Optimisation du modèle murin de parodontite induite par ligature pour la recherche préclinique

Résumé

Le modèle murin de parodontite induite par ligature est un outil efficace et de plus en plus populaire pour étudier la maladie parodontale. Des directives détaillées sont présentées pour mettre en œuvre une version simplifiée du modèle axée sur la destruction de l’os alvéolaire interproximal, incluant la conception d’études en laboratoire, la production d’outils imprimés en 3D et la quantification osseuse par analyse μCT.

Résumé

Le modèle expérimental de la parodontite induite par ligature chez la souris a joué un rôle fondamental dans la compréhension de la pathogenèse de la maladie parodontale ; Pourtant, elle n’a pas été pleinement exploitée pour des applications translationnelles et thérapeutiques. À l’instar des maladies humaines, la parodontite induite par ligature chez la souris se développe via une série d’événements microbiens, inflammatoires et ostéo-immunologiques distincts. La destruction de l’os alvéolaire induite par la ligature progresse en une période relativement courte et est facilement quantifiable, ce qui en fait un modèle de maladie rentable pour les études précliniques.

Pour surmonter le défi technique du modèle classique de ligature, l’établissement du modèle murin simplifié de parodontite induite par la ligature a été organisé. Plutôt que d’induire une maladie sur toute la circonférence de deux dents adjacentes, le modèle simplifié de la maladie se concentre sur la destruction osseuse inflammatoire uniquement dans la région interproximale de deux dents postérieures, qui est également la région initiée par la maladie parodontale courante chez l’humain. Parce qu’elle utilise des outils imprimés en trois dimensions (3D) pour le placement des ligatures, l’approche est rapide et efficace, ce qui permet un temps procédural de 5 à 10 minutes par souris. Bien que la signalisation ostéoclastogène soit détectée après 3 jours de pose de la ligature, la destruction osseuse se développe systématiquement à 9 jours après la ligaturage.

Ici, le protocole simplifié du modèle de ligature est développé en mettant en lumière des éléments importants spécifiques à la conception de l’étude (c’est-à-dire le calcul de puissance, la normalisation des procédures, l’étalonnage), le développement des outils imprimés en 3D (c’est-à-dire le « lit dentaire de la souris » et le « support de ligature »), et la quantification de l’os alvéolaire par analyse μCT. L’expression génique gingivale de Rank, Rankl et Opg, une triade régulatrice maîtresse de l’ostéostogenèse, est utilisée comme preuve indirecte de l’efficacité thérapeutique. Les méthodes présentées dans cet article guideront la mise en œuvre par les chercheurs du modèle simplifié de parodontite induite par ligature pour tester des thérapies parodontales innovantes en contexte préclinique.

Introduction

La maladie parodontale est un processus inflammatoire complexe qui entraîne la destruction des structures de soutien dentaire, notamment la gencive, le ligament parodontal, le cément et l’os alvéolaire. Pour que la perte osseuse parodontale se développe, la rupture de la barrière gingive et l’invasion bactérienne doivent se produire, en plus du recrutement des cellules inflammatoires et de la transition d’une réponse immunitaire dominée innée à une réponse dominée par l’acquisition¹. Le déséquilibre final entre ostéoblastes et ostéoclastes entraînera une perte osseuse alvéolaire par destruction². La découverte phénotypique distinctive qui différencie le diagnostic de la maladie parodontale de l’inflammation gingivale réversible (gingivite) est la perte de l’os alvéolaire. Par conséquent, la quantité d’os alvéolaire qui soutient la dent est un résultat thérapeutique clé dans le contexte préclinique.

Aucun modèle animal unique ne peut reproduire tous les aspects biologiques nécessaires au développement de différentes^{thérapies 3,4,5}. Le modèle murin de parodontite induite par ligature développe une destruction osseuse quantifiable en un temps raisonnablement court (3 à 9 jours⁾⁵, ce qui en fait un modèle rentable pour tester de nouvelles interventions thérapeutiques pour la prévention et la modulation de la parodontite. Malgré son succès dans le développement des essais cliniques humains^{de phase II-III} 6,7,8,9,10, la parodontite induite par ligature chez la souris n’est pas couramment utilisée comme modèle préclinique. Pour surmonter les défis techniques du modèle classique où la ligature entoure la dent, le modèle simplifié de parodontite induite par la ligature^11,12 a été mis en place. La modification simple du modèle classique est centrée sur un site de destruction osseuse ciblée, entre les dents plutôt qu’autour d’elle. Les avantages de cette modification sont multiples, notamment une durée plus courte requise pour 1) la formation du personnel, 2) la facilité technique de la procédure expérimentale, et 3) la reproductibilité de la quantification osseuse. De plus, il a été découvert que plusieurs événements microbiologiques et immunologiques qui se développent et se manifestent sous ce modèle simplifié correspondent à la compréhension actuelle de la maladie parodontale humaine^courante 2,11,12,13. Enfin, la prévention efficace de la perte osseuse induite par des médicaments précédemment rapportée par nous ^2,14 soutient en outre l’utilisation du modèle simplifié de parodontite induite par ligature comme outil in vivo pour évaluer les aspects clés des nouvelles thérapies parodontales.

