Isolement d’astrocytes purs et de microglies de la moelle épinière de souris adulte pour des essais in vitro et des études transcriptomiques

Les astrocytes et les microglies sont des cellules gliales polyvalentes qui jouent un rôle vital dans le système nerveux central (SNC), englobant des responsabilités telles que la régulation de la fonction neuronale, la contribution au développement du SNC, le maintien de la barrière hémato-encéphalique et la participation à d’autres processus critiques 1,2,3,4 . Outre leur rôle dans le maintien de l’homéostasie, ces cellules gliales jouent également un rôle central dans les mécanismes de blessure et de réparation. Les microglies sont bien connues pour leurs capacités phagocytaires, inflammatoires et migratoires à la suite d’insultes ou de blessures ^5,6,7. Les réponses des astrocytes dans la maladie sont tout aussi diverses, englobant des contributions à l’inflammation, à la formation de cicatrices gliales et à la compromission de la barrière hémato-encéphalique ^8,9. Bien que notre compréhension des rôles néfastes et réparateurs des microglies et des astrocytes dans le SNC se soit améliorée, l’hétérogénéité inhérente à leur structure et à leur fonction nécessite des outils robustes pour les étudier dans divers contextes.

Pour mieux comprendre le rôle de la microglie et des astrocytes dans la santé et la maladie, il faut une approche combinée d’études in vivo et in vitro . Les techniques in vivo tirent parti de la diaphonie complexe entre les cellules gliales et les neurones au sein du SNC, tandis que les méthodologies in vitro s’avèrent précieuses pour évaluer les fonctions ou les réponses d’une seule cellule sous des stimuli spécifiques. Chaque méthode offre des avantages uniques ; Les études in vitro sont essentielles pour comprendre les rôles spécifiques de ces types de cellules sans apport direct ou indirect des cellules voisines. De plus, les essais in vitro utilisant des lignées cellulaires immortelles présentent certains avantages, notamment la capacité de proliférer indéfiniment, la rentabilité et la facilité d’entretien. Cependant, il est important de noter que les cellules primaires imitent plus étroitement les réponses physiologiques normales que les lignées cellulaires. Cette pertinence physiologique est cruciale dans les tests fonctionnels et les analyses transcriptomiques.

L’un des défis liés à l’obtention de cellules primaires, en particulier à partir de la moelle épinière de souris adultes, réside dans la quantité et la viabilité des échantillons. La moelle épinière adulte, étant plus petite que le cerveau et contenant une quantité importante de myéline, pose des difficultés uniques. Bien qu’il existe plusieurs protocoles publiés détaillant l’isolement de cellules gliales pures et viables provenant d’animaux nouveau-nés ou du cerveau de souris adultes 10,11,12,13, ces méthodologies peuvent ne pas convenir à l’étude des maladies et des lésions spécifiques à la moelle épinière. Dans ce protocole, nous proposons une procédure complète pour isoler efficacement les microglies et les astrocytes purs et viables de la moelle épinière de souris adultes, facilitant ainsi les applications en aval dans les cultures cellulaires et les analyses transcriptomiques. Ce protocole a été utilisé avec succès pour isoler ces cellules de souris adultes âgées de 10 semaines à 5 mois, démontrant son utilité dans divers contextes, y compris des études impliquant des souris knock-out conditionnelles, des réponses aux médicaments, des recherches sur le développement et des modèles liés à l’âge.

Toutes les procédures expérimentales et de soins aux animaux ont été menées à la suite de l’approbation du Comité de protection et d’utilisation des animaux de l’École de médecine et des sciences de la santé de l’Université George Washington (Washington, D.C., États-Unis ; IACUC#2021-004). L’étude a utilisé des souris mâles et femelles de type sauvage (WT) C57BL/6J âgées de 10 semaines à 5 mois, provenant d’un fournisseur commercial (voir le tableau des matériaux) et hébergées à l’Université George Washington. Une vue d’ensemble du flux de travail du protocole est présentée à la figure 1.

