Électrodéformation modulée en amplitude pour évaluer la fatigue mécanique des cellules biologiques

Résumé

Un protocole d’essai de fatigue mécanique dans le cas de globules rouges humains utilisant une approche d’électrodéformation modulée en amplitude est présenté ici. Cette approche générale peut être utilisée pour mesurer les changements systématiques dans les caractéristiques morphologiques et biomécaniques des cellules biologiques dans une suspension de déformation cyclique.

Résumé

Les globules rouges (GR) sont connus pour leur remarquable déformabilité. Ils subissent à plusieurs reprises une déformation considérable lors de leur passage dans la microcirculation. Une déformabilité réduite est observée chez les globules rouges physiologiquement âgés. Les techniques existantes pour mesurer la déformabilité cellulaire ne peuvent pas être facilement utilisées pour mesurer la fatigue, la dégradation progressive des membranes cellulaires causée par les charges cycliques. Nous présentons un protocole pour évaluer la dégradation mécanique des globules rouges à partir de contraintes de cisaillement cycliques en utilisant l’électrodéformation basée sur la modulation par décalage d’amplitude (ASK) dans un canal microfluidique. En bref, les électrodes interdigitées dans le canal microfluidique sont excitées par un courant alternatif basse tension aux fréquences radio à l’aide d’un générateur de signaux. Les globules rouges en suspension réagissent au champ électrique et présentent une diélectrophorèse positive (DEP), qui déplace les cellules vers les bords de l’électrode. Les cellules sont ensuite étirées en raison des forces électriques exercées sur les deux moitiés de cellules, ce qui entraîne un étirement uniaxial, connu sous le nom d’électrodéformation. Le niveau de contrainte de cisaillement et la déformation résultante peuvent être facilement ajustés en modifiant l’amplitude de l’onde d’excitation. Cela permet de quantifier la déformabilité non linéaire des globules rouges en réponse à des déformations petites et grandes à haut débit. La modification de l’onde d’excitation avec la stratégie ASK induit une électrodéformation cyclique avec des taux de charge et des fréquences programmables. Il s’agit d’un moyen pratique de caractériser la fatigue liée aux globules rouges. Notre approche d’électrodéformation modulée ASK permet, pour la première fois, une mesure directe de la fatigue des globules rouges à partir de charges cycliques. Il peut être utilisé comme outil pour les tests biomécaniques généraux, pour les analyses de la déformabilité cellulaire et de la fatigue dans d’autres types de cellules et conditions malades, et peut également être combiné avec des stratégies pour contrôler le microenvironnement des cellules, telles que la tension d’oxygène et les indices biologiques et chimiques.

Introduction

Les globules rouges (GR) sont les cellules les plus déformables du corps humain¹. Leur déformabilité est directement liée à leur fonctionnalité de transport d’oxygène. On a constaté que la déformabilité réduite des globules rouges était corrélée à la pathogenèse de plusieurs troubles des globules rouges². Les mesures de déformabilité nous ont permis de mieux comprendre les maladies liées aux globules rouges³. La durée de vie normale des globules rouges peut varier de 70 à 140 jours⁴. Par conséquent, il est important de mesurer comment leur déformabilité diminue avec le processus de vieillissement, par exemple, leur comportement à la fatigue dû aux contraintes de cisaillement cycliques³.

La mesure de la déformabilité des globules rouges à haut débit est difficile en raison des forces d’échelle de piconewton (~^10-12 N) appliquées aux cellules individuelles. Au cours de la dernière décennie, de nombreuses technologies ont été développées pour mesurer la déformabilité cellulaire⁵. Les mesures de déformation des globules rouges au niveau de la cellule unique peuvent être effectuées par aspiration à pipette et pince optique, tandis que les analyses globales sont effectuées par ektacytométrie à gradient osmotique. Les analyses d’ektacytométrie fournissent une abondance de données, ce qui permet de diagnostiquer les troubles sanguins ^6,7. La déformabilité des globules rouges peut également être analysée à l’aide de la théorie viscoélastique par microscopie à force atomique à sonde colloïdale. Dans cette méthode, l’analyse informatique est appliquée pour estimer le module d’élasticité des globules rouges, en tenant compte à la fois des réponses dépendantes du temps et de l’état d’équilibre. La déformabilité des globules rouges individuels peut être mesurée à l’aide de la méthode des réseaux à microchambres unicellulaires. Cette méthode analyse chaque cellule à travers la membrane et les marqueurs fluorescents cytosoliques pour fournir des informations sur la déformabilité des globules rouges et la distribution des caractéristiques cellulaires dans les populations complexes de globules rouges afin de détecter les troubles hématologiques⁸.

