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Article de méthode

Perturbation de la barrière hémato-encéphalique de la souris par de petites vésicules extracellulaires provenant de placentas humains hypoxiques

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DOI :

10.3791/65867

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26 janvier 2024

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1Vascular Physiology Laboratory, Department of Basic Sciences, Universidad del Bío-Bío, Chillan, 2Nursery School, Health Faculty, Universidad Santo Tomás, Los Angeles, 3Obstetrics and Gynecology Department, Herminda Martin Clinical Hospital, Chillan, 4Faculty of Medicine, Universidad Católica de la Santísima Concepción, Concepcion, 5Laboratory of Animal Biotechnology, Department of Animal Science, Faculty of Veterinary Sciences, Universidad de Concepción, Chillan, 6Group of Research and Innovation in Vascular Health (GRIVAS Health), Chillan

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Un protocole est présenté pour évaluer si les petits VE (sEVs) isolés à partir d’explants placentaires cultivés dans des conditions hypoxiques (modélisation d’un aspect de la prééclampsie) perturbent la barrière hémato-encéphalique chez les souris femelles adultes non gravides.

Résumé

Les complications cérébrovasculaires, y compris l’œdème cérébral et les accidents vasculaires cérébraux ischémiques et hémorragiques, constituent la principale cause de mortalité maternelle associée à la prééclampsie. Les mécanismes sous-jacents de ces complications cérébrovasculaires restent flous. Cependant, ils sont liés à un dysfonctionnement placentaire et à une perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE). Néanmoins, la connexion entre ces deux organes distants est encore en cours de détermination. De plus en plus de preuves suggèrent que le placenta libère des molécules de signalisation, y compris des vésicules extracellulaires, dans la circulation maternelle. Les vésicules extracellulaires sont classées en fonction de leur taille, les petites vésicules extracellulaires (sEV de moins de 200 nm de diamètre) étant considérées comme des particules de signalisation critiques dans des conditions physiologiques et pathologiques. Dans la prééclampsie, il y a une augmentation du nombre de sEV circulants dans la circulation maternelle, dont la fonction de signalisation n’est pas bien comprise. Les sEV placentaires libérés lors de la prééclampsie ou de placentas de grossesse normaux exposés à l’hypoxie induisent un dysfonctionnement endothélial cérébral et une perturbation de la BHE. Dans ce protocole, nous évaluons si les sEVs isolés à partir d’explants placentaires cultivés dans des conditions hypoxiques (modélisation d’un aspect de la prééclampsie) perturbent la BHE in vivo.

Introduction

Environ 70 % des décès maternels dus à la prééclampsie, un syndrome de grossesse hypertensive caractérisé par une altération des processus de placentation, un dysfonctionnement endothélial systémique maternel et, dans les cas graves, une défaillance multiviscérale 1,2, sont associés à des complications cérébrovasculaires aiguës 3,4. La plupart des décès maternels surviennent dans les pays à revenu faible ou intermédiaire5. Cependant, les mécanismes sous-jacents ne sont pas encore clairs malgré la pertinence clinique et épidémiologique des complications cérébrovasculaires associées à la prééclampsie.

D’autre part, les vésicules extracellulaires (VE) (diamètre ~30-400 nm) sont des médiateurs essentiels de la communication intercellulaire entre les tissus et les organes, y compris l’interaction materno-placentaire6. En plus des protéines et des lipides à la surface externe, les VE transportent une cargaison à l’intérieur (protéines, ARN et lipides). Les VE peuvent être classés en (1) exosomes (diamètre ~50-150 nm, également appelés petits VE (sEV)), (2) VE moyens/grands et (3) corps apoptotiques, qui diffèrent par leur taille, leur biogenèse, leur contenu et leur fonction de signalisation potentielle. La composition des VE est déterminée par les cellules dont ils sont issus et le type de maladie7. Les VE dérivés de syncytiotrophoblastes expriment la phosphatase alcaline placentaire (PLAP)8,9, qui détecte les petites VE circulantes dérivées du placentaire (PDsEV) pendant la grossesse. De plus, le PLAP aide à discerner les changements dans la cargaison de PDsEVs et leurs effets sur la prééclampsie par rapport aux grossesses normotensives 10,11,12,13,14,15.

