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Chirurgie d’implantation pour la stimulation du nerf vague abdominal et études d’enregistrement chez le rat éveillé

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DOI :

10.3791/65896

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19 janvier 2024

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1Bionics Institute, 2Medical Bionics Department, University of Melbourne, 3Department of Otolaryngology, University of Melbourne

Dans cet article

Résumé

Le présent protocole décrit la technique chirurgicale d’implantation d’un réseau d’électrodes sur le nerf vague abdominal chez le rat, ainsi que les méthodes de test et de stimulation électrophysiologiques chroniques à l’aide du dispositif implanté.

Résumé

La stimulation du nerf vague abdominal (SNV) peut être appliquée à la branche sous-diaphragmatique du nerf vague des rats. En raison de son emplacement anatomique, il n’a pas d’effets respiratoires et cardiaques hors cible couramment associés au SNV cervical. L’absence d’effets respiratoires et cardiaques hors cible signifie que l’intensité de la stimulation n’a pas besoin d’être réduite pour réduire les effets secondaires couramment ressentis lors du SNV cervical. Peu d’études récentes démontrent les effets anti-inflammatoires du VNS abdominal dans des modèles de rats de maladies inflammatoires de l’intestin, de polyarthrite rhumatoïde et de réduction de la glycémie dans un modèle de rat de diabète de type 2. Le rat est un excellent modèle pour explorer le potentiel de cette technologie en raison de l’anatomie bien établie du nerf vague, de la grande taille du nerf qui permet une manipulation facile et de la disponibilité de nombreux modèles de maladies. Nous décrivons ici les méthodes de nettoyage et de stérilisation du réseau d’électrodes VNS abdominales et le protocole chirurgical chez le rat. Nous décrivons également la technologie requise pour confirmer la stimulation supraseuil en enregistrant les potentiels d’action composés évoqués. Le VNS abdominal a le potentiel d’offrir un traitement sélectif et efficace pour une variété d’affections, y compris les maladies inflammatoires, et l’application devrait s’étendre de la même manière que le VNS cervical.

Introduction

La stimulation du nerf vague (SNV) administrée au site cervical dans le cou est un traitement approuvé par la Food and Drug Administration (FDA) des États-Unis pour l’épilepsie réfractaire, la dépression réfractaire et la réadaptation post-AVCischémique 1, et approuvé par la Commission européenne pour l’insuffisance cardiaque en Europe2. Le VNS cervical non invasif est approuvé par la FDA pour la migraine et les maux de tête1. Son application devrait s’étendre, avec des essais cliniques récents montrant l’efficacité de la SNV dans d’autres indications telles que la maladie de Crohn3, la polyarthrite rhumatoïde 4,5 et l’intolérance au glucose et le diabète de type 2 6,7. Bien que prometteur, le SNV cervical peut provoquer une bradycardie et une apnée en raison de l’activation hors cible des fibres nerveuses qui innervent les poumons et le cœur 8,9,10. Des effets secondaires tels que toux, douleur, altération de la voix, maux de tête et augmentation de l’indice d’apnée-hypopnée sont fréquemment rapportés chez les patients recevant le VNScervical 11,12. La réduction de la force de stimulation est une stratégie courante pour réduire ces effets secondaires, mais une charge réduite peut limiter l’efficacité du traitement par SNV en n’activant pas les fibres thérapeutiques11. À l’appui de cette hypothèse, le taux de réponse des patients recevant une stimulation de haute intensité pour le traitement de l’épilepsie était plus élevé que celui des patients recevant une stimulation de faible intensité13.

La SNV abdominale est appliquée sur le nerf vague sous-diaphragmatique, au-dessus des branches hépatique et cœliaque14 (Figure 1). Notre étude précédente a démontré que chez le rat, le VNS abdominal ne provoque pas d’effets secondaires cardiaques ou respiratoires associés au VNScervical 10. Des études antérieures démontrent également des effets anti-inflammatoires du VNS abdominal dans un modèle de rat de maladie inflammatoire de l’intestin et de polyarthrite rhumatoïde10,15 ainsi qu’une réduction de la glycémie dans un modèle de rat de diabète de type 216. Récemment, la technologie VNS abdominale a été traduite pour un premier essai clinique chez l’homme pour le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin (NCT05469607).

Le réseau d’électrodes des nerfs périphériques utilisé pour stimuler le nerf vague abdominal (WO201909502017) a été développé sur mesure pour être utilisé chez le rat et comprend deux ou trois paires d’électrodes en platine placées à 4,7 mm l’une de l’autre, soutenues par un brassard en élastomère de silicone de qualité médicale, une languette de suture pour ancrer le réseau à l’œsophage, un fil conducteur et un connecteur percutané à monter sur la région lombaire (figure 2). Le fil conducteur est creusé sous la peau du côté gauche de l’animal. La conception à paires d’électrodes multiples permet une stimulation électrique du nerf ainsi que l’enregistrement des potentiels d’action composés évoqués électriquement (ECAP), ce qui confirme le placement correct de l’implant sur le nerf et les intensités de stimulation supraseuil. Le VNS abdominal est bien toléré chez les rats en mouvement libre pendant les mois 10,15,16. Cela permet d’évaluer son efficacité sur des modèles de maladies.