La fatigue est un facteur clé dans la dégradation des propriétés des matériaux manufacturés et des biomatériaux. Les essais de fatigue permettent une analyse quantitative de l’intégrité et de la longévité d’une structure soumise à une charge cyclique. L’analyse de la fatigue dans les cellules biologiques a longtemps été entravée par l’absence d’une méthode générale, facilement applicable, à haut débit et quantitative pour la mise en œuvre de la déformation cyclique dans les membranes cellulaires. Ceci est possible grâce à l’utilisation de techniques de modulation et d’électrodéformation du signal électrique mises en œuvre dans un environnement microfluidique. La technique de modulation par décalage d’amplitude (ASK) en tant que modulation numérique est appliquée via la modulation On-Off (OOK) dans cet article. Le concept de keying fait référence à la transmission de signaux numériques sur le canal, ce qui nécessite un signal porteur sinusoïdal pour fonctionner⁹. Les heures ON et OFF peuvent être égales. Dans le cadre de la saisie ON, les globules rouges entrent dans un état déformé lorsqu’ils sont exposés à une force d’électrodéformation externe (F_dep)¹⁰ créée par le champ électrique non uniforme. Dans le cadre de la saisie OFF, les globules rouges sont dans leur état détendu. Nous observons la fatigue des globules rouges, à savoir une dégradation progressive de leur capacité à s’étirer avec l’augmentation des cycles de charge. La perte de déformabilité induite par la fatigue dans les globules rouges peut fournir des informations sur les dommages membranaires accumulés pendant la circulation sanguine, ce qui nous permet d’étudier plus avant les liens entre la fatigue cellulaire et les états pathologiques.

Nous fournissons ici des procédures étape par étape sur la façon dont les tests de fatigue des globules rouges sont mis en œuvre dans un dispositif microfluidique via une électrodéformation modulée ASK et les paramètres du système tels que le dispositif microfluidique, la charge mécanique et l’imagerie microscopique pour la caractérisation de la dégradation progressive de la déformabilité mécanique des globules rouges.

Protocole

Le sang total humain déidentifié a été obtenu commercialement. Les travaux impliquant les échantillons de sang ont été effectués dans un laboratoire de niveau de biosécurité 2 en utilisant des protocoles approuvés par le comité institutionnel de biosécurité de la Florida Atlantic University.

