Traitement tissulaire et isolement des fibroblastes primaires du vagin humain

Summary

Ce protocole démontre une technique fiable et efficace pour isoler les fibroblastes primaires des tissus vaginaux humains préménopausiques ou postménopausiques. Les protocoles existants pour l’isolement des fibroblastes vaginaux ne tiennent pas compte des défis de l’isolement cellulaire du tissu sénescent. Du tissu vaginal a été obtenu chez des femmes après une chirurgie du prolapsus des organes pelviens.

Abstract

Le prolapsus des organes pelviens est un trouble qui impacte gravement la qualité de vie des femmes. Cela se produit lorsque les muscles et les ligaments s’affaiblissent et font descendre les organes pelviens plus bas dans le bassin, créant un renflement dans le vagin. La chirurgie pour corriger le prolapsus des organes pelviens a été un traitement de base. Récemment, on s’est intéressé de plus en plus à l’étude de la composition tissulaire des patients atteints de prolapsus au niveau cellulaire.

Il y a actuellement peu de consensus concernant l’effet de l’âge du donneur ou du patient sur les thérapies cellulaires. Les protocoles actuellement publiés pour l’isolement des fibroblastes vaginaux se concentrent sur les tissus préménopausiques ou négligent de commenter l’âge des tissus du donneur. La plupart des protocoles existants utilisent des modèles animaux. La consistance du tissu vaginal humain est plus dense que celle des tissus utilisés dans la plupart des protocoles. Dans cette étude, les tissus vaginaux humains ont été obtenus principalement de donneurs plus âgés, ce qui a probablement contribué à l’échec des protocoles existants.

L’objectif de cette étude est de décrire un protocole standard pour l’acquisition fiable de fibroblastes vaginaux humains, indépendamment de l’âge de la donneuse et du statut ménopausique. Les résultats ont été reproduits à l’aide de tissus provenant de neuf donneurs distincts qui ont subi une chirurgie du prolapsus des organes pelviens. Six patientes étaient ménopausées, la donneuse la plus âgée ayant 78 ans. L’âge médian des donneurs de tissus était de 59 ans.

Ici, nous décrivons une méthode fiable pour générer une suspension unicellulaire enrichie en fibroblastes en utilisant une combinaison de dissociation enzymatique et mécanique et de mise en commun de plusieurs biopsies vaginales d’un seul donneur. L’isolement fiable des fibroblastes primaires vaginaux humains peut être utile dans l’étude du prolapsus des organes pelviens ainsi que des interactions microbiome-hôte.

Introduction

Les disparités entre les sexes dans les sciences et la recherche sont un problème récurrent. La recherche sur les troubles qui touchent principalement les personnes de sexe féminin est sous-financée¹. Le prolapsus des organes pelviens est un trouble fortement associé au sexe féminin. Cela se produit lorsque les muscles et les ligaments s’affaiblissent et font descendre les organes pelviens plus bas dans le bassin, créant un renflement dans le vagin². On sait peu de choses sur les interactions cellulaires dans le contexte de cette physiopathologie, ni sur l’impact des facteurs au niveau tissulaire sur le succès des interventions chirurgicales³.

Les cellules primaires, plutôt que les lignées cellulaires, sont largement reconnues comme essentielles à la recherche clinique translationnelle pour fournir une plus grande pertinence physiologique⁴. Les cellules primaires sont prélevées directement dans le tissu corporel d’intérêt et peuvent imiter plus précisément la physiologie in vivo . L’isolement des fibroblastes primaires du vagin humain peut être utile pour étudier les mécanismes biologiques du prolapsus des organes pelviens et la modélisation de la maladie, en tenant compte des principales caractéristiques du donneur, telles que l’âge et le statut ménopausique.

Le prolapsus des organes pelviens affecte généralement les personnes âgées ou ménopausées. L’isolement et la prolifération des cellules de fibroblastes primaires dans l’étude de cette maladie sont difficiles en raison de la réduction des populations cellulaires et de la capacité clonogénique des donneurs plus âgés⁵. D’après notre expérience, l’utilisation des protocoles décrits précédemment pour la dissociation du tissu vaginal n’a pas permis d’extraire de fibroblastes d’une biopsie tissulaire standard de 1^cm2 .