Ce manuscrit décrit les méthodes de stérilisation par réseau d’électrodes, de chirurgie d’implantation du nerf vague abdominal, de stimulation chronique et d’enregistrement des ECAP chez des rats éveillés pour étudier l’efficacité de la VNS abdominale dans divers modèles de maladies. Ces méthodes ont été développées à l’origine pour étudier l’efficacité de la VNS abdominale dans le modèle de rat de maladie inflammatoire de l’intestin10 et ont également été utilisées avec succès pour un modèle de rat de polyarthrite rhumatoïde15 et de diabète16.

Protocole

Toutes les procédures impliquant des animaux ont été approuvées par le Comité d’éthique animale de l’hôpital St. Vincent (Melbourne) et étaient conformes au Code australien pour le soin et l’utilisation des animaux à des fins scientifiques (Conseil national de la santé et de la recherche médicale d’Australie) et à la Loi sur la prévention de la cruauté envers les animaux (1986). Au total, 24 rats Dark Agouti femelles (âgés de 8 à 9 semaines) ont été utilisés pour cette étude. Les groupes expérimentaux comprenaient : une cohorte normale (n = 8) qui n’a reçu aucune injection de collagène ou implant VNS ; une cohorte de maladies non stimulées (n = 8) ayant reçu un implant et une injection de collagène (aucun test électrophysiologique effectué) ; et une cohorte de maladies stimulées (n = 8) qui a reçu un implant, une injection de collagène, des tests électrophysiologiques et une thérapie VNS. La chirurgie d’implantation a eu lieu 5 jours avant l’injection de collagène, et l’habituation au traitement VNS a commencé 4 jours après l’injection de collagène et s’est déroulée sur 7 jours. Le traitement par VNS a été appliqué du 11e au 17e jour (inclus) après l’injection de collagène15. Pour la cohorte de la maladie stimulée, des tests électrophysiologiques ont été effectués immédiatement après la chirurgie d’implantation sous anesthésie, le jour de l’injection de collagène, 10 jours après l’injection de collagène et le jour de l’arrêt (17 jours après l’injection de collagène).

1. Sonication et stérilisation du réseau d’électrodes

  1. Réglez le nettoyeur à ultrasons sur une fréquence de 80 kHz et remplissez le réservoir à ultrasons avec de l’eau du robinet. Immergez le porte-électrodes dans la solution de nettoyage dans un récipient en plastique propre et placez-le dans le réservoir à ultrasons.
    REMARQUE : La solution de nettoyage et le temps de sonication à utiliser pour chaque étape sont résumés dans le tableau 1. Utilisez un récipient propre pour chaque étape.
  2. Placez le porte-électrodes soniquées dans un sac de stérilisation à l’aide d’une pince propre sonicée avec une solution de nettoyage liquide à 0,5 % dans de l’eau distillée et rincée à l’eau distillée. Autoclavez le réseau d’électrodes pendant 45 min à une température maximale de 130 °C, et laissez-le sécher sur une paillasse propre.

2. Implantation d’un réseau d’électrodes sur le nerf vague abdominal

REMARQUE : Dans cette étude, nous avons utilisé des rats agouti noirs femelles (âgés de 8 à 9 semaines)15. Nous avons également utilisé avec succès ce protocole pour implanter de manière chronique des rats Sprague-Dawley mâles adultes (âgés de 10 à 14 semaines)10,16. La chirurgie est réalisée dans des conditions aseptiques, et tous les instruments, le réseau d’électrodes et les consommables tels que la gaze et les cotons-tiges sont stérilisés par autoclavage.

