Microscopie à deux photons pour l’étude des tendons

Résumé

Cet article décrit le processus de préparation, de mise en place et d’imagerie des tendons à l’aide de la microscopie multiphotonique. De plus, il couvre l’application du SHG pour l’analyse de l’alignement des fibrilles de collagène et la création d’une représentation 3D des tendons. Cette méthodologie s’avère très précieuse pour caractériser les cellules tendineuses et leur ECM au cours des lésions et du développement.

Résumé

La microscopie à deux photons est apparue comme un outil puissant pour évaluer les cellules des tissus profonds et caractériser l’alignement de la matrice extracellulaire (MEC) dans divers systèmes biologiques. Cette technique s’appuie sur des interactions lumière-matière non linéaires pour détecter deux signaux distincts : le signal de diffusion généré par la seconde harmonique (SHG), qui facilite la visualisation des fibres de collagène et leur orientation, et le signal d’excitation proche infrarouge pour l’imagerie de l’autofluorescence excitée par ultraviolet.

L’imagerie SHG s’avère particulièrement efficace pour visualiser les fibres de collagène en raison de la structure cristalline non centrosymétrique du collagène fibrillaire I. Étant donné que les tendons sont des tissus riches en matrice avec un nombre limité de cellules, leur teneur élevée en collagène en fait des candidats idéaux pour l’analyse par microscopie à deux photons. Par conséquent, la microscopie à deux photons offre un moyen précieux d’analyser et de caractériser les anomalies du collagène dans les tendons. Son application s’étend à l’étude du développement, des blessures, de la cicatrisation et du vieillissement des tendons, permettant la caractérisation complète des cellules tendineuses et de leurs interactions avec l’ECM dans diverses conditions à l’aide d’outils de microscopie à deux photons. Ce protocole décrit l’utilisation de la microscopie à deux photons en biologie des tendons et présente une méthodologie adaptée pour obtenir une imagerie et une caractérisation efficaces des cellules tendineuses pendant le développement et après une lésion. La méthode permet d’utiliser de fines sections microscopiques pour créer une image complète de l’ECM dans les tendons et les cellules qui interagissent avec cette matrice. Plus particulièrement, l’article présente une technique permettant de générer des images 3D à l’aide de la microscopie à deux photons dans des modèles animaux.

Introduction

Pour fonctionner correctement et transmettre la force du muscle à l’os¹, les tendons reposent sur les liaisons intermoléculaires et intramoléculaires entre les fibres de collagène. L’auto-assemblage, la réticulation et l’alignement complexes des fibres de collagène entraînent l’établissement d’une matrice hautement organisée qui contribue à la force biomécanique et à la flexibilité du tissu tendineux ^2,3,4. Bien que d’autres protéines ECM contribuent également à la stabilité du réseau fibrillaire dans les tendons⁵, la masse sèche du tendon est d’environ 86 % de collagène⁶, le collagène I représentant jusqu’à 96 % de la teneur totale en collagène ^7,8. En fin de compte, la structure du collagène est un produit clé de la santé et de la fonction normales des tendons.

Certaines modalités d’imagerie clinique utilisées pour les tendons sont l’IRM et/ou l’échographie. Bien que la technologie des ultrasons fournisse des images de la structure fasciculaire du tendon et révèle une partie de la structure fibrillaire du tissu⁹, la résolution n’est pas idéale pour la quantification. L’IRM a une meilleure résolution spatiale que l’imagerie par échographie, mais elle reste limitée. Cependant, ces méthodes sont également limitées dans leur profondeur d’imagerie potentielle à travers un tissu. À plus petite échelle, la diffusion de la lumière à petit et grand angle et la microscopie confocale peuvent être utilisées pour évaluer la structure des fibrilles de collagène et toute anomalie potentielle.