1. Préparation du dispositif microfluidique

1. Collez la plaquette de silicium maître SU-8 pour la conception du canal microfluidique à l’intérieur d’une boîte de Petri en plastique de 14 cm et nettoyez-la avec du gaz_N2 .
2. Peser 60 g de polydiméthylsiloxane (PDMS) base et 6 g d’agent de durcissement PDMS dans un gobelet en papier. Mélanger les deux parties à l’aide d’une spatule en bois jusqu’à ce que le mélange soit d’un blanc trouble.
3. Versez le mélange PDMS dans la boîte de Petri en plastique contenant la plaquette de silicium. Placez la boîte de Petri dans un dessiccateur sous vide à l’aide d’un robinet d’arrêt à 3 voies. Tournez la vanne du robinet d’arrêt pour connecter le vide à la chambre de dessiccation afin d’éliminer les bulles d’air du PDMS.
4. Réintroduire de l’air dans la chambre de dessiccation en ajustant la vanne du robinet d’arrêt pour relier la chambre déshydratante à l’air ambiant en cycles d’environ 5 minutes. Répétez l’opération jusqu’à ce que toutes les bulles d’air soient retirées des caractéristiques des canaux.
5. Placer la boîte de Petri dans un four à 70 °C pendant 4 h. Une fois le temps écoulé, retirez la boîte de Pétri, laissez-la refroidir à température ambiante et placez-la sur un tapis de coupe.
6. À l’aide d’un scalpel, découpez la partie du PDMS au-dessus de la tranche de silicium. Placez le PDMS découpé entre les deux feuilles de film d’emballage de laboratoire. L’espace formé entre l’empreinte du microcanal et le film semi-transparent facilite l’identification de l’emplacement du canal microfluidique ainsi que de son entrée et de sa sortie respectives.
7. À l’aide d’une lame de rasoir, découpez un canal individuel du grand PDMS. Poinçonner un trou d’entrée de 3 mm et un trou de sortie de 1,5 mm à l’aide de poinçons de biopsie respectifs aux deux tailles (figure 1A).
8. Placez le canal percé, avec le côté du canal vers le haut, sur une lame de verre propre. Placez un substrat de verre de 20 mm x 15 mm contenant des électrodes interdigitées en oxyde d’indium-étain (ITO) à couche mince sur la même lame de verre, les électrodes tournées vers le haut.
9. Placez délicatement la lame de verre avec PDMS et substrat dans un nettoyant plasma. Fermez la vanne de gaz, allumez l’interrupteur de la pompe et attendez 2 minutes pour obtenir une lecture de capteur de 600 à 800 mTorr.
10. Allumez l’interrupteur d’alimentation et attendez 30 s. Tournez le bouton d’alimentation RF de bas en haut et attendez 1 min.
11. Ensuite, inversez la séquence en tournant le bouton RF sur le bas, l’interrupteur d’alimentation sur OFF, le commutateur de pompe sur OFF et ouvrant la vanne de gaz.
12. Immédiatement après avoir ouvert la chambre du nettoyeur plasma, soulevez et faites pivoter le PDMS de manière à ce que le côté du canal soit orienté vers le bas (180°). Placez le canal sur le dessus du substrat OTI. Le processus de liaison a commencé.
13. À l’aide d’une pince à épiler, appuyez doucement sur les coins du PDMS pendant environ 3 s. Évitez d’appuyer sur le canal lui-même.
    NOTE: Le processus de collage se produit spontanément au contact physique entre les deux surfaces traitées.
14. Charger le milieu d’amorçage dans une seringue de 1 mL avec une aiguille de 23 G. Mouillez soigneusement le canal en insérant l’aiguille directement dans le puits d’entrée, puis en libérant le milieu. Opérez lentement. N’introduisez pas de bulles d’air. Incuber pendant au moins 3 min.
15. Retirez le milieu principal à l’aide d’une pointe de pipette de 10 μL. Lavez le canal avec un milieu DEP 3 fois en insérant le milieu DEP dans le canal. Gardez le canal humide en tout temps.

2. Gabarit d’essai

REMARQUE : Le montage d’essai est conçu à l’aide d’un logiciel de CAO 3D et comprend un boîtier de base et une unité supérieure (Figure 1B). Ensuite, il est fabriqué à l’aide d’une fraiseuse CNC à 3 axes avec une limite de tolérance standard d’environ ± dimension de 0,005 pouce du montage d’essai est vérifiée à l’aide d’un étrier électronique (non représenté). La stérilité de l’appareil n’est pas requise pour les essais biomécaniques in vitro.

1. Fils de pré-soudure dans les extrémités de la coupelle de soudure de deux ensembles de connecteurs à piston à ressort.
2. Insérez les connecteurs à piston à ressort dans l’unité supérieure et créez un collage permanent en ajoutant une goutte de colle époxy.

3. Préparation du tampon de travail électrodéformation

1. Pour préparer le milieu DEP, peser 12,75 g de saccharose et 0,45 g de dextrose à l’aide d’une balance.
2. Dissoudre les deux poudres dans un seul contenant contenant 150 mL d’eau désionisée (DI) et 3,5 mL de solution saline tamponnée au phosphate (PBS).
3. À l’aide d’un testeur de conductivité à faible plage, mesurer la conductivité et s’assurer qu’elle est de 0,04 S/m (figure 2).
   REMARQUE: Une valeur de conductivité différente peut être utilisée, ce qui pourrait modifier le signe et l’amplitude de la force DEP¹¹ résultante. L’électrodéformation, cependant, nécessite une force DEP positive.
4. À l’aide d’un osmomètre, confirmer que l’osmolarité se situe dans la plage normale du plasma sanguin, soit 275 à 295 mOsm/kg d’eau (figure 3). Conserver à 4 °C. Le médium DEP est maintenant prêt.
5. Dans un tube de 15 mL, dissoudre 0,5 g d’albumine sérique bovine (BSA) dans 10 mL du milieu DEP. Mélanger. Le support principal de l’appareil est maintenant préparé.