1. Préparation de la moelle épinière

1. Anesthésier les animaux à l’aide d’Avertin (12,5 mg/mL de 2,2,2-tribromoéthanol et 2,5 % de 2-méthyl-2-butanol dans de l’eau stérile) (voir le tableau des matériaux). Confirmez l’absence de réponse aux pincements des orteils et de la queue chez les souris.
2. Effectuer une perfusion cardiaque avec 1x solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) pour éliminer les cellules mononucléées du sang périphérique.
   1. Placez l’animal sur un plateau peu profond et faites une incision latérale pour exposer la cavité pleurale. Insérez une aiguille de perfusion de 23 G reliée à une pompe péristaltique (voir tableau des matériaux) dans le ventricule gauche et activez la pompe. Une fois que le DPBS froid circule dans le cœur, créez une petite incision dans l’oreillette droite.
      REMARQUE : Un débit de perfusion plus rapide est préférable dans cette étape pour améliorer la viabilité cellulaire. Le sang doit être évacué en moins de 1 minute. Le dégagement du foie indique une perfusion réussie.
3. Décapitalisez l’animal à l’aide de grands ciseaux et retirez la colonne vertébrale¹⁴. Plongez-le dans 1x DPBS froid avec Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% de glucose dans une boîte de Pétri sur glace pour le rinçage des tissus.
4. À partir de maintenant, assurez-vous que toutes les étapes sont effectuées dans un environnement stérile. Utilisez l’extrusion hydraulique¹⁴ pour isoler l’ensemble de la moelle épinière. Utiliser une aiguille de 18 G et une seringue de 10 ml remplie de 1x DPBS froid avec Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% de glucose. Transférez la moelle épinière dans une boîte de Pétri placée sur des blocs réfrigérants contenant suffisamment de froid 1x DPBS avec Ca²⁺/Mg²⁺/0,2% de glucose pour immerger tout le tissu.
5. Retirez soigneusement les méninges au microscope à l’intérieur d’une hotte à flux laminaire. Transférez la moelle épinière dans une boîte de Pétri vide sur des blocs réfrigérants et, à l’aide d’un scalpel chirurgical à lame n° 10, coupez toute la moelle épinière en sections de 2 à 3 mm.

2. Dissociation des cellules enzymatiques

1. Ajouter le mélange enzymatique 1 et le mélange enzymatique 2 de la trousse de dissociation cérébrale pour adultes disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux). Agitez les enzymes dans le plat plusieurs fois pour assurer un revêtement uniforme de la moelle épinière, puis incubez à 37 °C pendant 30 min. Toutes les 5 minutes, agitez doucement le plat pour éviter l’agglutination des tissus et faciliter la distribution uniforme des réactifs.
2. Retirer la boîte de l’incubateur et ajouter 350 μL d’ADN I à 0,46 mg/mL dans un milieu minimal essentiel (MEM) (voir le tableau des matériaux). Mélangez en remuant doucement.
3. Ajouter 1 mL de sérum de veau fœtal (FBS) froid DMEM/0,5 % et mélanger en remuant doucement. Transférez immédiatement tout le contenu dans un tube de 5 ml.

