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Article de méthode

Conservation du don de porcs après mort circulatoire (DDC) par perfusion et transplantation hépatique orthotopique

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DOI :

10.3791/65879

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14 juin 2024

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1Department of Hepatobiliary Surgery and Liver Transplant Center, PLA General Hospital of Southern Theatre Command: People's Liberation Army General Hospital of Southern Theatre Command, 2Second Department of Oncology, Guangdong Second Provincial General Hospital, 3Guangdong Shunde Industry Design Institute (Guangdong Shunde Innovative Design Institute), 4Department of Hepatopancreas Surgery, Foshan First People's Hospital

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit la méthodologie d’établissement d’un modèle porcin utilisant une perfusion automatique (MP) à température variable pour la préservation du foie du donneur, suivie d’une transplantation hépatique orthotopique (OLTx). Il vise à promouvoir le taux de réussite d’OLTx en utilisant le don de donneurs après mort circulatoire (DCD) hépatique et à établir un modèle stable.

Résumé

L’entreposage frigorifique statique (SCS) conventionnel exacerbe les lésions ischémiques dans le foie DCD, entraînant de graves complications pour les receveurs de greffe. Pour résoudre ce problème, l’application clinique de la technologie MP pour la préservation du foie du donneur est en cours. Parallèlement, les efforts se concentrent sur le développement de divers instruments MP, validés par des expériences sur des modèles animaux pertinents. Des essais efficaces sur de grands animaux jouent un rôle central dans les applications cliniques. Cependant, des défis persistent dans la conservation ex vivo des foies DCD et la procédure de transplantation chez les porcs. Ces obstacles comprennent la préservation prolongée du foie des donneurs, la réalisation de tests de viabilité, le soulagement des lésions ischémiques et le raccourcissement de la phase anhépatique. L’utilisation d’un dispositif MP à température variable facilite la préservation prolongée des foies DCD grâce aux modes séquentiels de perfusion de machine oxygénée à double hypothermie (DHOPE) et de perfusion de machine normamère (NMP). Ce protocole enrichit le modèle OLTx porcin en améliorant la qualité des foies DCD, en optimisant la technique d’anastomose et en réduisant la durée de la phase anhépatique.

Introduction

La transplantation hépatique reste le seul traitement curatif des maladies du foie en phase terminale et de certains cancers du foie. Malgré des progrès significatifs dans l’approvisionnement, la préservation, les techniques opératoires et l’immunosuppression post-greffe, un taux de mortalité notable persiste parmi les patients sur la liste d’attente en raison d’une pénurie d’organes de donneurs compatibles. L’un des principaux défis consiste à préserver les foies obtenus à partir de DCD, car ces organes nécessitent des soins spécialisés pour atténuer les lésions ischémiques1. La perfusion ex vivo sur machine hépatique offre une méthode unique pour préserver et évaluer les greffons hépatiques DCD avant la transplantation2. Les essais cliniques ont souligné la faisabilité et l’innocuité de la perfusion ex vivo par machine hépatique pour des donneurs à critères standard et élargis, utilisant des conditions hypothermiques ou normothermiques3. Il est important de noter que les interventions thérapeutiques pendant la perfusion ex vivo de la machine hépatique se sont révélées prometteuses dans la réduction des lésions d’ischémie-reperfusion (IRI)4.

Dans le but de prolonger la durée de conservation et d’améliorer la qualité des greffes hépatiques DCD, les expériences animales en cours visent à optimiser les performances des dispositifs MP et à affiner la méthode de conservation du foie ex vivo 5. Porcine OLTx sert de modèle optimal pour la recherche clinique, validant la qualité de conservation de la MP. Cependant, les lésions ischémiques du donneur, l’instabilité hémodynamique et la congestion intestinale pendant la phase anhépatique de l’OLTx porcin ont collectivement un impact sur le taux de survie du modèle porcin 6,7.

Un dispositif MP à température variable qui intègre à la fois les modes NMP et DHOPE a été utilisé pour préserver les foies DCD des porcins dans le protocole suivant. Ce dispositif facilite la conservation ex vivo prolongée des foies DCD et atténue les lésions ischémiques du foie du donneur par rapport à la SCS traditionnelle. L’appareil assure la régulation de la température, prend en charge le transport sur de longues distances et fournit une perfusion bionique ainsi qu’une évaluation dynamique et précise de la qualité du donneur. Le protocole contient toutes les informations nécessaires à un modèle stable de préservation hépatique du DCD utilisant un mode séquentiel DHOPE-NMP suivi d’OLTx porcin, y compris la transition des paramètres de perfusion, l’optimisation de la technique d’anastomose et la procédure de la phase anhépatique.

