Ce protocole rationalise la production de vecteurs rétroviraux et la transduction des lymphocytes T murins, facilitant ainsi la génération efficace de cellules CAR-T chez la souris.
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Article de méthode
Génération efficace de lymphocytes T à récepteur antigénique chimérique (CAR) murin
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les thérapies cellulaires modifiées utilisant des cellules T à récepteur antigénique chimérique (CAR)-T ont atteint une efficacité remarquable chez les personnes atteintes d’hémopathies malignes et sont actuellement en cours de développement pour le traitement de diverses tumeurs solides. Jusqu’à présent, l’évaluation préliminaire de nouveaux produits cellulaires CAR-T a principalement eu lieu dans des modèles tumoraux de xénogreffe utilisant des souris immunodéficientes. Cette approche est choisie pour faciliter la prise de greffe réussie de cellules CAR-T humaines dans le cadre expérimental. Cependant, les modèles murins syngéniques, dans lesquels les tumeurs et les cellules CAR-T sont dérivées de la même souche de souris, permettent d’évaluer les nouvelles technologies CAR dans le contexte d’un système immunitaire fonctionnel et d’un microenvironnement tumoral complet (TME). Le protocole décrit ici vise à rationaliser le processus de génération de cellules CAR-T chez la souris en présentant des méthodes standardisées pour la transduction rétrovirale et la culture ex vivo de cellules T. Les méthodes décrites dans ce protocole peuvent être appliquées à d’autres constructions de CAR au-delà de celles utilisées dans cette étude pour permettre l’évaluation de routine de nouvelles technologies de CAR dans les systèmes immunocompétents.
Introduction
Les thérapies adoptives à base de lymphocytes T exprimant des récepteurs antigéniques chimériques (CAR) ont révolutionné le domaine de l’immunothérapie du cancer en exploitant la puissance du système immunitaire adaptatif pour cibler et éliminer spécifiquement les cellules cancéreuses antigéniques positives1. Bien que le succès des thérapies cellulaires CAR-T ciblant les tumeurs malignes à cellules B ait été validé cliniquement, les études précliniques réalisées sur des modèles animaux restent vitales pour le développement de nouvelles thérapies CAR-T ciblant les tumeurs solides. Cependant, une efficacité clinique limitée ....
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Protocole
Toutes les procédures animales ont été effectuées avec l’approbation de l’Institutional Animal Care and Use Committee (Université Columbia, protocoles AC-AABQ5551 et AC-AAAZ4470) en utilisant des souris femelles BALB/c ou CF57BL/6 âgées de 6 à 8 semaines pesant entre 20 et 25 g. Les animaux ont été obtenus auprès d’une source commerciale (voir le tableau des matériaux). Ce protocole est structuré autour des « jours post-activation » des lymphocytes T murins, et la production virale commence au jour -2. Le rétrovirus peut être stocké à -80 °C après la production initiale, et pour une utilisation future de ce protocole, on peut commencer par l’étape 2, ....
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Résultats
Le protocole décrit ici vise à standardiser le processus de transduction des lymphocytes T murins pour la génération de cellules CAR-T de souris. La figure 1 fournit une description détaillée des étapes à suivre. Le processus commence par la production de vecteurs rétroviraux par co-transfection de composants viraux dans des cellules Phoenix Eco. La figure 2 fournit une image de la densité optimale des cellules Phoenix Eco le jour de la transfection. Le.......
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Discussion
Ce protocole décrit les étapes et les réactifs nécessaires à la transduction rétrovirale des lymphocytes T murins afin de générer des lymphocytes CAR-T pour des études in vivo . L’optimisation des conditions de transduction rétrovirale permet d’obtenir une expression robuste de la CAR sans avoir besoin d’une concentration virale par ultracentrifugation ou réactifs supplémentaires. Cependant, il existe de multiples modifications qui peuvent être appliquées à cette méthodologie.
Bien qu.......
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Déclarations de divulgation
Aucun conflit d’intérêts n’a été déclaré.