3. Dissociation mécanique des cellules

1. À l’aide d’une pipette P1000, triturez doucement le tissu trois fois, en veillant à ce que des morceaux de tissu soient prélevés à chaque fois pour dissocier davantage le tissu. Ensuite, à l’aide d’une pipette Pasteur en verre de 9 pouces bouchée, triturez doucement cinq fois de plus, en veillant à ce qu’aucune bulle ne soit générée pendant le processus.
2. Placez le tube de 5 ml à la verticale et laissez le tissu se déposer au fond pendant 30 s. Une fois que le tissu s’est déposé, prélever le surnageant à l’aide d’une pipette P1000 et le faire passer à travers un filtre de 30 μm dans un tube conique de 15 ml.
3. Dans le même tube de 5 mL avec le reste du tissu, ajouter 1 mL de DMEM/FBS à 0,5 % froid. À l’aide d’une pipette Pasteur, triturer doucement trois fois.
4. Laisser le tissu se déposer au fond pendant 30 s, puis passer le surnageant à travers un filtre de 30 μm et le recueillir dans le même tube de 15 ml qu’auparavant. Répétez les étapes 3.3 et 3.4 une fois de plus.
5. Centrifuger la suspension cellulaire filtrée à 300 x g pendant 10 min à température ambiante (RT). Retirez et jetez soigneusement le surnageant obtenu à l’aide d’un aspirateur sous vide.

4. Élimination de la myéline

1. Retirez la myéline à l’aide de la solution d’élimination des débris (DRS) fournie dans la trousse de dissociation cérébrale pour adultes en suivant le protocole du fabricant. Après l’enlèvement des débris, ajoutez 5 mL de DMEM/FBS à froid à la pastille cellulaire et retournez doucement le tube trois fois. Centrifuger la suspension cellulaire à 300 x g pendant 10 min à température ambiante (RT).
   REMARQUE : Si les cellules doivent être utilisées pour des études in vitro et restent en culture, du DMEM/FBS préchauffé à 0,5 % doit être utilisé à la place.
2. Jeter le surnageant et remettre en suspension la pastille cellulaire dans 1 mL de DPBS/FBS à 0,5 % (froid pour les études d’ARN et chaud pour les essais in vitro ). Comptez les cellules et évaluez leur viabilité à l’aide de Trypan Blue.
   REMARQUE : Des suspensions cellulaires provenant de plusieurs animaux peuvent être combinées pour augmenter la concentration cellulaire.
3. Lavez les cellules en ajoutant du DPBS/0,5 % FBS jusqu’à un volume total de 5 ml. Centrifuger la suspension à 300 x g pendant 10 min à température ambiante et éliminer le surnageant à l’aide d’une pipette.

5. Isolement des microglies et des astrocytes

1. Étiquetez les cellules avec des microbilles anti-CD11b ou anti-ACSA-2 en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux).
2. Triez les cellules par sélection positive à l’aide des colonnes MS selon les instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Après le tri, centrifugez les cellules triées à 300 x g pendant 10 min et jetez le surnageant.

6. Cellules de placage pour essais in vitro

REMARQUE : Si les cellules ne sont pas plaquées et seront utilisées immédiatement pour l’analyse de l’ARN, passez à l’étape 8.

1. Remettre les cellules en suspension dans 1 mL de DMEM/FBS à 0,5 % chaud. Comptez les cellules et évaluez leur viabilité à l’aide d’un hémacytomètre (voir le tableau des matériaux).
2. Ajustez la concentration cellulaire à 75 000 cellules par 50 μL. Ajouter 50 μL de la suspension cellulaire à chaque lamelle¹¹ recouverte de poly-L-lysine dans une plaque à 24 puits.
3. Incuber à 37 °C pendant 2 h pour permettre aux cellules d’adhérer à la lamelle.
4. Ajouter délicatement 450 μL de DMEM/FBS/Pénicilline-Streptomycine chaud (Pen-Streptic, voir le tableau des matériaux) dans chaque puits.
5. Au bout de 3 jours, remplacez la moitié du milieu par 250 μL de DMEM/FBS/SPiC chaud/5 % de SPeC. Pour l’entretien, remplacez complètement le milieu par 500 μL de DMEM/FBS/5 % de SPF/Pen-Strep tous les 4 à 5 jours.

7. Immunohistochimie

REMARQUE : Il est préférable d’effectuer des analyses immunohistochimiques après au moins 3 jours lorsque le milieu a été remplacé au moins une fois. Cela permet de s’assurer que les débris ont été éliminés et que les cellules ont complètement adhéré à la lamelle.