Un aspect innovant du modèle simplifié de parodontite induite par ligature a été le développement d’outils imprimés en 3D pour faciliter plus facilement le processus d’induction^{de la maladie 11,12}. Bien que cela soit intuitif pour certains, les chercheurs ont signalé une incapacité à assembler les outils imprimés^{en 3D 15}, ce qui pourrait encore entraver ou retarder l’initiation de l’étude animale. La présente étude développe les informations présentées dans notre précédente étude^{protocolaire 11}et fournit des informations détaillées permettant la mise en œuvre réussie du modèle simplifié de parodontite induite par ligature en laboratoire. Les détails inclus dans ce protocole actuel font partie d’un ensemble complexe de facteurs qui peuvent contribuer à l’absence de reproductibilité des résultats scientifiques 15,16,17. L’utilisation constante des modèles et la résorption osseuse fiable identifiées dans les multiples études 2,11,12,14,18 ainsi que par des groupes de recherche^{collaboratifs} 13,19,20,21 au cours des dix dernières années soutiennent l’importance de diffuser des informations détaillées pour promouvoir la reproductibilité au sein de la communauté scientifique.

Protocole

Ce protocole respectait les directives Animal Research : Reporting of In Vivo Experiments (ARRIVE^{) 22,23}. Toutes les procédures expérimentales décrites dans ce protocole ont été approuvées par l’IACUC de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill.

1. Conception expérimentale

1. Calcul de la taille de l’échantillon
   REMARQUE : En raison de la nature translationnelle du programme de recherche, le calcul de puissance présenté ici est basé sur des mesures d’os alvéolaire de souris sauvages de type C57Bl6 âgées de 8 à 12 semaines.
   1. Analysez l’os en fonction des mesures linéaires entre la jonction ciment-émail et la crête osseuse alvéolaire (CEJ-ABC).
      1. Les souris en bonne santé ont un niveau moyen d’attache (ou mesure CEJ-ABC) de 0,2 mm, tandis que les souris atteintes de parodontite au 9 jours post-ligature ont deux fois cette quantité (distance CEJ-ABC de 0,4 mm)¹¹. La perte osseuse alvéolaire n’augmente pas de manière significative entre 9 et 18 jours après la pose de la^{ligature 11}.
      2. Effectuez une analyse de calcul de puissance basée sur cette taille d’effet pour identifier le nombre de souris nécessaires pour révéler ces différences entre santé et maladie (ici, un total de 8 à 10 souris [Figure 1A]).
         REMARQUE : La puissance a été calculée pour atteindre une puissance comprise entre 0,8 et 0,95, α = 0,05, en utilisant une puissance moyenne à deux échantillons. Les moyennes de groupe et les écarts-types sont présentés à la Figure 1B.
   2. Pour déterminer un effet thérapeutique sur la perte osseuse, effectuez un calcul de puissance différent. Plutôt que de comparer des souris saines à des souris malades, comme les groupes expérimentaux et témoins développent une parodontite dans ce protocole, il faut réserver entre 19 et 31 souris/groupe afin d’assurer la reproductibilité des résultats lors du test de modulation de la perte osseuse en utilisant le modèle de parodontite simplifiée induite par ligature (voir résultats représentatifs et Figure 1C).
      REMARQUE : La puissance a été calculée à l’aide du même test décrit ci-dessus. Les moyennes de groupe et les écarts-types sont présentés à la Figure 1D.
2. Normalisation des procédures et étalonnage du personnel
   1. Former et calibrer tout le personnel impliqué dans l’induction et la quantification de la maladie avant l’initiation de l’étude (interétalonnage et intracalibration ; r² ≥ 0,90).
      REMARQUE : On estime que la formation à la pose de ligatures et à la quantification de la perte osseuse nécessite une période de 2 à 3 mois (calendrier présenté dans le tableau 1). D’autres étapes obligatoires sont présentées sous forme de chronologie dans le tableau 1.
   2. Pour la pose de la ligature, deux enquêteurs formés travaillent ensemble dans la salle de procédure. Le chercheur principal (intra- et inter-calibré) reste l’opérateur qui place les ligatures.
   3. Faites travailler le second enquêteur comme assistant procédural et effectuez les étapes listées ci-dessous :
      1. Enregistrer le poids de la souris.
      2. Placez la souris dans la boîte anesthésique.
      3. Appliquer une pommade oculaire sur la souris avant de la remettre à l’opérateur pour qu’elle soit placée dans le « lit dentaire de la souris ».
      4. Assurez-vous que ≥ 3 « supports de ligature » sont correctement chargés avec les ligatures et prêts à l’emploi.
         REMARQUE : Pour améliorer l’efficacité, il est idéal d’avoir ≥3 « porte-ligaures » appropriément chargés pour l’utilisation par l’opérateur. Une rapidité est recommandée (c’est-à-dire un temps de procédure de 5 à 10 minutes par souris), augmentant le nombre d’expériences réalisées dans une journée et diminuant les effets potentiels de lot.
      5. Effectuez une surveillance souris (avant et après la procédure).
         REMARQUE : La parodontite induite par la ligature est une procédure non invasive et non chirurgicale, similaire au passage du fil dentaire d’une dent humaine. La pose de la ligature devrait causer un très léger inconfort aux souris (principalement dû à l’accumulation de bactéries entre deux dents), mais ne devrait pas nécessiter d’utilisation d’analgésiques. Aucune complication n’est attendue après la pose de ligature effectuée par une personne formée. Tous les animaux sont surveillés tous les 2 à 3 jours après la pose de la ligature. Les critères humains (par exemple, incapacité à se toiletter ou à manger, incapacité à se lever ou à marcher, respiration laborieuse, plaies nécrotiques ou infectées) doivent être listés dans le protocole animal approuvé, mais en cas de complications, le personnel vétérinaire doit être consulté sur les mesures appropriées.