En revanche, la microscopie à génération de seconde harmonique (SHG) diffère des autres méthodes d’imagerie car elle peut capturer l’enveloppe externe des fibrilles de collagène. Les fibrilles de collagène I dans les tendons sont organisées de manière parallèle uniaxiale par l’intermédiaire de l’ECM tendineux et sont de nature non centrosymétrique ^4,10. Ces propriétés peuvent être exploitées pour l’imagerie à l’aide d’un microscope multiphotonique, qui peut produire des images claires jusqu’à 2 à 3 fois plus profondes que l’imagerie confocale¹¹. Cela nous permet également de générer des sections optiques de meilleure qualité du tendon. Lorsque la lumière est projetée dans l’échantillon d’intérêt, un signal SHG est produit et cette diffusion de la lumière peut être capturée. Dans les tendons, cela produit une image de la structure et de l’alignement du collagène, nous permettant ainsi d’évaluer les conséquences morphologiques et pathologiques potentielles des tendinopathies, des blessures, etc.

Étant donné que le collagène constitue la majeure partie de la masse sèche du tendon et contribue à la fonction du tendon ^6,12, la perturbation de la structure du collagène peut affecter les propriétés biomécaniques des tendons. Ainsi, l’analyse de sa structure peut nous aider à mieux comprendre l’impact et la gravité des blessures, ainsi qu’à créer une mesure de l’efficacité de la guérison. Cet article passe en revue une méthode qui utilise la microscopie multiphotonique et SHG pour analyser comment le développement et les lésions affectent la structure et l’alignement des fibrilles de collagène I et pour générer des images 3D de la MEC tendineuse dans des modèles animaux. Par conséquent, notre méthode d’imagerie des tendons peut aider les chercheurs à caractériser les cellules tendineuses et l’ECM pendant le développement ou après une blessure.

Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été effectuées conformément aux directives de l’Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) (Protocole #2013N0000062) et de l’AAALAC au Massachusetts General Hospital. BHLHE40 souris femelles knock-out nulles ou hétérozygotes dans un contexte Scx-GFP, âgées de 30 jours, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux ont été obtenus d’une source commerciale (voir la Table des matières).

1. Préparation et fixation des tissus

1. Pour préparer le tissu, euthanasiez les souris dans une chambre de CO₂ (selon les protocoles approuvés par l’établissement), puis faites-les disloquer le col de l’utérus.
2. Pour aider à réduire la quantité de fourrure qui peut coller à l’échantillon de tissu, vaporisez la souris avec 70 % d’EtOH jusqu’à ce que la fourrure soit saturée. Écorchez les membres postérieurs, puis à l’aide de ciseaux, retirez les deux membres postérieurs en coupant au niveau de l’articulation de la hanche.
3. Placez les deux membres postérieurs dans un flacon à scintillation de 20 mL et immergez-les dans du PFA à 4 % de manière à ce que le flacon soit rempli. Placez les flacons à 4 °C en agitant pendant la nuit.
4. Lavez les membres postérieurs dans 1x PBS à température ambiante (RT) avec agitation pendant 10 min et répétez au total 3 fois. Immergez les membres postérieurs dans de l’EDTA 0,5 M (pH 8,0) à 4 °C avec agitation jusqu’à 2 semaines, en remplaçant par de l’EDTA frais tous les 2-3 jours.
5. Lavez les membres postérieurs en 1x PBS à RT avec agitation pendant 10 min, en répétant les lavages au total 3 fois.
6. Immergez les membres dans du PBS 1x frais et conservez-les à 4 °C jusqu’à ce qu’ils soient utilisés pour l’imagerie.