1. Retirez le milieu et étiquetez les cellules avec du mAb anti-souris O4 (1 :100) (voir le tableau des matériaux) dans du DMEM/5% FBS/10% du sérum de chèvre normal (NGS) chaud pendant 15 min à température ambiante (RT) ou à 37 °C.
   REMARQUE : Ignorez cette étape et passez à l’étape 7.3 si les cellules ne sont pas étiquetées avec O4.
2. Rincez délicatement les lamelles en les trempant trois fois dans du DMEM/FBS 5 % chaud. Ajouter 594 IgM anti-souris de chèvre (1 :300) (voir tableau des matériaux) dans du DMEM chaud/5% FBS/10% NGS et incuber à RT pendant 15 min dans l’obscurité. Rincez délicatement trois fois dans du DMEM/FBS à 5 % chaud.
3. Fixez les cellules avec de l’acide acétique/méthanol à froid à 5 % pendant 15 min à 4 °C. Laver trois fois avec 1x PBS, puis étiqueter avec l’anticorps approprié : GFAP anti-lapin (1 :500), GFAP anti-souris (1 :500) ou anti-lapin Iba1 (1 :500) dans 1% Triton-X100/10% NGS dans 1x DPBS (voir tableau des matériaux). Incuber pendant 1 h à RT.
   REMARQUE : Gardez les lamelles dans l’obscurité si elles ont déjà été tachées d’O4.
4. Rincez délicatement trois fois avec du PBS. Étiqueter avec l’anticorps secondaire approprié : anti-souris 594 IgG (1 :500), anti-lapin 488 IgG (1 :500) (voir tableau des matériaux). Incuber pendant 30 min à RT dans l’obscurité.
5. Rincez délicatement trois fois avec du PBS. Contre-coloration avec DAPI (1 : 1000) pendant 1 min à RT. Rincer trois fois avec du PBS, ajouter du produit de montage (voir le tableau des matériaux) et monter les lamelles sur les lames.

8. Extraction de l’ARN

REMARQUE : Idéalement, il devrait y avoir au moins 100 000 cellules pour extraire suffisamment d’ARN pour l’analyse. Si nécessaire, des cellules de 2-3 moelles épinières peuvent être combinées.

1. Extraire l’ARN à l’aide d’une trousse d’isolement de l’ARN disponible dans le commerce en suivant le protocole du fabricant (voir le tableau des matériaux). Pour chaque étape de lavage avec le tampon de lavage RW1 fourni dans le kit, laissez les cellules dans le tampon de lavage pendant 2 minutes supplémentaires.
2. Retirez tout ADN génomique restant à l’aide de la DNase I conformément aux instructions du fabricant (voir le tableau des matériaux). Incuber avec DNase à RT pendant 15 min, puis laver avec un tampon RW1.
3. Pour augmenter le rendement en ARN, avant l’élution, incuber les échantillons dans de l’eau exempte d’ARNase à RT pendant 10 minutes. Évaluer l’intégrité et la quantité d’ARN à l’aide d’un bioanalyseur¹⁵ (voir le tableau des matériaux).

Les méthodes décrites dans ce protocole permettent d’isoler des microglies et des astrocytes purs et viables de la moelle épinière de souris adulte, facilitant ainsi diverses applications en aval, y compris des tests fonctionnels ou histologiques in vitro et des analyses d’ARN.

Un isolement réussi pour des études in vitro se traduira par une prolifération cellulaire continue sur plusieurs jours. Les cellules adultes présentent un taux de prolifération plus lent que les cellules isolées d’animaux nouveau-nés, et certains débris peuvent être présents dans les premiers jours. Au bout de 4 jours in vitro (DIV), les cellules devraient être en grande partie exemptes de débris, la plupart des cellules adhérant au fond du flacon. Les astrocytes commenceront à former des processus plus longs, tandis que les microglies prendront une forme ovale avec des fuseaux plus courts (Figure 2). À 7 DIV, les astrocytes devraient former une couche confluente connectée, et les microglies devraient présenter des processus moins nombreux et plus courts (Figure 3).