Le placenta a été reconnu comme le composant nécessaire dans la physiopathologie de la prééclampsie16 ou des complications cérébrales associées à cette maladie 17,18,19. Cependant, on ne sait pas comment cet organe éloigné pourrait induire des altérations de la circulation cérébrale. Étant donné que les sEV jouent un rôle central dans la communication de cellule à cellule en raison de leur capacité à transférer des composants bioactifs des cellules donneuses aux cellules receveuses 6,20,21, un nombre croissant d’études ont associé les sEV placentaires à la génération de dysfonction endothéliale maternelle 21,22,23,24, y compris les cellules endothéliales cérébrales 25,26chez les femmes atteintes de prééclampsie. Ainsi, la compromission de la fonction endothéliale cérébrale peut entraîner une perturbation de la barrière hémato-encéphalique (BHE), un composant essentiel dans les complications cérébrovasculaires associées à la prééclampsie 3,27.

Néanmoins, les résultats précliniques utilisant des vaisseaux cérébraux de rat exposés au sérum de femmes atteintes de prééclampsie28 ou des cellules endothéliales cérébrales humaines exposées au plasma de femmes atteintes de prééclampsie29 ont rapporté que le ou les facteurs circulants induisent une perturbation de la BHE. Malgré plusieurs candidats susceptibles de nuire à la BHE présente dans la circulation maternelle pendant la prééclampsie, tels que des taux élevés de cytokines pro-inflammatoires (c’est-à-dire le facteur de nécrose tumorale)18,28 ou de régulateurs vasculaires (c’est-à-dire le facteur de croissance de l’endothélium vasculaire (VEGF))29,30,31, ou des molécules oxydatives telles que les lipoprotéines oxydées (oxo-LDL)32,33, entre autres34, aucun d’entre eux n’établit de lien direct entre le placenta et la BHE. Récemment, des sEV isolés de placentas hypoxiques ont montré la capacité de perturber la BHE chez des souris femelles non gestantes25. Étant donné que les sEV placentaires peuvent être porteurs de la plupart des facteurs circulants énumérés avec la capacité de perturber la BHE, les sEV sont considérés comme des candidats appropriés pour connecter le placenta lésé, être le porteur de facteurs circulants nocifs et perturber la BHE dans la prééclampsie.

Ce protocole nous permet d’étudier si les sEVs isolés à partir d’explants placentaires cultivés dans des conditions hypoxiques peuvent perturber la BHE chez des souris femelles non gestantes afin de comprendre la physiopathologie des complications cérébrales au cours de la prééclampsie.

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Protocole

La recherche a été menée conformément aux principes énoncés dans la Déclaration d’Helsinki et avec l’autorisation des comités d’éthique respectifs. Tous les participants humains ont donné leur consentement éclairé avant le prélèvement de l’échantillon, comme indiqué précédemment25. De plus, le Comité de bioéthique et de biosécurité de l’Université Bío-Bío a approuvé ce projet (subvention Fondecyt 1200250). Le travail sur les animaux a été mené conformément aux principes cardinaux des trois R dans l’utilisation des animaux dans l’expérimentation35, et selon les recommandations des directives pour le soin et l’utilisation des animaux de laboratoire publiées par l’Institut national de la santé des États-Unis. Les animaux ont été gardés dans des environnements appropriés au Vivarium de l’Université de Bío-Bío. Des placentas frais (n = 4) ont été prélevés dans l’heure suivant la césarienne élective chez des mères (âgées de 28 à 31 ans) ayant une grossesse normale à terme (38 à 41 semaines de gestation). Des césariennes ont été pratiquées à l’hôpital clinique Herminda Martin, à Chillan, au Chili,comme indiqué précédemment. Pour appliquer le modèle in vivo , des souris femelles non gestantes âgées de 4 à 6 mois (souche C57BLACK/6) ont été utilisées. Ils ont été divisés en trois groupes expérimentaux : (1) témoins (sans traitement), (2) traités avec des sEV de normoxie (sEVs-Nor) et (3) traités avec des sEV provenant de placentas hypoxiques cultivés (sEVs-Hyp), qui ont été utilisés pour évaluer la perturbation de la BHE in vivo25. Toutes les solutions injectées étaient stériles. De plus, la préparation des VEV a été effectuée dans des conditions aseptiques et sous une cagoule de biosécurité de classe II afin d’éviter toute contamination.

