondes à l’ARN cible. En plus du tampon TEG, le traitement à la protéase IV est prolongé au-delà de la durée standard, de sorte qu’il dure de 45 min à 1 h. Dans le HCR15, la durée des lavages a été augmentée et des étapes de postfixe ont été ajoutées avant le début du test RNA-FISH. Les étapes postfixes comprenaient l’ajout d’étapes d’incubation dans une solution de PFA à 4 %, de PBT, de protéinase K et d’acétylation. Collectivement, ces modifications contribuent à améliorer l’accès de la sonde à l’ARN tendineux et à réduire le bruit de fond16,17. Cependant, bien que ces modifications de protocole contribuent à augmenter la spécificité et la sensibilité des sondes utilisées dans l’ISH en modifiant les solutions de prétraitement utilisées et en ajoutant des étapes de post-fixation pour augmenter l’accessibilité de la sonde se liant à l’ARN, la conception de la sonde présente des limites.

Pour atténuer les défis posés par l’accessibilité de l’ARN pour les sondes, des modifications supplémentaires peuvent être apportées pour optimiser les dosages ISH. Si l’imagerie dHCR - une méthode de quantification numérique absolue de l’ARNm15 - est utilisée, il est recommandé d’augmenter la concentration de la sonde pour améliorer l’efficacité de l’hybridation de la sonde. De plus, l’utilisation d’une période plus courte dans les étapes d’amplification garantit que les points à molécule unique sont limités par la diffraction. Des périodes d’incubation plus longues peuvent entraîner une autofluorescence plus élevée du muscle lors de l’imagerie. Si le tendon choisi est plus dense et/ou plus grand que le tendon d’Achille murin adulte, nous recommandons d’augmenter la durée de l’étape de fixation du PFA à 4 %.

Ces modifications aux protocoles commerciaux ISH susmentionnés sont plus utiles pour les tissus murins adultes ou les tissus plus denses qui nécessitent des étapes de prétraitement ou de fixation plus longues. Bien que ces modifications aux protocoles existants contribuent à améliorer l’accessibilité des sondes à l’ARN, certaines sondes peuvent nécessiter une concentration plus élevée ou un temps d’incubation plus long chez les souris plus âgées que chez les souris plus jeunes ou chez les nouveau-nés, en fonction de l’accessibilité des motifs d’ARN cibles auxquels les sondes se lieront dans les différentes cohortes d’âge. En ce qui concerne l’utilisation de la protéase dans les étapes de prétraitement du RNAscope, nous recommandons d’utiliser la protéase IV pendant 45 minutes pour les tendons de souris adultes, mais la protéase III pendant 30 minutes pour les tendons néonés. Pour évaluer l’efficacité du test, évaluer les ajustements apportés au protocole ou, de manière générale, comparer l’expression entre les échantillons, plusieurs contrôles peuvent être utilisés. Par exemple, une sonde Poly A peut être comparée à une contre-coloration nucléaire utilisée pour évaluer la spécificité de l’essai, pour évaluer la distribution/dégradation de l’ARN dans l’échantillon et pour confirmer que l’ARN était accessible aux sondes. De même, les sondes pour les gènes d’entretien peuvent également servir de contrôles pour accéder à l’accessibilité de l’ARN. Les témoins positifs avec des cibles qui ont des modèles d’expression connus aident à confirmer la spécificité, et les contrôles négatifs aideront à évaluer toute liaison non spécifique potentielle.