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Protocole

Toutes les expériences sur les animaux ont été menées conformément à l’ordonnance sur la gestion des animaux expérimentaux (ministère des Sciences et de la Technologie de la République populaire de Chine, 2017). Des porcs miniatures femelles Bama (40-45 kg) ont été utilisés. Le protocole de l’étude a été approuvé par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux de l’Hôpital général du Commandement du théâtre sud de l’APL, en Chine. Les porcs ont été logés dans le centre de recherche pendant 1 semaine avant la transplantation, puis ont jeûné, mais avec un accès libre à l’eau pendant 12 heures avant l’expérience. Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Acquisition de donateurs

  1. Induction de l’anesthésie et de l’analgésie : Administrer l’atropine par voie intramusculaire à une dose de 0,02 mg/kg. Par la suite, administrer le Zoletil 50 par voie intramusculaire à raison de 2 à 3,5 mg/kg pour induire la sédation. Pour l’analgésie, administrer le chlorhydrate de tramadol par voie intraveineuse à une dose de 2 mg/kg.
  2. Induire une anesthésie générale par une perfusion intraveineuse de propofol à un taux de 2-3 mg/kg/h, à l’aide d’une canule papillon de 24 G insérée dans une veine marginale externe de l’oreille.
  3. Placez le porc en décubitus dorsal sur la table d’opération. Effectuer une intubation endotrachéale et une ventilation mécanique. La surveillance continue de la fréquence cardiaque et de la saturation en oxygène est effectuée via une oxymétrie de pouls placée sur la queue. Réglez la concentration d’isoflurane dans le vaporisateur à 2%.
  4. Appliquez une solution iodée à 3% pour désinfecter la peau de la zone. Après avoir laissé la solution iodée sécher naturellement à l’air, essuyez-la avec de l’alcool à 70 %. Répétez le processus de désinfection trois fois.
  5. Réalisation d’une laparotomie médiane, étendue latéralement vers la droite. Libérez le foie de ses attaches ligamentaires, isolez le canal biliaire et sectionnez près du duodénum après la ligature.
  6. Disséquez soigneusement l’artère hépatique (HA) et la veine porte (PV) des tissus environnants. Mobiliser l’axe cœliaque et tracer jusqu’à l’aorte abdominale.
  7. Disséquez l’aorte abdominale (AA) et la veine cave inférieure (IVC) pour faciliter le prélèvement sanguin. Administrer un bolus intraveineux d’héparine sodique (25 000 U) pour l’anticoagulation.
  8. Canuler l’AA et l’IVC de manière séquentielle et recueillir le sang dans des poches de dextrose acide-citrate pour une utilisation ultérieure pour la NMP (environ 1800-2000 ml). Équipez le PV d’un cathéter spécifique. Conservez le sang prélevé à une température de 4 °C.
  9. Induire l’arrêt cardiaque par perfusion intracardiaque de chlorure de potassium (20 mEq).
    REMARQUE : L’intervalle de temps commençant par l’arrêt cardiaque est enregistré en temps d’ischémie chaude (WIT). Le foie subit 30 minutes de WIT sans aucune manipulation, suivie d’un rinçage in situ par l’aorte abdominale (AA) et la veine porte (PV) avec 2 L de solution froide de citrate adénine hypertonique.
  10. Excise le foie, en s’assurant que tous les vaisseaux restants sont longs. Conservez une section de tissu de l’aorte abdominale pour la canulation artérielle. Équipez le PV d’un cathéter spécifique.
  11. Placez le foie dans un sac d’organes stériles sur de la glace. Lister toutes les branches artérielles distales du foie et canuler le canal cholédoque.