2. Dissection du tendon et préparation du tissu pour l’imagerie

1. Tout en tenant le pied avec une pince, glissez une extrémité de la lame des ciseaux à ressort (voir tableau des matériaux) sous le tendon d’Achille et assurez-vous de couper le plus près possible de la jonction myotendineuse.
2. Tenez l’extrémité myotendineuse sectionnée du tendon à l’aide d’une pince et utilisez les ciseaux à ressort pour découper le tendon aussi près que possible de l’os.
   REMARQUE : Si nécessaire, utilisez des pinces pour aider à maintenir le tendon d’Achille loin du reste de la patte arrière lors de la première coupe. Assurez-vous de ne pas écraser ou endommager les tissus, car cela affecterait l’alignement du collagène pendant l’imagerie.
3. Pour perméabiliser et avoir une contre-coloration nucléaire, immergez le tendon disséqué dans du PBT (1 % de Triton-X dans du PBS) avec 0,1 % de Draq5 (concentration de stock, 5 mM, voir Tableau des matériaux). Placez le tendon dans un tube de microcentrifugation de 2 ml et ajoutez 1 μL de Draq5 à 1 ml de PBT. Incuber une nuit à RT sur un rocker. Comme Draq5 est sensible à la lumière, couvrez les tubes de microcentrifugation avec une feuille d’aluminium et protégez les échantillons de la lumière.
4. Avant l’imagerie, retirez la solution Draq5 et remplacez-la par du dPBS. Assurez-vous de continuer à protéger l’échantillon de la lumière.
   ATTENTION : Draq5 a une toxicité de catégorie trois et est considéré comme dangereux par la norme de communication des dangers de l’OSHA. Évitez tout contact et jetez-le dans un conteneur à déchets étiqueté.
5. À l’aide d’un poinçon de biopsie d’un diamètre intérieur de 6 mm, découpez un morceau de mousse de gel (voir le tableau des matériaux) et placez-le dans une petite boîte de Pétri de 60 x 15 mm. Ajoutez du ddH₂O dans le plat pour permettre à la mousse de gel de se dilater.
6. Placez le tendon d’Achille disséqué sur de la mousse de gel. À l’aide d’une lamelle collée à une rondelle, placez soigneusement la rondelle sur le tendon jusqu’à ce que la lamelle entre en contact avec le tissu. Pour éviter les problèmes lors de l’imagerie, assurez-vous qu’il n’y a pas de bulles d’air entre l’échantillon et la lamelle. Si nécessaire, ajoutez plus de ddH₂O dans le plat pour couvrir l’échantillon et la rondelle avec la lamelle.

3. Imagerie avec un microscope multiphotonique

1. À l’aide d’un microscope laser multiphotonique FVMPE-RS, d’un objectif 25x pouvant être immergé dans l’eau, d’un laser pulsé IR HPDS-O et d’un laser pulsé IR (voir le tableau des matériaux), localisez l’échantillon et la région d’intérêt qui seront imagés à l’aide du trajet lumineux EPI. Une fois l’échantillon localisé, placez la caméra sur l’extrémité myotendineuse ou enthésive du tendon d’Achille.
2. Basculez le chemin de la lumière sur LSH, ajustez le réglage du laser IR du Laser 2 sur 840 nm et alignez-le activement. Ajustez l’intensité HV pour pouvoir voir le tissu et le signal SHG, sans dépasser 20 %. Ne réglez pas le gain et gardez le décalage égal à 0.
3. Ensuite, configurez les paramètres z-stack pour acquérir les images d’exemple. Utilisez une taille de numérisation de 1024 x 1024 et réglez la taille du pas sur 0,4 micron. Les empilements Z sont, en moyenne, d’environ 150 tranches, et ils partent de la gaine extérieure et se déplacent vers le centre du tendon jusqu’à ce que le signal SHG ne soit plus clair, produisant des sections optiques sagittales¹³.
4. Réglez la puissance du laser sur le mode Bright Z pour permettre la standardisation de la détection du signal. Une fois que les paramètres de démarrage/arrêt de la pile Z sont établis, réglez l’intensité laser de 4 au début de l’imagerie et de 6 à la fin de l’imagerie. Cela permet de maintenir la cohérence de la signalisation SHG à mesure que l’endoscope s’image plus profondément dans le tissu.
5. Une fois que les piles z ont été générées, traitez-les davantage dans ImageJ/FIJI pour créer un film de coupes optiques dans l’orientation transversale. Pour ce faire, ouvrez le logiciel ImageJ/FIJI¹⁴ et cliquez sur Image > Stacks > Reslice. Cela nous permettra d’avoir une vue transversale du tendon d’Achille, révélant la morphologie stellaire des ténocytes et leur orientation dans la matrice de collagène.