2. Création d’outils imprimés pour induire la parodontite par ligature chez la souris

REMARQUE : Pour optimiser le placement des ligatures, des outils imprimés en 3D nommés Mouse Dental Bed et Ligature Holder ont été développés, composés de plusieurs pièces individuelles imprimées en 3D qui sont imprimées séparément puis assemblées manuellement. Les spécifications de plans pour ces dispositifs ont été précédemment^{publiées 11} et peuvent être utilisées par des chercheurs expérimentés pour créer des fichiers STL individuels. Les nouveaux dispositifs de la présente étude ont été créés en collaboration avec le BeAM Design Center de l’Université de Caroline du Nord à Chapel Hill. Les matériaux peuvent être obtenus via l’installation principale respective ou imprimés en 3D à l’aide des fichiers STL du Fichier Supplémentaire 1.

1. Lit dentaire pour souris
   1. Imprimez le lit dentaire de souris (Figure 2A) et le porte-ligature (Figure 2B) en utilisant la qualité d’impression standard sur une imprimante 3D avec un filament d’acide polylactique (PLA) de 3,0 mm. Imprimez le lit dentaire dans l’orientation prévue et les autres parties avec les surfaces uniformes et plates orientées vers le bas par rapport au lit d’impression. Activez l’option matériau de soutien en activant le paramètre Placement de soutien. Assurez-vous que le matériau de support touche d’abord la plaque de construction en sélectionnant l’option Toucher la plaque de construction.
      REMARQUE : Utilisez les cinq fichiers STL du Fichier Supplémentaire 1 pour imprimer tous les éléments nécessaires, y compris le tube détaché, la ligature (avec encoche), le lit dentaire de souris (avec encoches), le couvercle et le verrou du porte-ligature. Voir le tableau des matériaux pour les dimensions de chaque article (spécifications de plans précédemment^{présentées 10}).
   2. Après l’impression, découpez toutes les pièces de support imprimées des modèles à l’aide de coupe-fils, de pinces à bec fin ou d’un autre instrument.
      REMARQUE : Portez des lunettes de sécurité pendant cette procédure.
2. Assemblage du lit dentaire de la souris
   1. Pour préparer le lit dentaire de la souris, disposez toutes les pièces comme indiqué (Figure 3A) et préparez la colle à utiliser (Figure 3B).
   2. Placez quelques gouttes de colle (Figure 3C) et fixez les vis comme montré (Figure 3D). Encore une fois, préparez-vous à transférer la colle (Figure 3E) sur les zones où elle sera appliquée. Faites glisser la fente du tube imprimé (Figure 3F) en place, l’extrémité barbelée tournée à l’opposé du lit dentaire de la souris (c’est là que le tuyau pour délivrer l’isoflurane se fixera).
   3. Fixez les pièces stabilisatrices de tête en position avec de la colle (Figure 3F).
   4. Essuyez tout excès de colle et maintenez une légère pression sur toutes les pièces insérées pour une fixation ferme (Figure 3F).
3. Ajustements des supports de ligature
   1. Pour réduire l’inconfort lors du verrouillage/déverrouillage du mécanisme, assurez-vous que tous les bords carrés/tranchants sur la partie extérieure du porte-ligature (Figure 4A) sont légèrement biseautés à un angle de 45° à l’aide d’un manche de scalpel 15C, n° 3 avec lame 15C.
   2. Pour garantir un ajustement serré du mécanisme de verrouillage au Porte-Ligature, écartez tous les coins arrondis internes du Porte-Ligature (Figure 4B-F) à l’aide d’une lame de scalpel 15C.
      REMARQUE : Cela permettra au verrou de s’appuyer complètement contre le support de ligature et ne nécessitera que des ajustements mineurs.
      1. Utilisez un outil de découpe en 3D ou une lame de scalpel 15C pour éliminer le « flash » restant sur les bords supérieur et inférieur même après avoir retiré la majeure partie du support, et biseautez légèrement les bords à 45° (similaire au biseau effectué sur le verrouillage Ligature Holder à l’étape 1) afin d’assurer un verrouillage bien ajusté.
         REMARQUE : Ne retirez pas trop de matériau, juste assez pour que le verrou glisse sans aucune résistance.
   3. Si c’est trop fin, taillez la longueur de chaque extrémité jusqu’à atteindre une section transversale plus épaisse [au moins 0,5 mm], en veillant à ce qu’il reste suffisamment de dégagement entre les pointes pour éviter toute pression sur le palais lors de la pose des ligatures. Assurez-vous que les embouts mesurent au moins 3 mm de long après la coupe (Figure 5A, indiquée par « CUT »).
   4. Sur les extrémités du support de ligatures, retirez tout flash du « support » sur lequel l’outil a été imprimé pour vous assurer que le côté des pointes est plat (Figure 5B, flèche).