2. Initiation avec le mode DHOPE

  1. Connectez le cathéter de la veine porte et de l’aorte abdominale au dispositif MP. Perfuser le foie avec 1,5 L de la solution de perfusion machine de l’Université du Wisconsin (UW-MPS, voir tableau des matériaux), enrichie en héparine sodique (6250 U) et en céfoxitine sodique (1 g).
  2. Réglez les paramètres de perfusion selon lesquels l’AH est maintenu sous contrôle de pression à 25 mmHg, tandis que le PV est sous contrôle de débit à 200 mL/min. Assurez la saturation en oxygène en pompant en continu 100 % d’oxygène dans le perfusat à un débit de 1 L/min.
    REMARQUE : Le système surveille et enregistre de manière autonome des paramètres clés tels que la température de perfusat, les pressions HA et PV et les débits tout au long du processus de perfusion.
  3. Réglez le mode de perfusion à une température de 4 °C. Perfuser le greffon hépatique pendant 8 h (Figure 1).

3. Perfusion avec le mode NMP

  1. Faites passer le dispositif de perfusion de l’appareil en mode NMP. Élevez la température du système à 37 °C. Amorcez l’appareil avec 2 L d’un mélange composé de sang total et de perfusat de perfusion machine.
  2. Rincer le donneur avec 1,5 L de solution saline normale à 4 °C et le placer dans un bol avec de la glace. Changez le liquide de perfusion et amorcez la même machine pour le mode NMP. Transférez le foie dans l’appareil une fois la phase de réchauffement terminée pendant 10 min (Figure 1).
  3. Établissez un flux constant d’oxygène vers la veine porte et l’artère hépatique avant la mise en place du foie. Maintenir une fraction de l’oxygène inspiré (FiO2) à 60 %.
  4. Réglez les pressions de perfusion artérielle à 80/60 mmHg (pression systolique/pression diastolique). Réglez la perfusion de la veine porte à un débit constant de 0,5 mL/min/g (poids du foie), puis à 0,75 mL/min/g (poids du foie) après la première heure.
  5. Tout au long des 6 h de NMP, surveillez constamment les paramètres tels que la pression, les débits et la température. Effectuez un test de viabilité via une évaluation biochimique du perfusate à des intervalles de 1 h, y compris l’analyse des gaz sanguins, de l’acide lactique, de la glycémie et de la fonction hépatique.

4. Hépatectomie du receveur

  1. Injecter un Zoletil 50 (2-3,5 mg/kg) et de l’atropine (0,02 mg/kg) par voie intramusculaire au porc receveur. Administrer une dose intraveineuse de chlorhydrate de tramadol (2 mg/kg) pour la gestion de la douleur.
  2. Induire une anesthésie générale par perfusion intraveineuse de propofol (2-3 mg/kg/h). Le porc est ensuite orienté en position couchée sur une table d’opération équipée d’un tapis chauffant. Le vaporisateur d’isoflurane est réglé à 2%.
  3. Effectuez une laparotomie sur la ligne médiane, prolongée latéralement vers la droite. Couvrez le gros intestin et l’intestin grêle avec une serviette stérile. Faciliter la mise en place d’un écarteur abdominal pour une visibilité totale.
  4. Libérez le foie de ses attaches ligamentaires. Isolé le canal biliaire, ligacé et sectionné - effectué. Disséquer l’artère hépatique rétrogradement jusqu’à la division de l’artère gastroduodénale. Clampez l’artère hépatique commune en proximale à l’artère gastroduodénale à l’aide d’une pince bulldog. Libérez la veine porte (PV) du tissu adhérent et fixez-la du côté distal.
  5. Clamper la partie supérieure de la veine cave, suivie de la dissection de la partie supérieure de la veine cave du côté du diaphragme, en réservant une partie du tissu de la veine cave intrahépatique pour la suture ultérieure. La partie inférieure de la veine cave est traitée de la même manière, en conservant une partie du tissu hépatique sur la veine cave. Retirez le foie.
  6. Effectuer une immunosuppression en injectant par voie intraveineuse une dose de 500 mg de méthylprednisolone.