Grâce à une revue de la littérature, nous avons constaté que des études similaires étaient subdivisées en deux groupes : les modèles animaux, tels que les modèles murins⁶, et les modèles humains ^7,8. En suivant le protocole de la souris, l’utilisation de ciseaux pour le traitement des tissus vaginaux humains a entraîné une digestion mécanique inadéquate. L’extrapolation des protocoles à l’aide de tissus murins et d’autres sites tissulaires⁹ n’a pas abouti.

La plupart des articles utilisant des échantillons vaginaux humains ont utilisé des tissus de personnes préménopausées avec prolapsus des organes pelviens ^7,10. Bien que quelques articles aient rapporté l’utilisation d’échantillons provenant de personnes préménopausées et postménopausées¹¹, ils n’ont pas décrit suffisamment en détail le protocole utilisé pour isoler avec succès les fibroblastes de donneurs plus âgés ou ménopausés. L’isolement et la modélisation de la maladie à l’aide de fibroblastes de tissu postménopausique peuvent être essentiels pour comprendre la physiopathologie cellulaire du prolapsus des organes pelviens, car cette affection a la prévalence la plus élevée chez les individus au cours de la décennie suivant la ménopause¹².

Nous décrivons une méthode d’isolement et de culture d’une suspension unicellulaire enrichie en fibroblastes à partir de tissu vaginal humain en utilisant une combinaison de dissociation mécanique et enzymatique. Cet article décrit un protocole fiable sur la façon d’acquérir des fibroblastes vaginaux humains postménopausiques ou vieillissants. Il a été confirmé que les cellules isolées étaient des fibroblastes par examen morphologique à l’aide de la microscopie à contraste de phase et de l’immunofluorescence (IF) pour évaluer l’expression de la vimentine, de l’actine F et de l’actine musculaire α-lisse (α-SMA).

Protocol

Du tissu vaginal a été obtenu chez des femmes subissant une chirurgie du prolapsus des organes pelviens. Le tissu vaginal recueilli après l’opération était considéré comme un déchet et serait autrement jeté. L’étude a été réalisée conformément aux directives institutionnelles et a été approuvée par le Conseil d’examen institutionnel du Massachusetts General Brigham.

1. Prélèvement de tissu vaginal sur la patiente

1. Diagnostiquer le prolapsus des organes pelviens en prenant les antécédents et en utilisant les résultats de l’examen pelvien : Des mesures de quantification du prolapsus des organes pelviens (POP-Q) ont été obtenues en clinique, montrant des signes de prolapsus des organes pelviens.
2. Utilisez les critères d’inclusion suivants : plus de 18 ans ; antécédents de prolapsus symptomatique des organes pelviens ; Choix pour la correction chirurgicale du prolapsus des organes pelviens.
3. Exclure les personnes suivantes : Les femmes enceintes et les patients qui refusent de donner des tissus.
4. Coupez l’excès de tissu vaginal comme étape nécessaire de la chirurgie du prolapsus des organes pelviens. Cet épithélium vaginal est excisé dans son épaisseur totale après les chirurgies suivantes : colporrhaphie antérieure, colporrhache postérieure et colpocléisis.
5. Transportez les tissus au laboratoire dans un gobelet de prélèvement d’échantillons stérile avec une solution saline normale ou un milieu DMEM/F12 sans sérum (Gibco). Restez sur la glace.