   5. Retirez une « tranche » du côté de chaque extrémité à un angle de 45° pour faciliter le chargement de la ligature ainsi que pour adoucir les bords afin d’éviter des blessures traumatiques aux tissus mous (Figure 5C, indiquée par des flèches).
   6. Assurez-vous que chaque extrémité du porte-ligature comporte une encoche en forme de « V » dans laquelle les ligatures de soie de suture peuvent reposer. Si cela a été retiré à l’étape 2.3.6 parce que la pointe initiale imprimée était trop fine, affinez-la sur l’impression ou reproduisez-la.
      1. Si cette encoche en forme de « V » est visible, posez le porte-ligature sur une surface plate avec les deux extrémités parallèles à la table, placez doucement une lame de scalpel 15C à la base de l’encoche, et balancez doucement la lame de gauche à droite de sorte que le tranchant reste à la base du « V » et que le côté de la lame touche les parois supérieures du « V ». Avec la lame à la base de l’encoche, inclinez très soigneusement la lame vers la surface extérieure de la pointe et répétez ce mouvement pour affiner la base de l’encoche en forme de « V » sur le bord extérieur, ce qui permettra au fil de suture de se guider plus facilement en place.
         REMARQUE : Cette action de balancement crée juste assez de mouvement dans le filament pour le déplacer hors du chemin et affiner l’encoche sans enlever trop de matériau.
      2. Si cette encoche en forme de « V » n’est pas visible, posez le porte-ligature sur une surface plane avec les deux extrémités perpendiculaires à la table. En regardant droit vers le bas le long des deux extrémités du porte-ligaure, placez une lame de scalpel 15C au centre des extrémités, et en un mouvement délibéré, effectuez une coupe superficielle pour créer le début de ce qui deviendra l’encoche en forme de « V ».
         REMARQUE : Il est souvent plus facile d’effectuer cette action sur chaque pointe séparément plutôt que d’essayer de positionner la lame au bon endroit sur les deux extrémités en même temps.
      3. Répétez l’étape 2.3.7.2 si nécessaire, en veillant à ce que le tranchant de la lame du scalpel soit toujours au même endroit au centre de la pointe.
         REMARQUE : Si le tranchant de la lame ne revient pas au même endroit, plusieurs coupes seront effectuées, ce qui fera que les couches de filament commencent à se séparer à ces endroits et réduira potentiellement les performances de l’outil.
         REMARQUE : La profondeur de l’encoche en forme de « V » doit être testée périodiquement à l’aide d’une ligature en suture nouée en soie pour déterminer si la ligature tient ou si elle glisse sans cesse (cela peut indiquer qu’un affinage supplémentaire est nécessaire). Le support doit être imprimé avec l’encoche orientée vers le bas sur la plaque de construction et le verrouillage du porte-ligature orienté, l’ouverture plus large touchant la plaque de construction. Là encore, le matériel de support peut être utilisé avec le placement du support réglé uniquement sur la plaque de construction touchante.
4. Assemblage du porte-ligature
   REMARQUE : Après les modifications, assemblez le porte-ligature et vérifiez ce qui suit :
   1. Lorsqu’une ligature est verrouillée, assurez-vous que le cadenas pince le filetage au porte-ligature (non visible dans la Figure 6A comme indiqué par la flèche, mais visible dans la Figure 6B) soit en haut soit en bas du cadenas (les deux si possible, mais cela peut être difficile à réaliser).
      REMARQUE : Cette friction garantit que la ligature ne glisse pas de sa place.
   2. Lorsque vous enfilez la ligature dans les rainures du porte-ligaure, si elle glisse sans cesse des extrémités, soit vous creusez les rainures, soit vous les prolongez davantage à l’extérieur de la pointe pour créer une « piste » dans laquelle le filetage s’installera.
   3. Vérifiez que les deux nœuds sont centrés (Figure 6C) et à niveau (ligne droite dans la Figure 6D) lorsqu’on les voit depuis l’avant du support de ligature ; Sinon, alors une rainure est plus profonde que l’autre.
   4. Vérifiez que la ligature est juste à l’intérieur des encoches et qu’elle n’est pas trop profonde ; sinon, il existe un risque accru que la pointe du porte-ligature entre en contact avec les tissus mous et provoque un traumatisme lors de la pose de la ligature.
   5. À l’aide d’un explorateur dentaire (Figure 6E), vérifiez que la ligature rebondit en place sans glisser lorsque la force est appliquée entre les nœuds (cela simule la force qu’elle subira lors de la pose de la ligature).