1. Explants de culture placentaire

  1. Pour extraire les explants de placentas de grossesse normale, consultez la méthode publiée par Miller et al. 200536.
  2. Retirez délicatement les caillots de la plaque basale du placenta humain à l’aide d’une pince stérilisée. Extraire de petits explants pour obtenir une extraction tissulaire finale de 10 g.
  3. Assurez-vous que les explants placentaires sont retirés des quatre quadrants de la partie maternelle du placenta. Assurez-vous que les tissus dévitalisés et les zones calcifiées sont exclus.
  4. Pour manipuler le tissu placentaire, faites-le sur de la glace, dans des conditions stériles et dans une enceinte de sécurité biologique.
  5. Lavez les explants (au moins trois fois) avec de grandes quantités (cinq volumes d’explants) de solution tampon phosphatée froide (4 °C) (PBS 1x, pH 7,4) pour éliminer le plus de sang possible. Centrifugeuse (252 x g pendant 10 min) à température ambiante entre les lavages.
  6. Remettre en suspension 10 g d’explants lavés dans 20 mL de milieu de culture complété par 2 % de sérum de veau fœtal, 100 UI/mL de pénicilline et 100 μg/mL de streptomycine (voir le tableau des matériaux).
  7. Placez la suspension dans une boîte de culture de 100 mm. Laisser les explants pendant 2 h dans un incubateur à 37 °C avec 21% d’oxygène et 5% de CO2.
  8. Après cela, lavez à nouveau les explants avec 1x PBS à 37 °C (trois fois). Centrifugeuse (252 x g pendant 10 min) à température ambiante entre les lavages.
  9. De plus, remettre le tissu en suspension dans 20 mL de milieu de culture préalablement appauvri en nanoparticules.
    REMARQUE : Pour l’appauvrissement des nanoparticules, effectuer l’ultracentrifugation (120 000 x g pendant 18 h à température ambiante) et la microfiltration (filtre de 0,22 μm).
  10. Divisez les explants remis en suspension dans deux boîtes de culture (100 mm). Chaque boîte de culture doit contenir 10 mL d’explants remis en suspension.
  11. Ensuite, placez l’une des boîtes contenant les explants placentaires dans des conditions de culture standard (37 °C avec 8 % d’oxygène et 5 % de CO2), tout en plaçant l’autre dans une chambre hypoxique avec 1 % d’O2.
    REMARQUE : (FACULTATIF) L’analyse de la viabilité tissulaire peut être effectuée à l’aide des mêmes extractions tissulaires et du même dosage au bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (essai MTT) que celui décrit ailleurs37,38. Utilisez la concentration totale de protéines mesurée dans les homogénats d’explants pour normaliser les valeurs MTT.
  12. Après 18 h de culture, récolter le milieu conditionné des explants dans un nouveau tube de 15 ml.
    REMARQUE : À cette étape, les milieux conditionnés peuvent être congelés (-80 °C) pendant une période prolongée (semaines).