  1. Anesthésier le rat dans une chambre d’induction en utilisant 3 % d’isoflurane et 1 L/min d’oxygène. Une fois qu’il n’y a plus de réflexe de pédale pour pincer les orteils, déplacez le rat vers le tapis chauffant avec un thermostat sur la table d’opération et placez un masque à l’isoflurane sur le nez.
  2. Surveillez la fréquence respiratoire et la température rectale tout au long de la chirurgie et ajustez le taux d’isoflurane entre 1,5 % et 2,5 % pour maintenir la fréquence respiratoire entre 40 et 62 respirations par minute. Ajustez le réglage du tapis chauffant si nécessaire, pour maintenir la plage de température rectale entre 35,9 et 37,5 °C.
  3. Administrer l’analgésie avant la médication par voie sous-cutanée à l’aide de seringues de 1 mL avec des aiguilles de 25 G (carprofène 5 mg/kg et buprénorphine 0,03 mg/kg par voie sous-cutanée) avant le début de la chirurgie.
  4. Rasez-vous généreusement autour du site d’incision, y compris la zone le long de la ligne médiane ventrale de l’apophyse xyphoïde à l’extrémité de la cage thoracique, la face lombaire du dos le long de la ligne médiane dorsale et le côté gauche du corps entre le membre antérieur et le membre postérieur pour permettre le creusement sous-cutané du réseau.
  5. Nettoyez les sites chirurgicaux en mouvements circulaires trois fois avec des cycles alternés de bétadine et d’alcool et placez un champ chirurgical sur l’animal. Administrer la bupivacaïne (1 à 2 mg/kg) par voie sous-cutanée à l’aide d’une seringue de 1 mL munie d’une aiguille de 25 G aux sites d’incision dorsale et ventrale.
  6. Placez l’animal en décubitus ventral et faites une incision de 2 cm de long sur le dos où le piédestal percutané sera ancré à l’aide d’une lame de scalpel.
  7. Tournez le rat en position couchée dorsale et faites une incision de 3 cm sur la peau le long de la ligne médiane, juste en dessous de l’apophyse xyphoïde à l’aide d’une lame de scalpel. Tenez la peau près du site d’incision et, à l’aide de ciseaux de dissection, disséquez la couche de peau de la couche musculaire autour de l’incision.
  8. Pour permettre l’effet tunnel sous-cutané du réseau du socle au site d’implantation, placez l’animal sur son côté droit, insérez un hémostatique à partir de l’incision ventrale et disséquez émoussé vers le site d’incision dorsale. Coupez le bord d’un capuchon d’aiguille et insérez le porte-électrodes pour le protéger pendant le transport (Figure 1B). À l’aide des mains (porter des gants stériles), tunneliser le réseau d’électrodes sous la peau vers l’incision ventrale.
  9. Pour accéder à l’œsophage et au nerf vague, posez à nouveau l’animal en décubitus dorsal. Faites une incision de 3 cm sur la couche musculaire le long de la ligne médiane sous l’apophyse xyphoïde, suffisamment grande pour exposer toute la longueur du foie. Évitez d’endommager le foie pendant cette étape.
  10. Faites une incision plus petite (moins de 1 cm) sur la couche musculaire latéralement (le côté gauche de l’animal) jusqu’à l’incision ventrale principale. Tunnelisez le réseau d’électrodes à travers cette petite incision à l’aide du capuchon d’aiguille utilisé à l’étape 2.8 pour insérer le réseau dans la cavité abdominale.
    REMARQUE : Cette étape réduit la tension appliquée au site d’incision principal et réduit le risque d’éclatement des sutures.
  11. Rétractez les couches cutanées et musculaires pour maintenir la cavité abdominale ouverte. Assurez-vous de garder les mouchoirs humides en utilisant des cotons-tiges et de la gaze imbibée de solution saline stérile pour manipuler les mouchoirs.
  12. Rétractez doucement le foie en coupant le tissu conjonctif qui l’entoure à l’aide de ciseaux Vannas et en plaçant un écarteur sur un petit morceau de gaze imbibé de solution saline pour le protéger. Rétractez doucement l’estomac, pour permettre le redressement de l’œsophage et du nerf vague sus-jacent, en plaçant un écarteur entre l’œsophage et l’estomac.
    REMARQUE : Les écarteurs sont fabriqués en arrondissant l’extrémité pointue des hameçons.
  13. Après l’exposition de la surface ventrale de l’œsophage, identifiez le nerf vague abdominal et ses sous-branches, y compris le nerf hépatique, le nerf cœliaque et deux branches gastriques (figure 1D).