2. Traitement et digestion des tissus

1. Préparation des tissus
   1. Mesurez et coupez le tissu pour qu’il englobe toute l’épaisseur de l’épithélium vaginal, en créant des segments d’environ 1^cm2.
   2. Assurer une mesure précise de la biopsie taille 1 cm².
      REMARQUE : Une surestimation de la taille de la biopsie tissulaire peut nuire à la digestion des tissus.
   3. Préparez 2 à 3 biopsies vaginales supplémentaires de 1^cm2 chacune provenant d’un seul donneur et mettez les biopsies de côté.
2. Digestion mécanique
   1. Placez la biopsie vaginale dans une boîte de Pétri de culture cellulaire de 10 cm. Pipette de 500 à 1 000 μL de milieu sans sérum complété par 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 2,5 μg/mL d’amphotéricine Bonto le tissu vaginal pour empêcher le tissu de se dessécher.
   2. Coupez le tissu vaginal en petits fragments à l’aide de deux scalpels stériles (n° 11 ou n° 15) dans les deux mains.
   3. Assurez-vous que les extrémités des lames sont perpendiculaires à la surface du tissu. Appliquez une pression égale et constante sur la surface du tissu, à l’aide de deux scalpels. Effectuez une action de traction alternée pour couper le tissu en très petits morceaux.
   4. Répétez cette technique de hachage à l’aide de la technique des deux scalpels jusqu’à ce que l’échantillon ait une consistance uniforme avec des morceaux de 1 à 2 mm.
      REMARQUE : La digestion mécanique à l’aide de cette technique à deux scalpels d’une biopsie de 1 cm² devrait prendre environ 15 à 20 minutes.
   5. Ajouter 2 à 3 ml de milieu DMEM/F12 sans sérum complété par 100 U/mL de pénicilline/streptomycine et 2,5 μg/mL d’amphotéricine B dans la plaque, en suspendant le tissu haché. Pipetez la solution contenant des fragments de tissu de haut en bas pour briser les amas
3. Digestion enzymatique
   1. Transférez la solution contenant des fragments de tissu dans un tube conique de 15 ml. Ajoutez du milieu DMEM/F12 sans sérum dans la boîte de culture tissulaire où le tissu vaginal a été haché pour recueillir les fragments de tissu restants. Transférez la solution contenant des fragments de tissu dans le tube conique. Ajouter un média DMEM/F12 sans sérum supplémentaire jusqu’à ce que le volume total atteigne 10 ml.
   2. Dissoudre 5 mg de Liberase dans 1 mL d’eau stérile (5 mg/mL). Conserver dans des aliquotes de 230 μL à −20 °C jusqu’à un mois ou à −80 °C pendant 6 mois.
   3. Ajouter 230 μL de Liberase (stock 13 U/mL) dans le tube, avec une concentration finale de 0,3 U/mL.
      REMARQUE : L’activité de Liberase peut varier d’un lot à l’autre. Décongeler chaque aliquote immédiatement avant utilisation au bain-marie. Évitez la congélation et la décongélation répétées.
   4. Répétez les étapes 2.1 à 2.3 pour 2 ou 3 biopsies vaginales supplémentaires du même donneur.
      REMARQUE : Conservez chaque solution contenant des fragments de tissu provenant d’une seule biopsie dans des tubes coniques séparés. Par exemple, 4 biopsies vaginales dans 4 tubes. Ceci est important pour une granulation cellulaire optimale après centrifugation.
   5. Incuber les tubes pendant 3 h à 37 °C en agitant constamment et vigoureusement à l’aide d’un mélangeur d’échantillons.
   6. Placez un mélangeur d’échantillons dans un incubateur de CO₂ . Maintenez une agitation constante. (Réglages du mélangeur d’échantillons : 25 tr/min de mouvement de rotation pendant 5 s, 30° de mouvement réciproque (rotation d’inclinaison) pendant 5 s et 2° de mouvement de vibration (vortex) pendant 3 s).
   7. Pendant l’incubation, agitez les tubes à intervalles de 30 minutes.
   8. Centrifuger les échantillons à 3 000 x g pendant 5 min. Retirez et jetez le surnageant.
   9. Remettre la pastille en suspension dans 1 à 2 mL de milieu DMEM/F12 avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 100 U/mL de pénicilline/streptomycine, 2,5 μg/mL d’amphotéricine B pour diluer l’enzyme Liperase. Pipetez vigoureusement jusqu’à ce que la pastille soit complètement remise en suspension.