La pureté peut être confirmée par un double marquage des cellules triées par ACSA2 avec GFAP et O4 pour évaluer la contamination des oligodendrocytes dans les cultures d’astrocytes et des cellules triées par CD11b avec Iba1 et GFAP pour évaluer la contamination par les astrocytes dans les cultures de microglies (tableau 1).

Un protocole réussi permettra également d’obtenir un ARN de haute qualité avec une dégradation minimale et une quantité suffisante (Figure 4A). Les électrophérogrammes d’ARN extraits de cellules isolées devraient présenter des pics 18S et 28S proéminents. Une surdissociation des cellules ou un délai prolongé entre la perfusion et le tri cellulaire peuvent entraîner une dégradation de l’ARN (Figure 4B). Une dissociation enzymatique et/ou mécanique insuffisante ou une élimination inadéquate de la myéline peuvent entraîner une réduction du rendement cellulaire et de l’ARN (Figure 4C). Des astrocytes isolés peuvent être séquencés pour identifier des marqueurs inflammatoires. La comparaison d’astrocytes sains à des astrocytes activés par l’inflammation (par exemple, provenant d’un animal expérimental atteint d’encéphalomyélite auto-immune) révélera des ininhibitions relatives des voies inflammatoires chez les astrocytes sains par rapport aux astrocytes inflammatoires (Figure 4D).

Figure 1 : Vue d’ensemble de la préparation de la moelle épinière, de la dissociation tissulaire et du tri cellulaire. La figure donne un aperçu du processus de préparation de la moelle épinière, y compris la dissociation des tissus et le tri cellulaire. Après la dissection de la moelle épinière, les tissus subissent une dissociation enzymatique et mécanique. La myéline est éliminée et les cellules sont marquées avec des anticorps anti-ACSA2 ou anti-CD11b pour cibler les astrocytes et la microglie. Les cellules triées peuvent ensuite être utilisées pour la culture cellulaire et l’analyse de l’ARN. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Images à contraste de phase d’astrocytes et de microglies à 4 jours in vitro (4DIV). (A) Représente un exemple représentatif de cellules triées ACSA2+ avec des processus étendus. (B) Les cellules CD11b+ présentent des corps cellulaires de forme ovale et des processus courts. Barre d’échelle = 50 μm. Cette figure est adaptée d’Ahn, J. J. et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images fluorescentes d’astrocytes et de microglies à 8 jours in vitro (8DIV). (A) Les cellules ACSA2+ marquées avec GFAP (vert) et O4 (rouge) présentent une coloration minimale à l’O4 et forment une couche confluente d’astrocytes connectée. (B) Les cellules CD11b+ marquées avec Iba1 (vert) et GFAP (rouge) présentent une présence minimale de GFAP. Barre d’échelle = 50 μm. Cette figure est adaptée d’Ahn, J. J. et al.16. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Électrophérogrammes représentatifs d’échantillons d’ARN. (A) Un ARN à haut rendement et de haute qualité est attendu après une isolation cellulaire réussie. (B) On peut s’attendre à un ARN de faible rendement et de mauvaise qualité ou à un ARN de haute qualité à faible rendement en cas de mort cellulaire, de dissociation insuffisante ou d’élimination inadéquate des débris. (D) L’analyse par séquençage de l’ARN de certaines voies inflammatoires dans les astrocytes sains par rapport aux astrocytes inflammatoires révèle une inhibition relative de l’inflammation dans les astrocytes sains triés par rapport aux astrocytes inflammatoires. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tableau 1 : Rendement, pureté et viabilité des cellules après tri pour les cellules ACSA-2 et CD11b. Ce tableau est adapté d’Ahn, J. J. et al.16.

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