Remerciements
Nous remercions L. Brockmann pour la relecture critique du manuscrit. Ce travail a été soutenu par NIH 1R01EB030352 et UL1 TR001873.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| 0,45 &mu ; m filters | MilliporeSigma | SLHVR33RS | |
| seringue de 1 mL ; | Fisher Scientific ; | 14-955-450 | |
| Tubes de microcentrifugation de 1,5 mL | Fisher Scientific ; | 05-408-135 | |
| Seringue de 10 mL | BD | 14-823-16E | |
| 100 &mu ; m passoire | Corning | 07-201-432 | |
| 15 cm Boîtes de culture cellulaire traitées TC | ThermoFisher Scientific ; | ||
| tubes coniques de 15 mL | Faucon | 14-959-70C | |
| 40 &mu ; crépine M ; | Corning | 07-201-430 | |
| Tubes coniques de 50 mL | Faucon | 14-959-49A | |
| 70 &mu ; m passoire | Corning | 07-201-431 | |
| Attune NxT Cytomètre en flux ; | ThermoFisher Scientific ; | ||
| BALB/C, 6-8 semaines ; | Jackson Laboratory | 651 | |
| B-Mercaptoéthanol ; | Gibco | 21985023 | |
| Albumine sérique bovine | GOLDBIO | A-420-500 | |
| DMEM Medium | Gibco | 11965092 | |
| Dulbecco’s Saline tamponnée au phosphate (PBS), sans calcium ni magnésium. | Gibco | 14-190-250 | |
| DynaMag-2 Aimant ; | Invitrogen | 12-321-D | |
| EasySep Aimant ; | Stemcell Technologies | 18000 | |
| EasySep Kit d’isolement des lymphocytes T de souris | Stemcell Technologies | 19851 | |
| Tampon FACS ; | BD | BDB554657 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) ; | Corning | MT35011CV | |
| GlutaMAX | Gibco | 35-050-061 | |
| G-REX6 | Wilson Wolf | 80240M ; | |
| Solution tampon HEPES ; | Gibco | 15-630-080 | |
| IL-15 humaine recombinante ; | Miltenyi Biotec | 130-095-765 | |
| IL-2 recombinante humaine | Miltenyi Biotec | 130-097-748 | |
| IL-7 recombinante humaine | Miltenyi Biotec | 130-095-363 | |
| Lipofectamine 3000 | Invitrogen | L3000008 | |
| MEM Solution d’acides aminés non essentiels ; | Gibco | 11140-050 | |
| Souris Anti-CD3 BV421 | Biolegend | 100228 | |
| Souris Anti-CD3/CD28 Dynabeads | Gibco | 11-453-D | |
| Souris Anti-CD4 BV605 | BD | 563151 | |
| Souris Anti-CD44 APC ; | Souris Biolegend | 103011 | |
| Anti-CD62L PE-Cy7 | Tonbo | SKU 60-0621-U025 | |
| Souris Anti-CD8 APC-Cy7 | Tonbo | SKU 25-0081-U025 | |
| Nikon Ti2 avec appareil photo Prime 95B ; | Plaques Nikon | ||
| non traitées à 24 puits ; | CytoOne | CC7672-7524 | |
| Opti-MEM | Gibco | 31-985-062 | |
| pCL-Eco | Addgene | #12371 | |
| Pénicilline/Streptomycine Solution | Gibco | 15-070-063 | |
| Phoenix Eco cells | ATCC | CRL-3214 | |
| pMDG.2 | Addgene | #12259 | |
| pMSCV_PGK_GFP28z | N/A | Produit par R.LV. | |
| SfGFP N | /A | purifié Produit par R.LV. | |
| RetroNectin ('réactif de transduction') | Takara Bio | T100B | |
| RPMI 1640 | Gibco | 21875 | |
| Pipette sérologique 10 mL | Fisher Scientific ; | 13-678-11F | |
| Pipette sérologique 25 mL | Fisher Scientific ; | 13-678-11 | |
| Pipette sérologique 5 mL | Fisher Scientific ; | 13-678-11D | |
| Pyruvate de sodium | Gibco | 11-360-070 | |
| TC 24 plaques de puits | Corning | 08-772-1 | |
| Trypan bleu ; | Gibco | 15-250-061 |
Références
- June, C. H., Sadelain, M. Chimeric antigen receptor therapy. N Engl J Med. 379 (1), 64-73 (2018).
- Duncan, B. B., Dunbar, C. E., Ishii, K. Applying a clinical lens to animal models of car-t cell therapies. Mol Ther Methods Clin Dev. 27, 17-31 (2022).
- Hou, A. J., Chen,....
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Réimpressions et autorisations
