Ce protocole démontre une technique fiable et efficace pour isoler les fibroblastes primaires des tissus vaginaux humains préménopausiques ou postménopausiques. Les protocoles existants pour l’isolement des fibroblastes vaginaux ne tiennent pas compte des défis de l’isolement cellulaire du tissu sénescent. Du tissu vaginal a été obtenu chez des femmes après une chirurgie du prolapsus des organes pelviens.
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Article de méthode
Traitement tissulaire et isolement des fibroblastes primaires du vagin humain
Dans cet article
Résumé
Résumé
Le prolapsus des organes pelviens est un trouble qui impacte gravement la qualité de vie des femmes. Cela se produit lorsque les muscles et les ligaments s’affaiblissent et font descendre les organes pelviens plus bas dans le bassin, créant un renflement dans le vagin. La chirurgie pour corriger le prolapsus des organes pelviens a été un traitement de base. Récemment, on s’est intéressé de plus en plus à l’étude de la composition tissulaire des patients atteints de prolapsus au niveau cellulaire.
Il y a actuellement peu de consensus concernant l’effet de l’âge du donneur ou du patient sur les thérapies cellulaires. Les protocoles actuellement publiés pour l’isolement des fibroblastes vaginaux se concentrent sur les tissus préménopausiques ou négligent de commenter l’âge des tissus du donneur. La plupart des protocoles existants utilisent des modèles animaux. La consistance du tissu vaginal humain est plus dense que celle des tissus utilisés dans la plupart des protocoles. Dans cette étude, les tissus vaginaux humains ont été obtenus principalement de donneurs plus âgés, ce qui a probablement contribué à l’échec des protocoles existants.
L’objectif de cette étude est de décrire un protocole standard pour l’acquisition fiable de fibroblastes vaginaux humains, indépendamment de l’âge de la donneuse et du statut ménopausique. Les résultats ont été reproduits à l’aide de tissus provenant de neuf donneurs distincts qui ont subi une chirurgie du prolapsus des organes pelviens. Six patientes étaient ménopausées, la donneuse la plus âgée ayant 78 ans. L’âge médian des donneurs de tissus était de 59 ans.
Ici, nous décrivons une méthode fiable pour générer une suspension unicellulaire enrichie en fibroblastes en utilisant une combinaison de dissociation enzymatique et mécanique et de mise en commun de plusieurs biopsies vaginales d’un seul donneur. L’isolement fiable des fibroblastes primaires vaginaux humains peut être utile dans l’étude du prolapsus des organes pelviens ainsi que des interactions microbiome-hôte.
Introduction
Les disparités entre les sexes dans les sciences et la recherche sont un problème récurrent. La recherche sur les troubles qui touchent principalement les personnes de sexe féminin est sous-financée1. Le prolapsus des organes pelviens est un trouble fortement associé au sexe féminin. Cela se produit lorsque les muscles et les ligaments s’affaiblissent et font descendre les organes pelviens plus bas dans le bassin, créant un renflement dans le vagin2. On sait peu de choses sur les interactions cellulaires dans le contexte de cette physiopathologie, ni sur l’impact des facteurs au niveau tissulaire sur le succès des interventions chirurgicales3.
Les cellules primaires, plutôt que les lignées cellulaires, sont largement reconnues comme essentielles à la recherche clinique translationnelle pour fournir une plus grande pertinence physiologique4. Les cellules primaires sont prélevées directement dans le tissu corporel d’intérêt et peuvent imiter plus précisément la physiologie in vivo . L’isolement des fibroblastes primaires du vagin humain peut être utile pour étudier les mécanismes biologiques du prolapsus des organes pelviens et la modélisation de la maladie, en tenant compte des principales caractéristiques du donneur, telles que l’âge et le statut ménopausique.
Le prolapsus des organes pelviens affecte généralement les personnes âgées ou ménopausées. L’isolement et la prolifération des cellules de fibroblastes primaires dans l’étude de cette maladie sont difficiles en raison de la réduction des populations cellulaires et de la capacité clonogénique des donneurs plus âgés5. D’après notre expérience, l’utilisation des protocoles décrits précédemment pour la dissociation du tissu vaginal n’a pas permis d’extraire de fibroblastes d’une biopsie tissulaire standard de 1cm2 .