4. Préparation de la suspension cellulaire

1. Laver 20 μL du sang total en centrifugeant le sang avec 1 mL de PBS à 268 x g pendant 3 min. Jetez le surnageant.
2. Remettez en suspension les globules rouges dans 1 mL de PBS. Pipeter doucement pour mélanger. Laver les globules rouges pendant 3 min à 268 x g et jeter le surnageant.
3. Extraire 5 μL de granulés de globules rouges à l’aide d’un embout de micropipette de 10 μL et distribuer complètement dans 1 mL du milieu DEP. Laver les cellules par centrifugation à 268 x g pendant 3 min.
4. Jeter le surnageant et remettre en suspension les globules rouges dans 1 mL de milieu DEP. Pipeter doucement pour mélanger.
5. Laver les globules rouges pendant 3 min à 268 x g et jeter le surnageant. Pipeter 2 μL de pastille de globule de globule de globule dans 500 μL de milieu DEP. La suspension cellulaire est maintenant préparée avec une concentration comprise entre 62 et 104 cellules/μL¹², ce qui peut être confirmé à l’aide d’une lame de comptage de cellules standard.

5. Configuration de l’électrodéformation et essais de fatigue

1. Placer le dispositif microfluidique dans la partie inférieure du montage d’essai. Alignez la partie supérieure du luminaire sur le dispositif et assemblez les deux pièces à l’aide de deux jeux de vis et d’écrous en nylon (Figure 4).
2. Placez le dispositif d’essai sur la platine du microscope. Localisez un jeu d’électrodes souhaité sous le microscope.
3. Connectez la paire correspondante de fils d’électrodes qui correspondent au jeu d’électrodes situé à la borne de sortie du générateur de fonctions (Figure 4).
4. Retirer 5 μL du milieu DEP de l’entrée de 3 mm du canal microfluidique. Chargez lentement 5 μL de la suspension cellulaire dans l’entrée à l’aide d’un embout de pipette de 10 μL.
5. Laissez les cellules s’installer pendant 1 min. Si nécessaire, ajoutez un milieu DEP supplémentaire à l’entrée pour pousser les cellules dans le canal.
6. Observez le canal sous grossissement 20x. Utilisez un filtre passe-bande 414/46 nm pour améliorer le contraste de l’imagerie.
7. Appuyez sur le bouton Sine et définissez une onde sinusoïdale avec une amplitude_RMS de 2 V à une fréquence de 3 MHz. Appuyez sur le bouton Mod pour activer la modulation. Changez le mode d’onde en ASK en appuyant sur l’option Type .
8. Réglez la fréquence de modulation sur 250 mHz, ce qui correspond à une période de chargement-déchargement de 4 s (Figure 5A). Activez la sortie du générateur de fonctions.
9. Enregistrez une vidéo de 1 min toutes les 10 minutes à 30 images par s (ips).

6. Caractérisation de la déformation des globules rouges

1. À l’aide d’une application de montage vidéo, ouvrez .avi fichiers enregistrés à l’étape précédente en appuyant sur Ctrl+O. Utilisez le scénario pour choisir une image d’intérêt et définissez les images de début et de fin de sélection pour qu’elles soient identiques en appuyant sur la touche Accueil , puis sur la touche Fin du clavier.
2. Exportez le cadre de l’image. Sélectionnez le format de sortie JPEG et appuyez sur OK.
3. Ouvrez l’application ImageJ et chargez les images enregistrées à l’étape précédente. Commencez par définir les mesures nécessaires en appuyant sur Analyser > Définir les mesures et en vous assurant que les cases à cocher Surface, Périmètre et Ajuster l’ellipse sont cochées. Appuyez sur OK.
4. Ensuite, convertissez l’image en niveaux de gris en choisissant Image > Type > 8 bits.
5. Convertissez ensuite l’image en binaire à l’aide de l'> d’image Ajuster > Seuillage. Dans la boîte de dialogue Seuil, ajustez les deux curseurs selon vos besoins. Appuyez sur Appliquer , puis fermez la boîte de dialogue Seuil.
6. Choisissez Analyze > Tools > ROI Manager ( Analyser les outils ROI Manager. Dans le Gestionnaire de retour sur investissement, appuyez sur la case à cocher Afficher tout. Ne fermez pas cette boîte.
7. Sélectionnez l’outil Baguette (traçage), sélectionnez une cellule applicable dans l’image, puis appuyez sur la touche T du clavier. La cellule sélectionnée sera numérotée. Une nouvelle cellule peut être sélectionnée à nouveau. Sélectionnez toutes les cellules applicables à mesurer. Les cellules applicables sont identifiées comme étant celles qui sont isolées des autres cellules. Le nombre de ces cellules pourrait varier de 50 à 200 dans un seul champ de vision.
8. Revenez à la zone ROI Manager et appuyez sur Mesurer. La boîte de dialogue Résultats s’ouvre. Les colonnes étiquetées Majeur et Mineur sont les longueurs des axes elliptiques majeurs et mineurs ajustés (en pixels), respectivement. Choisissez Fichier > Enregistrer sous pour exporter les mesures au format CSV.
9. À l’aide de tout logiciel d’analyse informatique approprié, calculez le quotient majeur et mineur.