5. Mise en place d’un greffon orthotopique et anastomose vasculaire

  1. Retirez le foie du donneur du dispositif de perfusion de l’appareil. Installez le PV à l’aide d’un cathéter spécifique, puis perfuser avec une solution saline froide à 4 °C à partir du cathéter PV. Perfuser avec 5 % d’albumine combiné à une solution saline froide à 4 °C à partir du cathéter PV. Ce processus est crucial pour l’élimination du sang et le refroidissement du foie.
  2. Insérez un cathéter spécialisé dans la veine porte et fixez-le par ligature avant de retirer le foie d’origine du receveur, permettant ainsi la connectivité au cathéter compatible sur le PV du donneur. En même temps, clamper la veine cave inférieure du greffon donneur (Figure 2B).
  3. Effectuez une anastomose de bout en bout de la cave suprahépatique à l’aide de sutures en polypropylène monofilament 4-0 à deux bras.
  4. Connectez les deux extrémités de la veine porte avec des canules assorties pour rétablir la circulation sanguine. Une solution saline à l’héparine est rincée dans la canule avant l’insertion. L’ouverture intermittente de la veine porte et le déclampage temporaire de la veine cave inférieure facilitent l’évacuation du liquide de perfusion résiduel.
  5. Retirez la pince de la cave suprahépatique et effectuez une anastomose de bout en bout de la veine cave inférieure avec des sutures en polypropylène monofilament 4-0.
  6. Rincer l’artère hépatique du donneur avec 10 ml de solution saline héparinée et poser une pince supplémentaire pour bouledogue distalement pour prévenir les saignements dorsaux. Effectuez une anastomose de bout en bout à l’aide d’une suture en polypropylène monofilament 7-0.
  7. Insérez un cathéter dans les voies biliaires aux extrémités du donneur et du receveur, avec les cathéters solidement suturés pour assurer la stabilité de la position.
  8. Retirez le cathéter veineux porte. Effectuez une anastomose de bout en bout de la veine porte à l’aide d’une suture en polypropylène monofilament 4-0.

6. Soins et surveillance post-transplantation

  1. Maintenez la ventilation du porc receveur pendant encore 2 heures.
  2. Allumez la climatisation de l’unité de soins intensifs pour augmenter la température intérieure. Un coussin chauffant est utilisé pour garder le porc au chaud.
  3. Prélever régulièrement des échantillons de sang pour tester les gaz du sang et les fonctions hépatiques et rénales à 24 heures d’intervalle.
  4. Scellez l’aiguille à demeure avec une solution saline d’héparine. L’aiguille à demeure de la veine auriculaire du porc doit être correctement gérée pour éviter de tomber après le mouvement du porc.
  5. Mettez fin à la ventilation une fois que le porc est capable de respirer pleinement.
  6. Remettez le porc receveur dans la porcherie et placez-le dans un lit en bois d’environ 10 cm de haut jusqu’à ce qu’il soit réveillé de l’anesthésie. Le fond du lit en bois est rembourré d’une serviette pour éviter que l’urine ne s’accumule autour du corps de l’animal, et la température est maintenue par un chauffage 24 heures sur 24 dans la porcherie.
  7. Injectez la méthylprednisolone à une dose initiale de 250 mg à partir du POD 1, suivie d’une réduction progressive de la dose pour l’immunosuppression.
  8. Administrer des analgésiques par voie intraveineuse sur le POD 1 (buprénorphine 0,01-0,05 mg/kg). Administrer du tramadol par voie intramusculaire sur POD2-POD5 (100 mg/kg toutes les 12 h). Fournir une dose orale de céphalosporine (2 mg/kg) deux fois par jour à partir du POD 2, et ajouter des liquides de nutrition. La consommation d’eau n’est pas limitée.
  9. Retirez le canal veineux environ 5 jours après la chirurgie.
  10. Observez le volume et la couleur de l’urine. Observez le changement de couleur des selles après l’opération.
  11. Sacrifiez les porcs s’ils souffrent d’acidose persistante, d’hypoglycémie, de signes d’hémorragie ou d’insuffisance hépatique.
  12. Réaliser l’euthanasie 5 jours après OLTx par exsanguination sous anesthésie profonde à l’isoflurane (5%, >2,5 MAC).

7. Technique du modèle porcin de contrôle SCS

  1. Utilisez des procédures d’anesthésie identiques à celles ci-dessus. Disséquez l’aorte abdominale (AA) et la veine cave inférieure (IVC) pour faciliter le drainage sanguin, en utilisant la même méthode d’héparinisation. Canuler séquentiellement l’AA et l’IVC. Provoquer rapidement un arrêt cardiaque par perfusion intracardiaque de chlorure de potassium (20 mEq).
  2. Prélever le foie du donneur rapidement après 30 minutes d’administration de WIT, en préservant les tissus adéquats de la veine cave inférieure hépatique proximale.
  3. Placez le greffon hépatique dans un sac de conservation et plongez-le dans une solution froide de l’Université du Wisconsin (UW) pour une conservation à 4 °C pendant 8 h.
  4. Conservez le foie en NMP à 37 °C pendant 6 h, tout en effectuant OLTx directement avec l’autre froup (Figure 1).