3. Culture cellulaire

1. Élimination de fragments de tissus non digérés
   1. Placez une passoire à cellules de 100 μm sur un récipient conique stérile de 50 mL.
   2. Regroupez la suspension cellulaire des multiples biopsies tissulaires du même donneur.
   3. Filtrer la suspension tissulaire/enzymatique en appuyant à l’aide d’un piston de seringue de 5 ml. Répétez cette étape jusqu’à ce que les fragments de tissu restants semblent être complètement enfoncés.
      REMARQUE : Il peut y avoir du mucus des fragments de tissu vaginal qui n’est pas complètement travaillé à travers la crépine. Jetez le mucus avec la passoire cellulaire.
2. Regroupement de cultures cellulaires
   1. Suspension de cellules regroupées sur plaque provenant de plusieurs biopsies vaginales (provenant du même donneur) sur une boîte de Pétri (60 mm x 15 mm).
   2. Incuber la boîte de Pétri dans un incubateur de_CO2 à 37 °C pendant la nuit.
   3. Observez et confirmez la présence de cellules non adhérentes à l’aide d’un microscope à contraste de phase.
   4. Assurez-vous que la mise au point du microscope est au bas de la plaque.
      REMARQUE : Il peut y avoir de nombreuses cellules immunitaires au premier plan. Un plus petit nombre de fibroblastes sera fixé au bas de la plaque.
   5. Attendre 18 à 24 h avant de changer de milieu de culture cellulaire pour assurer une bonne adhérence cellulaire.
   6. Changez le milieu de culture tous les trois jours jusqu’à ce que 80 % de la confluence se produise. Lorsque les cellules atteignent une confluence de 80 à 90 %, étendez-vous dans un flacon plus grand ou congelez des aliquotes de cellules pour une utilisation future.

Results

Des tissus vaginaux ont été prélevés sur 10 donneurs indépendants subissant une chirurgie du prolapsus des organes pelviens. En utilisant le protocole décrit, des cellules ont été isolées de tissu vaginal humain. Les populations cellulaires avaient un aspect caractéristique allongé, plat et fusiforme. Comme d’autres études, nous avons observé des capacités de doublement cellulaire significativement plus lentes et une capacité clonogénique réduite des fibroblastes avec l’augmentation de l’âge du donneur. Ces différences ont été marquées lorsque l’on compare les fibroblastes isolés d’individus plus âgés (75-78 ans) à ceux isolés d’individus jeunes (35-47 ans). Les cellules de donneurs d’âge moyen présentaient un profil intermédiaire (56-61 ans). Les taux de prolifération cellulaire ont d’abord été estimés par visualisation directe à l’aide d’un microscope à contraste de phase avec la même densité d’ensemencement connue.

Figure 1 : Représentation schématique du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 1 montre une représentation schématique du protocole de dissociation et d’isolement. Suite à ces étapes, ce protocole a donné un taux de réussite de 90 % de l’isolement primaire des fibroblastes chez neuf donneurs sur dix dans un nombre suffisant de cellules pour permettre la sous-culture de cellules. L’âge médian des donneurs était de 59 ans.

Protocole (Auteur, année)	Tissu de donneur du protocole original	Nombre de donateurs	Âge du donneur en années	Fibroblastes obtenus	Morphologie
Ruiz-Zapata et al., 2013	Vagin humain	3	56-78	Non	N/A
Khan et coll., 2016	Oreille et queue de souris	2	48-65	Non	N/A
Waise et al., 2019	Tissus humains	3	56-75	Non	N/A
Nadalutti et al., 2020	Prépuce humain	1	65	Non	N/A
Courant	Vagin humain	10	35-79	Oui	En forme de fuseau

Tableau 1 : Comparaison des protocoles pour l’isolement réussi des fibroblastes vaginaux humains. Comparaison de différents protocoles existants avec le nôtre et mise en évidence par des résultats morphologiques.

Le tableau 1 montre les résultats de l’utilisation d’autres protocoles pour tenter d’isoler les fibroblastes vaginaux dans cette étude. Nous avons développé un protocole standard pour l’isolement des fibroblastes primaires de la muqueuse vaginale et des donneurs âgés⁵.

Nous avons testé plusieurs protocoles établis, y compris ceux énumérés dans le tableau 1, et n’avons observé aucun succès dans l’isolement cellulaire à l’aide de ces protocoles dans notre étude. Nous proposons les raisons suivantes pour expliquer leurs limites.