Résultats

Lorsque la suspension cellulaire a été chargée dans le canal microfluidique, une distribution relativement uniforme des cellules a été observée. Lors de la sortie du signal (par exemple, une simple onde sinusoïdale ou une phase On-Keying de ASK) du générateur de fonctions, les électrodes interdigitées à couche mince ont généré un champ électrique de courant alternatif non uniforme. Les cellules en suspension ont spontanément répondu à cette excitation électrique et ont présenté un comportement DEP positif, à savoir se dé...

Discussion

La modulation ASK OOK d’une onde sinusoïdale induisant une force DEP peut être utilisée pour tester la fatigue mécanique des globules rouges sur une longue période de temps. Dans ce protocole, nous avons limité les tests de fatigue in vitro à 1 heure pour prévenir les effets métaboliques indésirables potentiels sur la déformabilité cellulaire. Des conditions complètes d’essai de fatigue peuvent être programmées à l’aide de la technique d’électrodéformation modulée ASK. Des paramètres tels que la fréquence de chargement, ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Balance Balance	ViBRA	HT-224R
Filtre passe-bande	BRIGHTLINE	414/46 BrightLine HC
BD  ; Seringues jetables avec Luer-Lok&trade ; Embouts, 1 mL	Scientific	14-823-30
Poinçons de biopsie avec système de piston, 1,5 mm	Scientific	12-460-403
Poinçons de biopsie avec système de piston, 3 mm	Fisher Scientific	12-460-407	1,5 mm et 3 mm de diamètre
, calibre 23	BSTEAN	X001308N97
Bovin Serum Albumine	RMBIO	BSA-BSH
Centrifugeuse	SCILOGEX	911015119999
tube conique, 50 mL	Fisher Scientific	05-539-13
Dextrose	Fisher Scientific	MDX01455	MilliporeSigma&trade ;
Conductimètre EC basse conductivité	ecoTestr	358/03
Eppendorf  ;   ; Microcentrifugeuse à bouchon encliquetableTubes	www.eppendorf.com	05-402-25
Excel	Microsoft  ;		Générateur de fonction de traçage de graphes
	SIGLENT	SDG830
Substrat d’électrode verre/ITO	OSSILA	S161
ImageJ	NIH		https://imagej.nih.gov/ij/
Microscope inversé	OLYMPUS	IX81 - Four de
	QUINCY LAB (QL)	modèle 30GCE	Modèle numérique
traçage de graphiques	Matlab	MathWorks
- Modèle 3300	Advanced Instruments Inc.	S/N : 03050397P
Parafilm Laboratoire Film d’emballage	Fisher Scientific	13-374-12
Boîte de Pétri	FALCON	SKU=351006	ICSI/Biopsydish 50*9 mm
Phosphate Buffered Saline (PBS)	LONZA	04-479Q
Nettoyeur plasma	Harrick PDCOOL	NC0301989
Solidworks	Dassault Systemes		Logiciel de CAO
Sucrose Fisher	Scientific	50-188-2419
Dessiccateur sous vide	SPBEL-ART	F42400-2121
Spatule en bois	Fisher Scientific	NC0304136	Abaisse-langue Bois NS 6"