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Résultats

Les foies DCD ont subi une procédure DHOPE-NMP comme mesure de protection avant d’être transplantés chez les porcs receveurs. La procédure de DHOPE-NMP a été la suivante : les foies DCD (n = 8) avec 30 min WIT ont été conservés dans DHOPE pendant 8 h au premier stade, suivis d’un transfert en mode NMP pendant 6 h supplémentaires. Par la suite, ces greffons ont été utilisés pour la LT chez les receveurs porcins. L’image schématique décrivant les groupes et le protocole est illustrée à la figure 1

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Discussion

La MP hépatique est actuellement largement utilisée dans les essais cliniques, mais d’autres recherches précliniques utilisant de grands modèles animaux restent nécessaires 5,6. L’OLTx porcin présente des défis importants qui se traduisent par de faibles taux de réussite. Ces défis comprennent l’ischémie chaude du donneur, les variations anatomiques et l’intolérance au clampage prolongé de la veine cave et de la veine porte

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

L’étude a été soutenue par le programme de recherche scientifique clé pour le développement d’un système de perfusion hépatique ex vivo de la ville de Foshan, en Chine[(2020)A007] ; Fondation de recherche fondamentale et appliquée de Guang Dong (2020B1515120031) ; Fondation de recherche scientifique Guang Zhou (202002030201).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Respirateur d’anesthésieMindray,ShenzhenWATO EX-20  ;
Analyseur biochimique automatique  ; MNCHIP, Chine  ; Celercare V5
Bama cochons miniatures femelles  ;Pearl Lab Animal Sci & Tech Co,Ltd (Guangdong, Chine).  ;40-45 kg  ;
Analyseur de gaz du sang  ;  ; Moniteur ECG Abbotti-STAT300
Shenzhen Ericon Medical Equipment Co., LTD ChineM-9000S
Glace flocon de neige entièrement automatiqueChangshu Shenghai Electric Co., Ltd. Chine
Perfusat en NMP5 % Albumine sérique humaine 100-150 mL,
Sang total 1,2-1,5 L,
2,5 % NaHCO3 21 mL,
10 % CaCL2 7 mL
Héparine 5000 U
Céfoxlétain 1 g,
Métronidazole 500 mg,
Taurocholate de sodium 5 g,
Insuline à courte durée d’action 72 U,
Solution totale de nutrition parentérale 250-500 mL.
Cathéter PotalTechnologie Jinxin,Shunde,ChineCathéter veineux portail pour canule personnalisée de diamètre interne variable (6-8,5 mm)
Centrifugeuse de réfrigération  ;hermo Fisher Scientific - CN
La carte de test des gaz du sang CG8/CG4  ; Abbott
La carte de test CHEM 8  ; Abbott
Le dispositif de perfusion de machine hépatique ex vivoDevocean Medical Instrument Co., Ltd, Guangdong, ChineDEVOCEAN-LIVER 2000Il s’agit d’un dispositif de perfusion de machine hépatique ex vivo biomimétique multimode, à température contrôlée, capable de préserver le foie à l’extérieur du corps pendant 24 heures
UW Solution de stockage à froid.   ;Bridge to Life, Ltd., États-UnisLe foie Belzer UWdu groupe SCS a été conservé dans la solution de stockage frigorifique UW.
Solution de perfusion de machines UWBridge to Life, Ltd., États-UnisBelzer MPS· Adénine (base libre) 0,68 g,
Chlorure de calcium (dihydraté) 0,068 g
Dextrose (+) 1,80 g
Glutathion (réduit) 0,92 g,
HEPES (acide libre) 2,38 g,
Hydroxyéthylamidon 50,0 g,
Gluconate de magnésium 1,13 g,
Mannitol 5,4 g,
Phosphate de potassium (monobasique) 3,4 g,
Ribose, D(-) 0,75 g,
Gluconate de sodium 17,45 g,
Hydroxyde de sodium 0,70 g,
Eau stérile pour injection à 1000 mL
Extracteur sous videSMAFDYX-2A

Références

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