Le protocole publié par Ruiz et ^al.3 consiste à gratter le fascia et à couper le tissu en petits morceaux. D’après notre expérience, il est difficile de distinguer les fascias, et les tentatives de grattage peuvent entraîner une réduction significative du rendement cellulaire. Bien que cette méthode soit simple, elle manque de détails essentiels, ce qui limite sa généralisabilité. De plus, la digestion mécanique dans ce protocole semble insuffisante pour le tissu post-ménopausique, qui a tendance à être plus dense.

Les protocoles publiés par Khan et ^al.9 et Waise et ^al.13 utilisent des ciseaux pour le hachage des tissus, qui n’introduisent pas de forces de cisaillement multidirectionnelles significatives par rapport à la technique du scalpel. D’après notre expérience, la méthode des ciseaux n’a pas non plus fonctionné efficacement.

Enfin, le protocole de Nadalutti et ^al.14 , qui utilisait la méthode de l’explantation, n’a pas réussi à produire des fibroblastes entre nos mains. Cette méthode peut être moins efficace en raison de la nature du tissu postménopausique, qui peut nécessiter un traitement mécanique et enzymatique plus agressif pour dissocier les fibroblastes avec succès.

Figure 2 : Image en contraste de phase des cellules suspendues le jour 0. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 2 montre les cellules suspendues le jour 0 à l’aide de notre protocole.

Figure 3 : Image en contraste de phase de fibroblastes primaires vaginaux au 14e jour de la culture à un grossissement de 100x à partir d’une suspension cellulaire groupée de trois biopsies tissulaires de 1 cm². Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

La figure 3 montre des fibroblastes primaires à un grossissement de 100x à partir d’une suspension cellulaire groupée de 3 biopsies tissulaires de 1 cm² de dimensions.

L’identité des fibroblastes a été étudiée par des techniques d’immunofluorescence comme décrit précédemment, avec des modifications mineures. Pour vérifier l’origine cellulaire des cellules vaginales primaires, nous avons utilisé des biomarqueurs spécifiques d’origine fibroblastique via coloration immunofluorescente. Les cellules ont été identifiées comme des fibroblastes sur la base d’une coloration positive de la vimentine (Figure 4), de l’actine F et de la α-SMA à partir d’échantillons de tissus préménopausiques et postménopausiques (Figure 5). Les fibroblastes ont été cultivés jusqu’à l’expansion avec une viabilité élevée (>90 %) pour être utilisés dans des expériences.

Figure 4 : Coloration positive de la vimentine des fibroblastes vaginaux. Les fibroblastes primaires isolés des tissus préménopausiques et postménopausiques ont été soumis à une analyse FI et les images ont été prises à un grossissement de 200x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Coloration positive de l’actine F et de l’α-SMA des fibroblastes vaginaux. Les résultats de l’expression des protéines par rapport au contrôle des IgG. Les images ont été collectées à un grossissement de 200x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

De nombreuses études antérieures ont rapporté comment isoler les fibroblastes primaires du vagin humain ^3,7. Plusieurs études ont utilisé des tissus vaginaux humains provenant de personnes préménopausées atteintes de prolapsus des organes pelviens. Bien que quelques articles aient rapporté l’utilisation de tissus provenant de personnes préménopausées et postménopausées ^7,11, ils n’ont pas décrit suffisamment en détail le protocole utilisé pour isoler avec succès les fibroblastes de donneurs plus âgés ou ménopausés. La paroi vaginale est plus épaisse chez les femmes ménopausées atteintes de prolapsus génital que chez les femmes préménopausées, ce qui peut expliquer la difficulté accrue de l’isolement dans cette population¹³. L’isolement réussi des donneuses ménopausées est essentiel pour la modélisation et l’investigation de la maladie, car les troubles du plancher pelvien sont plus fréquents dans les groupes postménopausiques ou plus âgés.