Grâce à une revue de la littérature, nous avons constaté que des études similaires étaient subdivisées en deux groupes : les modèles animaux, tels que les modèles murins6, et les modèles humains 7,8. En suivant le protocole de la souris, l’utilisation de ciseaux pour le traitement des tissus vaginaux humains a entraîné une digestion mécanique inadéquate. L’extrapolation des protocoles à l’aide de tissus murins et d’autres sites tissulaires9 n’a pas abouti.
La plupart des articles utilisant des échantillons vaginaux humains ont utilisé des tissus de personnes préménopausées avec prolapsus des organes pelviens 7,10. Bien que quelques articles aient rapporté l’utilisation d’échantillons provenant de personnes préménopausées et postménopausées11, ils n’ont pas décrit suffisamment en détail le protocole utilisé pour isoler avec succès les fibroblastes de donneurs plus âgés ou ménopausés. L’isolement et la modélisation de la maladie à l’aide de fibroblastes de tissu postménopausique peuvent être essentiels pour comprendre la physiopathologie cellulaire du prolapsus des organes pelviens, car cette affection a la prévalence la plus élevée chez les individus au cours de la décennie suivant la ménopause12.
Nous décrivons une méthode d’isolement et de culture d’une suspension unicellulaire enrichie en fibroblastes à partir de tissu vaginal humain en utilisant une combinaison de dissociation mécanique et enzymatique. Cet article décrit un protocole fiable sur la façon d’acquérir des fibroblastes vaginaux humains postménopausiques ou vieillissants. Il a été confirmé que les cellules isolées étaient des fibroblastes par examen morphologique à l’aide de la microscopie à contraste de phase et de l’immunofluorescence (IF) pour évaluer l’expression de la vimentine, de l’actine F et de l’actine musculaire α-lisse (α-SMA).
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Protocole
Du tissu vaginal a été obtenu chez des femmes subissant une chirurgie du prolapsus des organes pelviens. Le tissu vaginal recueilli après l’opération était considéré comme un déchet et serait autrement jeté. L’étude a été réalisée conformément aux directives institutionnelles et a été approuvée par le Conseil d’examen institutionnel du Massachusetts General Brigham.
1. Prélèvement de tissu vaginal sur la patiente
- Diagnostiquer le prolapsus des organes pelviens en prenant les antécédents et en utilisant les résultats de l’examen pelvien : Des mesures de quantification du prolapsus des organes pelviens (POP-Q) ont été obtenues en clinique, montrant des signes de prolapsus des organes pelviens.
- Utilisez les critères d’inclusion suivants : plus de 18 ans ; antécédents de prolapsus symptomatique des organes pelviens ; Choix pour la correction chirurgicale du prolapsus des organes pelviens.
- Exclure les personnes suivantes : Les femmes enceintes et les patients qui refusent de donner des tissus.
- Coupez l’excès de tissu vaginal comme étape nécessaire de la chirurgie du prolapsus des organes pelviens. Cet épithélium vaginal est excisé dans son épaisseur totale après les chirurgies suivantes : colporrhaphie antérieure, colporrhache postérieure et colpocléisis.
- Transportez les tissus au laboratoire dans un gobelet de prélèvement d’échantillons stérile avec une solution saline normale ou un milieu DMEM/F12 sans sérum (Gibco). Restez sur la glace.
2. Traitement et digestion des tissus
- Préparation des tissus
- Mesurez et coupez le tissu pour qu’il englobe toute l’épaisseur de l’épithélium vaginal, en créant des segments d’environ 1cm2.
- Assurer une mesure précise de la biopsie taille 1 cm2.
REMARQUE : Une surestimation de la taille de la biopsie tissulaire peut nuire à la digestion des tissus. - Préparez 2 à 3 biopsies vaginales supplémentaires de 1cm2 chacune provenant d’un seul donneur et mettez les biopsies de côté.