  14. Coupez le tissu conjonctif fixant le nerf vague abdominal à l’œsophage à l’aide d’une pince fine et de ciseaux Vannas et disséquez la longueur du nerf juste au-dessus des branches hépatiques et cœliaques vers le diaphragme. Assurez-vous de ne pas déchirer, étirer ou pincer le nerf. Placez un réseau d’électrodes à côté du nerf pour confirmer que suffisamment de longueur du nerf est séparée du tissu conjonctif pour s’adapter au réseau.
  15. Une fois le tissu conjonctif dégagé autour du nerf, passez les sutures en soie (7-0) du côté électrode du brassard sous le nerf. Ouvrez le brassard du réseau et placez soigneusement le nerf dans le canal du réseau.
  16. Assurez-vous que toute la longueur du nerf se trouve à l’intérieur du canal du réseau. Attachez les sutures autour du brassard ensemble pour bien fermer le brassard afin de vous assurer que le nerf ne glisse pas hors du canal. Coupez les sutures.
  17. À l’aide d’une suture en soie 7-0, suturez la languette du réseau sur l’œsophage pour fixer le réseau en place et l’empêcher de se tordre. Évitez d’endommager les autres branches du nerf vague ou d’insérer une aiguille trop profondément dans le muscle lisse de l’œsophage.
  18. Retirez délicatement les écarteurs et assurez-vous que toute la gaze a été retirée de la cavité abdominale. Administrer 1 à 2 mL de solution saline stérile chaude à l’aide d’une seringue de 1 mL dans la cavité abdominale et repositionner le foie dans la bonne position.
  19. Fermez la couche musculaire avec une suture en soie 3-0 en utilisant la technique de suture simple de la course, en faisant des nœuds carrés sécurisés avec au moins 3 lancers aux deux extrémités. Espacez les points de suture étroitement (environ 3 mm d’intervalle) pour éviter les complications telles que la hernie/saillie de l’apophyse xyphoïde.
  20. Utilisez une suture pour fermer l’incision du péritoine avec l’incision de la couche musculaire, afin de réduire le risque d’adhésion des tissus.
  21. À l’aide d’un matériau de suture résorbable (Vicryl 4-0), fermez l’incision cutanée. Utilisez une technique de suture enterrée telle que la suture verticale du matelas enterrée ou la suture dermique enterrée pour empêcher l’animal de retirer la suture.
  22. Tournez l’animal en position couchée ventrale et, à l’aide de ciseaux, prolongez l’incision dorsale à 4-5 cm et disséquez davantage entre le muscle et la couche de peau afin que la base du connecteur percutané puisse reposer à plat sur la couche musculaire.
  23. À l’aide d’une suture en soie 3-0, faites 6 à 8 sutures interrompues simples autour de la base du connecteur pour le fixer à la couche musculaire en dessous. Fermez l’incision cutanée avec une suture en soie 3-0, en utilisant la technique de suture horizontale du matelas, en assurant des nœuds carrés sécurisés avec au moins 3 jets.
    REMARQUE : Dans cette étape, les sutures en soie tressée sont préférées pour leur facilité de manipulation et leur capacité à créer des nœuds plus sûrs par rapport aux sutures monofilament.
  24. À la fin de la chirurgie, administrer la solution de Hartmann par voie sous-cutanée (1 mL/100 g/h). Éteignez l’isoflurane et laissez l’animal récupérer sur un tapis chauffant tout en faisant fonctionner l’oxygène (1,5 L/min). Une fois que le rat est conscient et complètement mobile, remettez-le dans sa cage d’origine, placé sur un coussin chauffant, jusqu’à ce qu’il soit complètement remis de l’anesthésie.
  25. Observez attentivement la récupération de l’animal de l’isoflurane et assurez-vous que l’animal est en mesure d’accéder à la nourriture et aux boissons. Au cours des deux prochains jours, administrer par voie sous-cutanée une analgésie post-chirurgicale (carprofène 5 mg/kg, par jour) pour soulager la douleur. Surveillez l’animal au moins 2 fois par jour et vérifiez s’il y a des signes de défécation, la qualité du pelage, le niveau d’activité et la présence d’un gonflement ou d’un écoulement des plaies chirurgicales.
  26. Enregistrez le poids de l’animal et, dans les rares cas où l’animal perd 10 % ou plus, commencez un traitement intensif. Le traitement intensif comprend l’administration sous-cutanée de liquides (solution de Hartmann, 2 x 10 ml) chaque jour, l’apport d’aliments supplémentaires tels que des légumes frais et des suppléments de gel alimentaire, et le placement de la moitié de la cage sur un coussin chauffant avec un thermostat pour plus de chaleur. Augmentez la fréquence de la surveillance jusqu’à ce que l’animal se rétablisse. Poursuivre l’administration d’analgésiques (carprofène 5 mg/kg, SQ, quotidien) si nécessaire sur une échelle de Grimace.