2. Isolement des sEVs dérivés du placenta

  1. Isolez les sEV du milieu conditionné à l’aide du protocole de centrifugation différentielle et de microfiltration à la suite des rapports publiés précédemment25,39.
  2. Effectuer une centrifugation séquentielle pour le milieu conditionné récolté. Les étapes séquentielles des centrifugations sont (1) 300 x g pendant 10 min, (2) 2000 x g pendant 10 min, (3) 10 000 x g pendant 30 min et (4) 120 000 x g pendant 2 h. Effectuer les centrifugations à température ambiante.
  3. Dans toutes ces centrifugations, à l’aide d’une pipette de 20 à 100 μL, prélever soigneusement le surnageant et jeter la pastille.
  4. Une fois cela fait, faites passer le dernier surnageant collecté à travers un filtre de 0,22 μm (voir le tableau des matériaux). Par la suite, effectuez une centrifugation supplémentaire à 120 000 x g pendant 18 h à température ambiante.
  5. Après cela, jetez le surnageant tout en remettant en suspension la pastille (qui contient des sEV placentaires) dans 500 μL de PBS (pH 7,4) et passez à nouveau à travers un filtre de 0,22 μm. Enfin, effectuez une dernière centrifugation à 120 000 x g pendant 3 h à température ambiante.
  6. Ensuite, remettre en suspension la pastille (qui contient des sEV placentaires) dans 500 μL de PBS (pH 7,4, précédemment appauvri en sEV) et passer à travers un filtre de 0,22 μm.
  7. Étiquetez les échantillons comme étant des stocks de sEVs-Normoxia (sEVs-Nor) ou sEVs-Hypoxia (sEVs-Hyp).
    NOTA : Préparer des aliquotes de 50 à 100 μL des sEV isolés en vue d’une expérimentation plus poussée. Les petits véhicules électriques peuvent être stockés à -80 °C pendant une période prolongée (mois).
  8. Caractériser les sEVs placentaires en fonction de leur taille, de leur nombre et de leur marqueur, comme indiqué précédemment25. Le diamètre moyen idéal des particules de sEV est de 50 à 150 nm.
    NOTA : La caractérisation des sEVs comprend la détection positive de CD63, Tsg101, Alix et HSP70 (c’est-à-dire pour caractériser la population de sEVs enrichie en exosomes). De plus, utilisez le PLAP comme marqueur de l’origine placentaire25.
  9. Mesurez la quantité totale de protéines dans la solution de sEVs à l’aide de la trousse d’analyse des protéines BCA en suivant les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux).
    REMARQUE : La figure 1 montre un aperçu de la culture de l’explant placentaire et de l’isolement des vésicules extracellulaires.

3. Injection de souris

  1. Anesthésier l’animal dans une chambre d’induction anesthésique avec une distribution d’isoflurane à 5 % (voir le tableau des matériaux). Vérifiez le niveau d’anesthésie en pinçant les orteils.
  2. Après ~40 s, placez la souris dans le système d’anesthésie à l’aide d’un masque facial et maintenez un taux d’anesthésie de 2% d’isoflurane.
  3. Ensuite, placez l’animal sur une plate-forme chauffante (voir tableau des matériaux) à une température ambiante de 28 °C. Gardez les yeux lubrifiés avec des larmes artificielles.
  4. Avant l’injection, diluer les sEVs placentaires (200 μg de protéines totales) avec un tampon phosphate (pH, 7,4) jusqu’à atteindre un volume final de 70 μL.
  5. Désinfectez la zone d’injection à l’aide d’éthanol à 70 % et de cotons-tiges. Assurez-vous d’utiliser une seringue à insuline avec une aiguille de 30 G pour injecter la solution de sEVs.
    REMARQUE : La seringue peut être positionnée sur la plate-forme chauffante pendant 5 min pour acquérir une température physiologique.
  6. Ensuite, injectez la solution dans la veine jugulaire externe. Cette étape nécessite une formation spéciale.
    REMARQUE : La procédure doit être effectuée avec précaution, en rétractant lentement l’aiguille et en aspirant doucement les signes de reflux sanguin.
  7. Après l’injection, appliquez une légère pression sur la zone injectée pendant ~15 s avec un coton-tige sec. Après cela, remettez les animaux dans leurs cages respectives.
  8. Assurez-vous d’évaluer la conscience et le comportement pendant 15 minutes. Un indicateur de l’accomplissement de la conscience est la récupération de l’activité motrice totale de l’animal.
    REMARQUE : Assurez-vous de maintenir une température chaude dans les cages des animaux.