Nous avons établi un protocole pour récolter et cultiver avec succès et cohérence des fibroblastes vaginaux humains de donneurs âgés de 35 à 78 ans. L’origine cellulaire des cellules vaginales primaires a été confirmée par des biomarqueurs d’origine fibroblastique par coloration immunofluorescente.

La procédure d’isolement des fibroblastes vaginaux humains présentée ici permet l’isolement et la culture de cellules primaires de fibroblastes. D’après notre expérience, l’utilisation de protocoles précédemment publiés pour les tissus animaux⁹et humains^{3, 14, 16} pour la dissociation des cellules primaires n’a pas permis d’extraire de fibroblastes d’échantillons de vagin humain dans cette étude¹⁴.

Nous avons émis l’hypothèse de deux raisons probables des défis de dissociation cellulaire du tissu vaginal humain : (1) l’épaisseur dermique de la muqueuse est plus grande chez les donneurs âgés et par rapport à celle du tissu non muqueux des donneurs plus âgés^13,17, ce qui rend la dissociation cellulaire plus difficile et (2) la densité des fibroblastes peut être nettement réduite chez les personnes âgées¹⁷.

Compte tenu de ces défis, il y a quelques étapes critiques dans ce protocole qui ne doivent pas être modifiées. La première étape critique est la mise en place d’une digestion mécanique très rigoureuse. Ici, nous utilisons la technique des deux scalpels. D’après notre expérience, la substitution par des ciseaux pour hacher le tissu ne donne pas de fragments assez petits pour dissocier les fibroblastes du tissu vaginal humain.

L’autre étape critique est la mise en commun de la suspension cellulaire et la mise en commun de 3 à 4 biopsies de pleine épaisseur (1 cm²) provenant d’un seul donneur. Ceci est nécessaire pour obtenir suffisamment de cellules pour la culture en cours. Dans tous les cas, nous avons prélevé beaucoup plus de tissu que 1^cm2 , car l’excès d’épithélium vaginal est coupé comme une partie nécessaire de la chirurgie du prolapsus des organes pelviens. Dans cette étude, nous n’avons regroupé que des suspensions cellulaires provenant du même donneur afin d’étudier et de différencier les caractéristiques cellulaires et la prolifération entre les différents donneurs.

Notre protocole présente un avantage certain : la digestion mécanique et enzymatique permet d’obtenir de meilleurs rendements pour le tissu postménopausique, mais n’a pas d’impact négatif sur les échantillons de préménopause.

Nous reconnaissons plusieurs limites à notre protocole. L’accès aux tissus vaginaux humains peut être difficile dans les situations où la chirurgie du prolapsus vaginal n’est pas pratiquée. La nécessité de regrouper des suspensions cellulaires de plusieurs échantillons de biopsie tissulaire peut également constituer une limitation.

En conclusion, ce protocole d’acquisition de fibroblastes vaginaux humains sera un outil utile pour les recherches futures sur les troubles du plancher pelvien, en particulier chez les personnes ménopausées, ainsi qu’un ajout important à la recherche sur la santé des femmes.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Amphotéricine B	Bio Techne	B23192
Passoire cellulaire (100 &mu ; m)	Tubes	22363549
(15 mL)	Fisher Scientific  ;	14-959-53A
DMEM/F12 ThermoFisher	Scientific	jetable à plumes 11320033
n° 15	Socorex	FB.15
Sérum fœtal bovin	Sigma Aldrich	NC1983075
tubes à centrifuger coniques haute clarté (50 ml)	Fisher Scientific  ;	14-432-22
HulaMixer Mélangeur d’échantillons	ThermoFisher Scientific	15920D
Fibronectine humaine DuoSet ELISA	R& D Systems	DY1918-05
Human Pro-Collagen I alpha 1 DuoSet ELISA	R& D Systems	DY6220-05
Liberase Research Grade	Sigma Aldrich	05 401 119 001
Pénicilline/Streptomycine (5000U/ml)	ThermoFisher Scientific	15070063 boîtes de
Pétri, polystyrène (100 mm x 20 mm)	Millipore Sigma	P5606
Pipettes sérologiques (10 mL)	ThermoFischer Scientific	170356N
Seringues stériles (5 mL)	Fischer Scientific	14-955-458