3. Tests électrophysiologiques

REMARQUE : L’enregistrement des potentiels d’action composés évoqués (ECAP) confirme le placement approprié du réseau d’électrodes sur le nerf vague. De plus, l’enregistrement des ECAP à l’aide du réseau d’électrodes décrit ci-dessus fournit une confirmation probable de l’activation électrique des fibres C vagales et des VNSsupraseuil 10,15.

  1. Mesurez l’impédance de masse commune des électrodes pour évaluer leur intégrité et détecter tout circuit ouvert ou court-circuit des fils avant d’enregistrer les ECAP. Les électrodes du nerf vague abdominal fonctionnelles in vivo doivent avoir des valeurs d’impédance comprises entre 4 et 20 kΩ.
  2. Testez les animaux sous anesthésie, c’est-à-dire immédiatement après la chirurgie, ou éveillés et se déplaçant librement. Effectuez des tests d’éveil au moins 2 à 3 jours après la chirurgie pour permettre aux plaies cutanées chirurgicales de guérir et de se stabiliser. Rassembler l’équipement requis pour les tests d’impédance et électrophysiologiques, qui comprend un stimulateur sur mesure, un dispositif d’acquisition de données, un amplificateur différentiel isolé et un logiciel d’acquisition et d’analyse de données tel qu’indiqué dans le tableau des matériaux.
  3. Enveloppez l’animal dans une serviette si nécessaire, connectez un câble au connecteur percutané arrière et connectez l’autre extrémité du câble à un stimulateur. Pour tester l’impédance de masse commune des électrodes, appliquez des impulsions de courant biphasiques (100 μs par phase et courant de 107 μA) entre l’électrode d’intérêt et toutes les autres électrodes du réseau.
  4. Mesurez la tension de crête à la fin de la première phase de la forme d’onde de tension (Vtotal) et calculez l’impédance totale (Ztotal) à l’aide de la loi d’Ohm (Z = tension/courant).
  5. Connectez une paire d’électrodes au stimulateur et une paire d’électrodes à l’équipement d’enregistrement et appliquez une stimulation bipolaire pour générer des ECAP en utilisant l’électrode de référence de l’implant VNS placé sous la peau comme référence pour l’enregistrement différentiel des ECAP. Effectuez deux séries d’enregistrements moyennés à partir d’un total de 50 répétitions à l’aide du logiciel d’acquisition et d’analyse des données.
  6. Utilisez les paramètres suivants pour les mesures.
    Courants : 0 à 2 mA par incréments de 0,1 mA ;
    Largeur d’impulsion : 25 - 200 μs ;
    Intervalle interphasique : 8 - 50 μs ;
    Taux de stimulation : 10 - 30 impulsions/s ;
    Fréquence d’échantillonnage : 100 kHz ;
    Filtre : Passe-haut 200 Hz, passe-bas 2000 Hz, gain de tension 1 x 102.
  7. À l’aide du logiciel d’analyse de données, analysez la réponse ECAP en mesurant la tension crête à crête des formes d’onde dans la fenêtre d’analyse (4 à 10 ms après le stimulus, indiqué par un ombrage dans les figures 3A, B). Le seuil ECAP est défini comme l’intensité minimale du courant de stimulus produisant une amplitude de réponse d’au moins 0,1 μVcrête-crête dans les deux séries d’enregistrements électrophysiologiques moyens. Une réponse valide sera répétée pour au moins deux niveaux de courant au-dessus du seuil, et ne sera pas présente pour au moins deux niveaux de courant au-dessous du seuil10,15.

4. SNV abdominale chronique chez les rats éveillés

REMARQUE : Le VNS abdominal peut être appliqué aux animaux éveillés une fois que la plaie chirurgicale autour du connecteur percutané a guéri et stabilisé. Pour réduire toute réponse au stress et permettre une meilleure collecte de données, les animaux sont habitués à l’environnement de manipulation et de stimulation des testeurs, une heure par jour pendant sept jours avant la chirurgie d’implantation et le début du traitement VNS.

  1. Mesurez l’impédance de chaque électrode comme décrit à l’étape 3.4, avant d’appliquer un VNS. Assurez-vous que l’impédance des électrodes de stimulation est inférieure à 20 kΩ.
  2. Connectez un câble au connecteur percutané arrière et connectez l’autre extrémité du câble à un stimulateur programmé pour appliquer une stimulation appropriée (par exemple, 27 Hz, 1,6 mA, 200 μs de largeur d’impulsion avec un intervalle d’interphase de 50 μs, 30 s ON, 2,5 min off15), et allumez le stimulateur.
    REMARQUE : Bien que les animaux soient souvent observés en train de s’endormir pendant la stimulation s’ils sont correctement habitués, utilisez un câble avec un matériau extérieur protecteur tel que des bobines d’acier si possible pour éviter qu’il ne soit mâché.
  3. Observez l’animal au début de chaque séance de thérapie VNS pour vous assurer qu’il n’y a pas d’effet indésirable tel qu’un toilettage excessif ou une augmentation ou une diminution soudaine du niveau d’activité en synchronisation avec le moment de la stimulation.
  4. Surveillez toutes les 30 minutes pour vérifier la torsion ou la déconnexion du câble. Pour appliquer le SNV de façon chronique (par exemple, 3 h par jour pendant 7 jours15), répétez les étapes 4.1 à 4.3 au début de chaque séance.
    REMARQUE : L’utilisation d’un collecteur peut réduire le risque de torsion des câbles et pourrait nécessiter une surveillance moins fréquente.

Résultats

L’enregistrement des potentiels d’action composés évoqués (ECAP, Figure 3A, B) immédiatement après la chirurgie est une technique qui peut être utilisée pour aider à confirmer le placement correct du nerf dans le canal de la matrice, et que la stimulation est efficace pour activer le nerf vague.

Dans la figure 3, des rats agouti noirs femelles (âgés de 8 à 9 semaines) ont été implantés avec le réseau d’électrodes VNS. Chez les rats sélectionnés au hasard pour recevoir une stimulation thérapeutique, les ECAP ont été enregistrés immédiatement après la chirurgie (jour 0, figure 3A) et à la fin de la séance de traitement par SNV (jour 23, figure 3B). La présence d’ECAP (Figure 3B) a indiqué que l’intensité de la stimulation était supérieure au seuil neuronal et que le nerf était activé avec succès. Les animaux du groupe de traitement VNS ont été exclus si les ECAP n’étaient pas enregistrés, car il n’y avait aucune garantie que la stimulation soit délivrée avec succès15. La latence de la réponse neuronale (Figure 3A,B, indiquée par une flèche verte) peut être utilisée pour évaluer quelle classe de fibres a été activée.