- Digestion mécanique
- Placez la biopsie vaginale dans une boîte de Pétri de culture cellulaire de 10 cm. Pipette de 500 à 1 000 μL de milieu sans sérum complété par 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 2,5 μg/mL d’amphotéricine Bonto le tissu vaginal pour empêcher le tissu de se dessécher.
- Coupez le tissu vaginal en petits fragments à l’aide de deux scalpels stériles (n° 11 ou n° 15) dans les deux mains.
- Assurez-vous que les extrémités des lames sont perpendiculaires à la surface du tissu. Appliquez une pression égale et constante sur la surface du tissu, à l’aide de deux scalpels. Effectuez une action de traction alternée pour couper le tissu en très petits morceaux.
- Répétez cette technique de hachage à l’aide de la technique des deux scalpels jusqu’à ce que l’échantillon ait une consistance uniforme avec des morceaux de 1 à 2 mm.
REMARQUE : La digestion mécanique à l’aide de cette technique à deux scalpels d’une biopsie de 1 cm2 devrait prendre environ 15 à 20 minutes. - Ajouter 2 à 3 ml de milieu DMEM/F12 sans sérum complété par 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 2,5 μg/mL d’amphotéricine B dans la plaque, en suspendant le tissu haché. Pipetez la solution contenant des fragments de tissu de haut en bas pour briser les amas
- Digestion enzymatique
- Transférez la solution contenant des fragments de tissu dans un tube conique de 15 ml. Ajoutez du milieu DMEM/F12 sans sérum dans la boîte de culture tissulaire où le tissu vaginal a été haché pour recueillir les fragments de tissu restants. Transférez la solution contenant des fragments de tissu dans le tube conique. Ajouter un média DMEM/F12 sans sérum supplémentaire jusqu’à ce que le volume total atteigne 10 ml.
- Dissoudre 5 mg de Liberase dans 1 mL d’eau stérile (5 mg/mL). Conserver dans des aliquotes de 230 μL à −20 °C jusqu’à un mois ou à −80 °C pendant 6 mois.
- Ajouter 230 μL de Liberase (stock 13 U/mL) dans le tube, avec une concentration finale de 0,3 U/mL.
REMARQUE : L’activité de Liberase peut varier d’un lot à l’autre. Décongeler chaque aliquote immédiatement avant utilisation au bain-marie. Évitez la congélation et la décongélation répétées. - Répétez les étapes 2.1 à 2.3 pour 2 ou 3 biopsies vaginales supplémentaires du même donneur.
REMARQUE : Conservez chaque solution contenant des fragments de tissu provenant d’une seule biopsie dans des tubes coniques séparés. Par exemple, 4 biopsies vaginales dans 4 tubes. Ceci est important pour une granulation cellulaire optimale après centrifugation. - Incuber les tubes pendant 3 h à 37 °C en agitant constamment et vigoureusement à l’aide d’un mélangeur d’échantillons.
- Placez un mélangeur d’échantillons dans un incubateur de CO2 . Maintenez une agitation constante. (Réglages du mélangeur d’échantillons : 25 tr/min de mouvement de rotation pendant 5 s, 30° de mouvement réciproque (rotation d’inclinaison) pendant 5 s et 2° de mouvement de vibration (vortex) pendant 3 s).
- Pendant l’incubation, agitez les tubes à intervalles de 30 minutes.
- Centrifuger les échantillons à 3 000 x g pendant 5 min. Retirez et jetez le surnageant.
- Remettre la pastille en suspension dans 1 à 2 mL de milieu DMEM/F12 avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 2,5 μg/mL d’amphotéricine B pour diluer l’enzyme Liperase. Pipetez vigoureusement jusqu’à ce que la pastille soit complètement remise en suspension.
3. Culture cellulaire
- Élimination de fragments de tissus non digérés
- Placez une passoire à cellules de 100 μm sur un récipient conique stérile de 50 mL.
- Regroupez la suspension cellulaire des multiples biopsies tissulaires du même donneur.