Dans l’ensemble, comme plusieurs techniques sont en cours de développement pour mieux comprendre le profil spatial d’expression génique des tissus, d’autres méthodes sont nécessaires pour valider les résultats. En particulier, des tests tels que le séquençage de l’ARN unicellulaire sont en train de devenir des outils populaires pour évaluer l’expression des gènes, mais leurs résultats doivent être examinés spatialement à une résolution plus élevée. Pour y remédier, les tests ISH peuvent être utilisés pour mieux comprendre et valider le contexte spatial des données transcriptomiques produites par des tests plus quantitatifs. Dans le tendon, l’appariement de tels tests aidera à caractériser davantage les cellules résidant à travers l’enthèse, le milieu du corps tendineux et la jonction myotendineuse en validant spatialement des marqueurs spécifiques à des populations cellulaires uniques.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Les auteurs remercient Jenna Galloway et les membres du Galloway Lab pour leur soutien et leurs encouragements dans le développement et le dépannage de ces protocoles.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1 M tampon
10 % solution
10 % Tween-20
20x tampon
4 % PFA
ACD RNAscope Fluorescent multiplex Kit de réactifs fluorescents V2ACD323100
acétique Microscope imageur anhydride
Axio souris ZEISS
C57BL/J6JAX ID : 000664
lamelles Fisher  ;12-541-042
ddH2O
ETDAThermofisherAM9262
EtOH
GlucoseVWR Chemicals BDHBDH9230-500G
HCR RNA-FISH BundleMolecular Instruments Inc.
Système d’hybridation HybEZ IIACD
Immedge Barrier PenVector LaboratoriesH4000
Microscope confocal Leica SPE Leica
ParafilmFisher
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS, 1x)InvitrogenAM9625Diluer 10x PBS dans de l’eau milli-Q pour obtenir 1x solution
Protéase IV
Protéase KRoche3115836001
RNAscope H2O2 et réactifs de protéaseACDPN 322381inclus dans l’ACD RNAscope Kit de réactifs fluorescents multiplex multiplex ACD V3
détection fluorescente multiplex RNAscopeACDPN 323110Inclus dans l’ACD RNAscope Kit de réactifs fluorescents multiplex fluorescents V2
Réactifs de récupération de cibles d’ARNASCOPEACD322000Inclus dans l’ARNASCOPE ACD Kit de réactifs fluorescents multiplex fluorescents V4
Tampon de lavage d’ARNASCOPEACDPN 310091inclus dans l’ARNASCOPE ACD Kit de réactifs fluorescents multiplex fluorescents V5
RNAscope  ; Sonde DiluantACD300041
Porte-lamesStatLab4465A
Plat de coloration avec couvercleStatLabLWS20WH
Superfrost Plus Lames de microscopeFisher1255015traitées, chargées
Tris-HCl
XyleneSigma-Aldrich534056-4L
de triéthanolaminede formolsalin de citrate de sodium Kit de

Références

  1. Sharma, P., Maffulli, N. Tendon injury and tendinopathy: healing and repair. Journal of Bone and Joint Surgery. 87 (1), 187-202 (2005).
  2. Brent, A. E., Schweitzer, R., Tabin, C. J. A somitic compartment of tendon progenitors. Cell. 113 (2), 235-248 (2003).
  3. Noden, D. M. The role of the neural crest in patterning of avian cranial skeletal, connective, and muscle tissues. Developmental Biology. 96 (1), 144-165 (1983).
  4. Chen, J. W., Galloway, J. L. The development of zebrafish tendon and ligament progenitors. Development. 141 (10), 2035-2045 (2014).
  5. Schweitzer, R., et al. Analysis of the tendon cell fate using Scleraxis, a specific marker for tendons and ligaments. Development. 128 (19), 3855-3866 (2001).
  6. Tsai, S., Nödl, M., Galloway, J. Bringing tendon biology to heel: Leveraging mechanisms of tendon development, healing, and regeneration to advance therapeutic strategies. Developmental Dynamics. 250 (3), 393-413 (2021).
  7. Kannus, P., et al. Location and distribution of non-collagenous matrix proteins in musculoskeletal tissues of rat. The Histochemical Journal. 30 (11), 799-810 (1998).
  8. Kannus, P. Structure of the tendon connective tissue. Scandinavian Journal of Medicine & Science in Sports. 10 (6), 312-320 (2000).
  9. Thorpe, C. T., Birch, H. L., Clegg, P. D., Screen, H. R. C. The role of the non-collagenous matrix in tendon function. International Journal of Experimental Pathology. 94 (4), 248-259 (2013).
  10. Lin, T. W., Cardenas, L., Soslowsky, L. J. Biomechanics of tendon injury and repair. Journal of Biomechanics. 37 (6), 865-877 (2004).
  11. Grinstein, M., et al. A distinct transition from cell growth to physiological homeostasis in the tendon. eLife. 8, e48689(2019).
  12. Villaseñor, S., Grinstein, M. Two-photon microscopy for the study of tendons. Journal of Visualized Experiments. , e65853(2023).
  13. Qin, C., et al. The cutting and floating method for paraffin-embedded tissue for sectioning. Journal of Visualized Experiments. (139), e58288(2018).
  14. Wang, F., et al. RNAscope®: A Novel In Situ RNA Analysis Platform for Formalin-Fixed Paraffin-Embedded Tissues. Journal of Molecular Diagnostics. 14 (1), 22-29 (2012).
  15. Choi, H. M. T., et al. Third-generation situ hybridization chain reaction: multiplexed, quantitative, sensitive, versatile, robust. Development. 145 (12), 165753(2018).
  16. Jackson, D. J., Herlitze, I., Hohagen, J. A whole mount in situ hybridization method for the gastropod mollusc Lymnaea stagnalis. Journal of Visualized Experiments. (109), e53968(2016).
  17. Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C. A technical review and guide to RNA fluorescence in situ hybridization. PeerJ. 8, e8806(2020).

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Expression g nique spatialetissu tendineuxhybridation in situARN unicellulairem thodes transcriptomiquesamplification du signalconception de sondestissus riches en matricecoupes histologiquesanalyse de l expression g nique
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