Résultats

Ce protocole est utile pour caractériser les cellules tendineuses et leur matrice extracellulaire (MEC) après une blessure, pendant le développement ou dans un état mutant. Avec une dissection et une préparation minutieuses de l’échantillon, des vidéos z-stack peuvent être générées à travers le tissu dans une orientation sagittale (Vidéo 1 et Vidéo 2). En utilisant ImageJ/FIJI pour traiter et redécouper les images, une vue transversale du tendon d’Achille est créée (Vidéos 3 et Vidéo 4). Cela révèle la morphologie stellaire des ténocytes et nous permet d’observer leur architecture unique au sein de la matrice dense de collagène.

En utilisant la microscopie multiphotonique et en exploitant les propriétés cristallines non centrosymétriques du collagène fibrillaire I, des images de coupe optique haute résolution qui capturent à la fois les cellules tendineuses et leur matrice ont été générées. Ces sections optiques sont isolées des empilements z pour les BHLHE40 +/- ; Scx-GFP et BHLHE40 -/- ; Souris Scx-GFP (Figure 1A, B, respectivement). Les coupes sont tirées de la pile z sagittale originale créée par l’imagerie 2-P et de la pile z retranchée générée à l’aide d’ImageJ/FIJI. En plus de cela, nous pouvons également utiliser cette méthode d’imagerie pour analyser les différences potentielles d’organisation du collagène, de morphologie cellulaire, etc., entre les deux souris.

Figure 1 : Coupe optique de BHLHE40 +/- ; Scx-GFP et BHLHE40 -/- ; Tendon de souris Scx-GFP. Z-stack a été capturé à l’aide d’un microscope multiphotonique. (A) Les sections optiques acquises à partir de l’empilement Z montrent le signal SHG et les cellules GFP+/Draq5+ dans un BHLHE40 +/- ; Scx-GFP (P30, femelle, 14,68 g) et (B) BHLHE40 -/- ; Scx-GFP (P30, femelle, 12,16 g). Les sections sagittales ont un signal SHG inclus alors que les sections transversales n’en ont pas. Les échantillons ont été contre-colorés avec Draq5. SHG capture la matrice de collagène dans les tissus. Barre d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Vidéo 1 : Vidéos Z-stack de la vue sagittale de BHLHE40 +/- ; Tendon de souris Scx-GFP. La pile Z a été capturée à l’aide d’un microscope à deux photons. La vidéo montre la vue sagittale du tendon d’Achille. Les échantillons ont été contre-colorés avec Draq5. SHG capture la matrice de collagène dans les tissus. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Vidéos Z-stack de la vue sagittale de BHLHE40 -/- ; Tendon d’Achille de souris Scx-GFP. La pile Z a été capturée à l’aide d’un microscope à deux photons. La vidéo montre la vue sagittale du tendon d’Achille chez une souris BHLHE40 KO null. Les échantillons ont été contre-colorés avec Draq5. SHG capture la matrice de collagène dans les tissus. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Vidéos Z-stack de la vue transversale de BHLHE40 +/- ; Tendon de souris Scx-GFP. La pile Z a été capturée à l’aide d’un microscope à deux photons. La vidéo montre la vue transversale du tendon d’Achille. Les échantillons ont été contre-colorés avec Draq5. SHG capture la matrice de collagène dans les tissus. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 4 : Vidéos Z-stack de la vue transversale de BHLHE40 -/- ; Tendon d’Achille de souris Scx-GFP. La pile Z a été capturée à l’aide d’un microscope à deux photons. La vidéo montre la vue transversale du tendon d’Achille chez une souris BHLHE40 KO nulle. Les échantillons ont été contre-colorés avec Draq5. SHG capture la matrice de collagène dans les tissus. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Discussion