4. Échelle de coma et de comportement murin rapide (RMCBS)

  1. Utiliser le RMCBS pour évaluer les paramètres neurologiques et de bien-être des animaux40.
    REMARQUE : RMCBS permet une évaluation rapide (~ 3 min) avec un stress minimal de l’animal dû à l’intervention de l’opérateur. RMCBS a dix paramètres (chaque score est de 0 à 2).
  2. Évaluez le bien-être de la souris à l’aide de l’échelle RMCBS à 0 h (avant l’injection de sEV) et 3 h, 6 h, 12 h et 24 h après l’injection.
    REMARQUE : Effectuer l’analyse de la claudine-5 (6 h après l’injection de sEVs) et de l’extravasation bleue d’Evan (24 h après l’injection de sEVs) pour évaluer la perturbation de la BHE (Figure 2).

5. Analyse de l’extravasation bleue d’Evan

  1. Après l’injection placentaire de sEVs (24 h), anesthésier les souris comme décrit à l’étape 3.1.
  2. Préparer la solution d’Evan’s Blue (2 %, diluée dans une solution tampon de phosphate, 1x) (voir le tableau des matériaux).
  3. À l’aide de l’accès rétro-orbital25, injecter la solution bleue d’Evan à raison de 2 mL/kg.
  4. Laisser circuler la solution bleue d’Evan pendant 20 min sous anesthésie.
  5. Ensuite, effectuez une perfusion intracardiaque en suivant le protocole41 décrit précédemment avec une solution saline (~ 3 mL, 0,9 %, p/v) pour éliminer le colorant bleu d’Evan de la circulation. Cette étape est obligatoire.
    REMARQUE : Pour cette procédure, augmentez l’anesthésie à 5% et vérifiez un plan d’anesthésie profond (c’est-à-dire une réduction drastique de la fréquence respiratoire).
  6. Exposer le cœur par thoracotomie médiale41 (Figure 3).
  7. Après cela, fixez l’animal entier avec une perfusion intracardique de solution de paraformaldéhyde (4% dans PBS, v/v).
    REMARQUE : Vérifiez la rigidité de la queue pour surveiller la fixation appropriée.
  8. De plus, une fois la fixation terminée, extrayez soigneusement le cerveau, pesez-le et photographiez-le41. Prenez des photos avec tout le cerveau près d’une règle42.
  9. Ensuite, placez le cerveau dans un trancheur de souris cérébrale (voir le tableau des matériaux).
  10. Disséquer le cerveau en neuf sections, grue-caudale, y compris le cervelet (100 μm par section).
  11. Après la dissection, visualisez et capturez des images des coupes de cerveau dans un microscope à zoom stéréoscopique (voir le tableau des matériaux).
  12. Utilisez les images capturées pour quantifier l’extravasation bleue d’Evan à l’aide du logiciel ImageJ (voir la table des matériaux).
    REMARQUE : Pour analyser la présence du colorant bleu d’Evan, définissez les valeurs bleues d’Evan en utilisant un contrôle positif de la section cérébrale (provenant d’un animal témoin injecté avec un colorant mais sans perfusion intracardique). Les valeurs bleues d’Evan obtenues par le témoin positif se situent généralement entre 75 et 110 dans l’histogramme d’intensité du canal bleu (Figure 4).
  13. Assurez-vous que les images cérébrales sont analysées à l’aveugle par le groupe expérimental respectif afin d’éviter les biais de l’observateur. Alternativement, quantifier l’extravasation bleue d’Evan par homogénéisation cérébrale suivie de la spectroscopie43.
    NOTE : Dans des expériences distinctes, en utilisant des cerveaux fraîchement isolés de souris injectées de sEV (6 h), analyser les niveaux de protéines de la claudine 5 (CLND-5) (voir le tableau des matériaux), une jonction serrée critique impliquée dans l’étanchéité de la BHE44 (Figure 5).

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Résultats

Ce protocole évalue la capacité des sEVs dérivés de placentas cultivés en hypoxie à perturber la BHE chez des souris non gravides. Cette méthode permet de mieux comprendre la connexion potentielle entre le placenta et le cerveau dans des conditions normales et pathologiques. En particulier, cette méthode peut constituer une approximation pour analyser la participation des sEVs placentaires à l’apparition de complications cérébrales dans la prééclampsie.

Contrairement aux souris injectées avec ...