Dans des études antérieures, nous avons observé que la plupart des réponses neuronales se produisent généralement entre 4 ms et 10 ms10,15. Étant donné que la distance entre les paires de stimulation et d’enregistrement est de 4,7 mm, la vitesse de conduction approximative de cette fenêtre de réponse est de 0,47 à 1,2 m/s, ce qui est cohérent avec la vitesse de conduction des fibres C18.

Il y a une augmentation du seuil neuronal entre le jour 0 (377 μA, figure 3A) et le jour 23 (1335 μA, figure 3B), qui se produit au fil du temps, probablement en raison d’une fibrose bénigne mineure qui se forme autour de l’interface tissu-électrode10,15.

La figure 3C indique la configuration expérimentale des essais et le positionnement du connecteur arrière, qui est resté stable pendant toute la durée de la période d’essai de 3 semaines15.

Schéma de stimulation du nerf vague et images de placement des électrodes montrant la configuration chirurgicale et les étiquettes anatomiques.
Figure 1 : Sites pour le VNS cervical et le VNS abdominal. (A) Le VNS cervical est appliqué au-dessus des branches jusqu’au cœur et aux voies respiratoires, et le VNS abdominal est appliqué en dessous de ces branches. (B) Le réseau d’électrodes est inséré dans un capuchon d’aiguille (avec le bord retiré) pour le protéger pendant le creusement d’un tunnel sous la peau. (C) La matrice VNS abdominale de rat est implantée et fixée avec des sutures (D) au-dessus des branches cœliaques et hépatiques sous le diaphragme. Abréviations : VN = nerf vague, b. = branche. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Configuration du connecteur percutané dans l’estomac du rat montrant le réseau d’électrodes pour le schéma de stimulation gastrique.
Figure 2 : Réseau VNS pour rat. (A) Un réseau VNS pour rat comprend un connecteur percutané et un réseau d’électrodes reliés par un fil conducteur. (B) Une languette près du porte-électrodes peut être suturée à l’œsophage pour aider à stabiliser la position du réseau. Le réseau nerveux vague abdominal standard du rat est livré avec deux paires d’électrodes (E1 et E2, et E3 et E4). Les deux paires d’électrodes peuvent être utilisées pour la stimulation ou l’enregistrement. Le connecteur percutané est monté sur la région du bois de l’animal, et le fil conducteur est tunnelisé sous la peau du côté gauche de l’animal. L’électrode de référence le long du fil conducteur est placée sous la peau du côté gauche de l’animal une fois le réseau d’électrodes implanté. Le réseau d’électrodes est implanté sur le nerf vague le long de l’œsophage au-dessus de l’estomac et juste en dessous du diaphragme. (C) La longueur supplémentaire du fil conducteur sur le côté gauche de l’animal sous la peau soulage les tensions. Abréviations : E = électrode. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Expérience d’électrophysiologie : graphiques de tension en fonction du temps de la réponse au stimulus aux jours 0 et 23 ; configuration du rat.
Figure 3 : Traces électrophysiologiques typiques enregistrées à partir du nerf vague abdominal lors d’une implantation chronique et d’un rat recevant un traitement par VNS. (A) Chaque trace électrophysiologique est en moyenne de 25 répétitions. Les cases ombragées en vert indiquent la latence typique de la réponse de la fibre C dans le nerf vague abdominal du rat, entre 4 ms et 10 ms (en utilisant un réseau d’électrodes avec une distance de 4,7 mm entre les paires d’électrodes de stimulation et d’enregistrement, centre à centre). Les ECAP sont étiquetés avec des pointes de flèches vertes. (B) Un rat recevant un traitement VNS via le connecteur percutané sur son dos dans la cage domestique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Solution de nettoyageTemps de sonication
1. 0,5 % de pyroneg dans l’eau ultrapureDurée : 15 minutes
2. Eau ultra-pure5 minutes
3. Eau ultra-pure5 minutes
4. Éthanol à 96%Durée : 10 minutes
5. Eau ultra-pure5 minutes
6. Eau ultra-pure5 minutes

Tableau 1 : Étapes de sonication. Le tableau fournit des détails sur la sonication effectuée ici.

Discussion

Cette méthode de chirurgie implantaire VNS abdominale et de stimulation chronique du nerf vague et d’enregistrement des ECAP a été utilisée avec succès et bien tolérée pendant 5 semaines chez le rat après l’implantation 10,15,16. La rétraction de l’estomac, du foie et de l’intestin pour avoir une bonne vue de l’œsophage et du nerf vague est l’une des étapes clés de la chirurgie. Une fois ces organes rétractés, le nerf vague devient accessible. La rétraction de l’estomac risque de compromettre la respiration, auquel cas l’écarteur est desserré. De plus, lors de la coupe du tissu conjonctif entourant l’œsophage pour accéder au nerf vague, il faut prendre soin d’éviter d’endommager le diaphragme, ce qui peut entraîner une perturbation de la pression intrathoracique, une suppression respiratoire sévère et la mort de l’animal pendant la chirurgie. Il est recommandé que le tissu conjonctif entourant l’œsophage soit dégagé juste assez pour s’adapter au réseau d’électrodes au-dessus des branches hépatiques et cœliaques.