- Filtrer la suspension tissulaire/enzymatique en appuyant à l’aide d’un piston de seringue de 5 ml. Répétez cette étape jusqu’à ce que les fragments de tissu restants semblent être complètement enfoncés.
REMARQUE : Il peut y avoir du mucus des fragments de tissu vaginal qui n’est pas complètement travaillé à travers la crépine. Jetez le mucus avec la passoire cellulaire.
- Regroupement de cultures cellulaires
- Suspension de cellules regroupées sur plaque provenant de plusieurs biopsies vaginales (provenant du même donneur) sur une boîte de Pétri (60 mm x 15 mm).
- Incuber la boîte de Pétri dans un incubateur deCO2 à 37 °C pendant la nuit.
- Observez et confirmez la présence de cellules non adhérentes à l’aide d’un microscope à contraste de phase.
- Assurez-vous que la mise au point du microscope est au bas de la plaque.
REMARQUE : Il peut y avoir de nombreuses cellules immunitaires au premier plan. Un plus petit nombre de fibroblastes sera fixé au bas de la plaque. - Attendre 18 à 24 h avant de changer de milieu de culture cellulaire pour assurer une bonne adhérence cellulaire.
- Changez le milieu de culture tous les trois jours jusqu’à ce que 80 % de la confluence se produise. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, étendez-vous dans un flacon plus grand ou congelez des aliquotes de cellules pour une utilisation future.
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Résultats
Des tissus vaginaux ont été prélevés sur 10 donneurs indépendants subissant une chirurgie du prolapsus des organes pelviens. En utilisant le protocole décrit, des cellules ont été isolées de tissu vaginal humain. Les populations cellulaires avaient un aspect caractéristique allongé, plat et fusiforme. Comme d’autres études, nous avons observé des capacités de doublement cellulaire significativement plus lentes et une capacité clonogénique réduite des fibroblastes avec l’augmentation de l’âge du donneur. Ces différences o...
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Discussion
De nombreuses études antérieures ont rapporté comment isoler les fibroblastes primaires du vagin humain 3,7. Plusieurs études ont utilisé des tissus vaginaux humains provenant de personnes préménopausées atteintes de prolapsus des organes pelviens. Bien que quelques articles aient rapporté l’utilisation de tissus provenant de personnes préménopausées et postménopausées 7,11
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Déclarations de divulgation
Nous n’avons aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Nous tenons à exprimer notre gratitude à tous les membres du Vincent Center of Reproductive Biology du Massachusetts General Hospital, ainsi qu’à la Fondation du VIncent Memorial Hospital, pour leur généreux soutien. Un merci spécial au Dr Bo Rueda et à son laboratoire pour leurs précieuses suggestions et pour nous avoir prêté du matériel de laboratoire.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Amphotéricine B | Bio Techne | B23192 | |
| Passoire cellulaire (100 &mu ; m) | Tubes | 22363549 | |
| (15 mL) | Fisher Scientific ; | 14-959-53A | |
| DMEM/F12 ThermoFisher | Scientific | jetable à plumes 11320033 | |
| n° 15 | Socorex | FB.15 | |
| Sérum fœtal bovin | Sigma Aldrich | NC1983075 | |
| tubes à centrifuger coniques haute clarté (50 ml) | Fisher Scientific ; | 14-432-22 | |
| HulaMixer Mélangeur d’échantillons | ThermoFisher Scientific | 15920D | |
| Fibronectine humaine DuoSet ELISA | R& D Systems | DY1918-05 | |
| Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA | R& D Systems | DY6220-05 | |
| Liberase Research Grade | Sigma Aldrich | 05 401 119 001 | |
| Pénicilline/Streptomycine (5000U/ml) | ThermoFisher Scientific | 15070063 boîtes de | |
| Pétri, polystyrène (100 mm x 20 mm) | Millipore Sigma | P5606 | |
| Pipettes sérologiques (10 mL) | ThermoFischer Scientific | 170356N | |
| Seringues stériles (5 mL) | Fischer Scientific | 14-955-458 |
Références
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Réimpressions et autorisations