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Discussion

Cette étude révèle de nouvelles informations sur les dommages potentiels résultant des sEV isolés d’explants placentaires cultivés dans des conditions hypoxiques sur la perturbation de la barrière hémato-encéphalique des rongeurs. Le mécanisme pathologique implique une réduction de CLND-5 dans la région postérieure du cerveau25.

Des études antérieures ont révélé que les sEV plasmatiques de personnes atteintes de prééclampsie induisent un dysfonctionnement endothélial da...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les chercheurs de GRIVAS Health pour leur précieuse contribution. De plus, les sages-femmes et le personnel clinique du service d’obstétrique et de gynécologie appartiennent à l’hôpital de Chillan, au Chili. Fondée par Fondecyt Regular 1200250.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Souris adultes cerveau slecer matrice 3D imprimé en 3DFichier en libre accèsSouris adultesSouris adultes trancheur de cerveau. Imprimé en filament PLA.
Anticorps primaire anti-actineSigma-AldrichClon AC-74Anticorps pour le contrôle de charge (Western blot)
Anticorps primaire anti-Claudin5Santa cruz Biotechnologysc-374221Anticorps primaire pour la protéine de jonction serrée CLDN5 de souris BBB (Western blot)
Kit de protéines BCAThermo Scientific23225Kit pour la mesure de la concentration en protéines
Milieux de culture #200 500 mLThermo Fisher Scientificm200500Milieux de culture pour explants placentaires
D180 Incubateur CO2RWD Life scienceD180Incubateur standard pour stabiliser les explants et cultiver les sEVs-Nor
Evans blue dye  ; > 75 % 10 gSigma-AldrichE2129.10GColorant pour analyser la perturbation de la barrière hémato-encéphalique IN VIVO
Sérum fœtal bovin 500 mLThermo Fisher Scientific16000044Facteur de croissance additif pour milieux de culture 200
Himac Ultracentrifuge CP100NXHimac eppendorfgroup 5720410101Ultracentrifugeuse pour milieux > 1,20 000 x g
Logiciel ImageJNIHhttps://imagej.nih.gov/ij/download.html
Isoflurane x 100 mLUSP Baxter212-094Agent anesthésique volatil inhalé pour souris
Kit CellTiter 96 Non radioactif  ;Promega0000105232In vitro pour la viabilité des explants placentaires
IgG de souris Anticorps secondairesThermo Fisher ScientificMO 63103Anticorps secondaire pour CLDN5 (western blot)
NanoSight NS300Malvern Panalytical90278090Analyse par nanosuivi des particules d’explants placentaires en milieu conditionné
Paraformaldehide E solution à 97 % 500 mLThermo Fisher ScientificA11313.22Solution fixatrice pour coupes de tissu cérébral et perfusion intracardique (une fois dilué)
PBS 1 X pH 7,4 500 mLThermo Fisher Scientific10010023Solution de lavage pour explants de placenta
Péniciline-streptomicine 100x 20 mLThermo Fisher Scientific10378016Antiobiotiques pour explants placentaires milieux
de cultureProOX C21 Cytocentric O2 et CO2 Contrôleur de sous-chambreBioSpherixSCR_021131 <sub>2 pour induire l’hypoxie dans une chambre scellée pour sEVs-Hyp
Sodium Thiopental 1 gChemie7061d’euthanasie humanitaire
Système d’anesthésie à faible débit SomnosuiteKent ScientificsSS-01Vaporisateur d’isoflurane pour petits rongeurs
Plate-forme de réchauffement chirurgicalKent ScientificsA41166Plate-forme de réchauffement pour l’anesthésie de maintenance chez la souris
Filtres à seringue, polytétrafluoroéthylène (PTFE), hydrophobe, 0,22 & micro ; m, Stérile, 25 mmMatériel de laboratoire Southern10026Filtration de milieux conditionnés récoltés à partir d’explants placentaires  ;
Microcentrifugeuses de table à grande vitesse  ; HITACHI himac CT15E/CT15RESystèmes médicaux Hitachi6020Centrifugations en série de milieux conditionnés < 1,20, 000 x g
Stéréomicroscope trinoculaire à lumière transmide et réfléchissante 10x-160x  ;Center Medical2597Stéréomicroscope pour l’enregistrement des coupes de cerveau
agent

Références

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