Cet article présente une méthode pour préparer, disséquer et imager le tendon d’Achille de la souris, en utilisant les propriétés cristallines non centrosymétriques de l’ECM du tendon. Les étapes clés de la préparation des tissus comprennent la perméabilisation des contre-colorants et le placement correct des tissus dans une boîte de Pétri pendant l’imagerie. Au lieu de Draq5, Hoechst 33258 peut être utilisé à une dilution de 1:100 000¹³, mais Draq5 est préféré pour sa haute perméabilité, sa photostabilité et son photoblanchiment minimal. Le bon placement des tissus est crucial pour éviter les bulles entre la lamelle et le tendon, car une mauvaise orientation peut affecter les images résultantes.

Par rapport à d’autres méthodes de microscopie, la microscopie à génération de seconde harmonique (SHG) permet de capturer les fibrilles de collagène et les cellules tendineuses au sein de la matrice¹⁰. Combinées à des contre-colorants, ces données permettent d’analyser comment le développement, les blessures ou les mutations affectent la structure des tendons. La génération d’images 3D de l’ECM du tendon permet d’observer les sections optiques lors de leur passage à travers le tendon. Bien que la technologie multiphotonique offre une pénétration tissulaire supérieure, elle présente encore des limites dans l’imagerie à travers l’ensemble du tendon d’Achille, nécessitant des techniques supplémentaires comme la section. Cependant, cette méthode permet de produire environ 150 coupes optiques de 0,4 micron avec clarté, évitant ainsi la perturbation des tissus par sectionnement.

En résumé, cette méthode offre des informations précieuses sur la caractérisation du développement des tendons, des blessures, de la cicatrisation et du vieillissement, en imageant les cellules tendineuses et l’ECM à l’aide de la microscopie multiphotonique. L’utilisation de l’imagerie multiphotonique pour les coupes optiques et les vidéos z-stack dans tout le tissu permet de mieux comprendre les changements de morphologie des tendons dans des conditions expérimentales.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,5 M EDTA pH 8,0	Invitrogen	AM9262
2 mL microcentrifugeuses	tubes USA Scientific	1620-2700
20 mL flacon à scintillation	Sigma-Aldrich	Z190527-1PAK
4 % Paraformaldéhyde	Microscopie électronique Sciences	50-980-487	Utiliser l’ampoule PFA pour créer une solution PFA à 4
Biopsie Outil de poinçonnage	Ted Pella Inc.	15111-60
			Pétri de 60 x 15 mm
BHLHE40 souris knock-out nulles ou hétérozygotes dans un fond Scx-GFP  ;	The Jackson Laboratory	JAX ID #029732	MGI ID #3717419
Couvertures	Fisher	12-544-F	Peut utiliser n’importe quelle lamelle qui couvre la zone de la rondelle M20
dPBS Gibco		14190144
Draq5	ABCAM	ab108410
Ciseaux fins Tranchant de 21 mm	Outils de science fine	14060-10
FVMPE-RS laser multiphotonique microscope à balayage	Olympus
Gelfoam Éponge stérile Taille 50  ;	Pfizer	00009-0323-01
INSIGHT X3-OL Laser pulsé IR	Olympus
MaiTai HPDS-O IR Olympus
Phosphate-Buffered Saline (1x)	Invitrogen	AM9625	Diluer 10x PBS dans de l’eau milli-Q pour obtenir 1x solution
Rondelle plate en acier inoxydable M20  ;	McMaster-Carr
Triton X-100	MP Biomedicals	807426	Diluer Triton X-100 dans du dPBS pour obtenir une solution à 1 %
Ciseaux à ressort Vannas 4 mm tranchant	Fine Science Tools	15018-10
XLPlan N 25X WMP Lens