Les complications post-chirurgicales possibles comprennent l’adhérence des tissus autour de l’œsophage, la hernie et l’iléus postopératoire. L’adhérence des tissus peut être minimisée par l’application généreuse d’une solution saline stérile dans la cavité abdominale pendant la chirurgie et avant la fermeture de la cavité abdominale. La suture fermant la couche péritoine avec la couche musculaire devrait également aider à protéger les organes internes et à réduire l’adhérence des tissus. Comme le foie est facilement meurtri et que la manipulation de l’intestin peut provoquer un iléus postopératoire, une manipulation minimale et douce de ces organes est importante. Enfin, en particulier chez les animaux plus lourds, il est essentiel que les points de suture soient placés à proximité les uns des autres ou que des sutures interrompues soient utilisées à la place lors de la fermeture de la cavité abdominale pour éviter la protrusion des hernies et des processus xyphoïdes.

En tant que soins postopératoires standard, les animaux doivent être examinés régulièrement après la chirurgie pour détecter des signes de défécation, de changement de poids, de pelage, de niveau d’activité et de présence de gonflement ou d’écoulement des plaies chirurgicales. En de rares occasions, un écoulement excessif, une rougeur et un gonflement autour des plaies chirurgicales peuvent survenir, suggérant une infection. Dans de telles occasions, des antibiotiques tels que Baytril (0,2 mg/mL, dans l’eau potable pendant 3 à 5 jours) sont administrés jusqu’à ce que l’infection soit résolue. Alors que les rats normaux se remettent généralement bien de la chirurgie, les rats dont les problèmes de santé sont compromis (c’est-à-dire des modèles de maladie) peuvent avoir besoin de plus de temps avant que les tests et la stimulation puissent commencer après la chirurgie. Des soins postopératoires appropriés (tels que résumés à l’étape 2.26) pour ces animaux sont essentiels pour le bien-être des animaux.

L’une des limites de ce protocole est que, bien que la conception du réseau d’électrodes VNS du rat soit excellente pour enregistrer une réponse plus lente de la fibre C, l’espacement entre les paires d’électrodes (4,7 mm) peut ne pas convenir à la capture de l’activité de certains des types de fibres les plus rapides. Bien que la longueur totale du réseau soit limitée par la longueur disponible du nerf vague sous-diaphragmatique au-dessus des branches hépatique et cœliaque, ces réseaux VNS peuvent être achetés avec des paires d’électrodes supplémentaires. De tels réseaux peuvent être utilisés pour explorer l’application d’une stimulation bloquante qui peut manipuler la direction de VNS16,19, élargissant ainsi l’utilisation possible de ce modèle.

L’enregistrement des ECAP peut être utilisé pour évaluer le placement du réseau autour du nerf, la qualité de l’interface de l’électrode et la capacité du dispositif à activer les fibres vagales. Le vague est un nerf autonome, composé de 97 % à 99 % de fibres C18,20, les 1 % à 3 % restants étant des fibres myélinisées (fonction inconnue), comme le confirment des études de microscopie électronique à transmission20. Les réponses de la figure 3 proviennent probablement de l’activité évoquée électriquement du nerf vague, plutôt que de l’activité myogénique, car elles correspondent à la forme et à la forme du potentiel d’action composé d’un nerf périphérique21,22. De plus, la vitesse de conduction typique des ECAP du nerf vague abdominal du rat est de 0,47 à 1,2 m/s, ce qui est cohérent avec la vitesse de conduction des fibres C18. Dans les études pilotes initiales de développement de dispositifs, les enregistrements ont été validés dans des études sur des rats anesthésiés en coupant le nerf vague entre l’électrode de stimulation et l’électrode d’enregistrement, ce qui a entraîné l’élimination de toute réponse évoquée (données non présentées). Le réseau d’électrodes a été conçu de manière à ce que le nerf vague se trouve dans un canal platine-silicone, l’isolant électriquement efficacement des structures environnantes (par exemple, l’œsophage). La stimulation et l’enregistrement sont également effectués à l’aide de configurations bipolaires utilisant des électrodes adjacentes, ce qui minimise davantage les possibilités de propagation de la stimulation et de contamination de l’enregistrement. Nous avons systématiquement rapporté des formes d’onde similaires après une stimulation électrique du nerf vague abdominal dans des préparations anesthésiées et éveillées 10,15,16,19,23, y compris des études dans lesquelles les effets physiologiques de la stimulation ont confirmé l’activation du nerf vague 10,15,16 . Bien qu’il soit impossible d’exclure une contamination de l’enregistrement par l’activité myogénique, les réponses myogéniques se distinguent généralement de la réponse neuronale en raison de leur profil d’amplitude de croissance rapide et important24 contrairement aux profils de croissance gradués et plus petits observés dans nos études10,15 et dans la figure 3A,B : Jour 0 : niveau actuel 377 μA latence : 7,24 ms > niveau de courant 1750 μA : 6,74 ms.

Bien que l’activation du nerf vague sous-diaphragmatique, qui se compose presque entièrement de fibres C 20,25, se soit avérée efficace pour le traitement de modèles précliniques de maladies inflammatoires de l’intestin10, de polyarthrite rhumatoïde15 et de diabète16, les paramètres abdominaux optimaux de la SNV pour maximiser son effet thérapeutique n’ont pas été pleinement explorés14. Des recherches supplémentaires sur ce sujet seraient très bénéfiques, car l’application de la SNV abdominale pour le traitement des maladies inflammatoires de l’intestin est actuellement étudiée dans le cadre d’un premier essai clinique chez l’homme. Comme l’effet anti-inflammatoire du SNV abdominal est considéré comme systémique26, il est fort probable que ce traitement soit également efficace pour d’autres affections inflammatoires telles que le lupus érythémateux disséminé27 et l’insuffisance rénale chronique28.

Nos études chez le rat montrent que le VNS abdominal présente un avantage unique par rapport au VNS cervical en ce sens qu’il ne provoque pas d’effets cardiaques ou respiratoires hors cible10. Une stimulation d’intensité plus élevée peut être appliquée pendant de plus longues périodes sans compromettre la respiration ou le rythme cardiaque de l’animal. Associée à la capacité de surveiller la réponse neuronale évoquée confirmant les intensités de stimulation supraseuil, cette méthode fournit un excellent modèle pour étudier l’efficacité de la SNV abdominale pour le traitement de diverses maladies. Comme l’application de VNS continue de se développer, l’application de cette méthode de VNS devrait également se développer.

Déclarations de divulgation

Cette recherche a été menée en l’absence de toute relation commerciale ou financière qui pourrait être interprétée comme un conflit d’intérêts potentiel.

Remerciements

Le développement de l’implant VNS abdominal de rat a été financé par la Defense Advanced Research Projects Agency (DARPA) BTO, sous les auspices du Dr Doug Weber et du Dr Eric Van Gieson par l’intermédiaire du Space and Naval Warfare Systems Center (contrat n° N66001-15-2-4060). Les recherches présentées dans cette publication ont été soutenues par le Fonds d’incubation de l’Institut bionique. Le Bionics Institute reconnaît le soutien qu’il reçoit du gouvernement de Victoria par le biais de son programme de soutien aux infrastructures opérationnelles. Nous tenons à remercier M. Owen Burns pour la conception mécanique, le professeur John B Furness pour son expertise anatomique, le professeur Robert K Shepherd pour son expertise en interface périphérique, en neuromodulation et en enregistrement, Mme Philippa Kammerer et Mme Amy Morley pour l’élevage et les tests d’animaux, Mme Fenella Muntz et le Dr Peta Grigsby pour leurs conseils sur les soins postopératoires aux animaux, et Mme Jenny Zhou et l’équipe de fabrication d’électrodes de NeoBionica pour la production des réseaux VNS.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,9 % sérum physiologiqueBriemarpakSC3050
Baytril Bayer
BetadineSanofi-Aventis Healthcare
Buprelieve (buprénorphine)Jurox
Dispositif d’acquisition de donnéesNational InstrumentsUSB-6210
DietGel Boost (complément alimentaire à base de gel)ClearH2O
Pince à épiler Dumont, style 5ProSciTechT05-822
Pince à épiler Dumont, style N7, à fermeture automatiqueProSciTechEMS72864-D
Elmasonic P sonicatord’Elma
HartmannBaxterAHB2323
HemostatProSciTechTS1322-140
HPMC/PAA Gel hydratant pour les yeuxAlcon
Igor Pro-8 logicielWavemetrics, Inc
Isoflo (Isoflurane)Zoetis
Amplificateur différentiel isoléWorld Precision InstrumentsISO-80
Pyronegliquide DiverseyHH12291solution de nettoyage
Marcaine (Bupivacaine)Aspen
Champ plastiqueMultigate22-203
Implant du nerf vague du ratNeo-Bionica
Rimadyl (Carprofène)Zoetis
Suture en soie 3-0Ethicon
Suture en soie 7-0Autoclave Ethicon
SteriClaveCominox24S
Blouse chirurgicale stérile jetableZebravetDSG-S
Suicide Crochets en nickelJarvis Walker
Eau ultrapureMerck MillipreMilli-Q Direct
UnderpadsZebravetUP10SM
Ciseaux VannasProSciTechEMS72933-01
Suture Vicryl 4-0Ethicon
La solution

Références

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