3. Pose de ligature

REMARQUE : Il est possible que les ligatures soient placées entre les dents murines avec ou sans ajout de pathogènes parodontaux^{humains 11}. Une analyse dépendante du temps de la composition microbienne de la ligature (sans supplémentation avec des espèces bactériennes humaines) a démontré un changement de la communauté microbiome (dysbiose) lors du développement de la^{parodontite 12}. Pour cette raison, le remplacement de la ligature n’est pas recommandé car il peut modifier la reproductibilité des résultats. L’inclusion d’espèces bactériennes en combinaison avec la ligature dépend de la question abordée dans une étude spécifique. En raison de la perte de ligature^{attendue de 10} à 15 %, les ligatures sont placées bilatéralement dans une seule souris. Cette approche minimise la perte de souris pendant l’expérience.

1. Après que la souris a été anesthésiée avec de l’isoflurane inhalé, placez-la dans le lit dentaire de la souris, le dos contre le lit et le nez positionné près du cône nasal.
   REMARQUE : Les souris doivent être anesthésiées avec de l’isoflurane à 4 % (vol/vol). Le vaporisateur d’isoflurane et l’oxygène sont filtrés par un filtre à air de 0,2 μm. Une fois la souris complètement anesthésiée et placée dans le lit dentaire de la souris, elle doit être maintenue avec un débit de 1,5 à 2,5 % par le cône nasal. Les souris sont surveillées par des mouvements corporels involontaires et leur rythme respiratoire (~55-65 respirations par minute). Aucun analgésique n’est nécessaire d’administrer aux souris induites par une parodontite par ligatura, car il s’agit d’une procédure non invasive et non chirurgicale, similaire à l’utilisation du fil dentaire d’une dent humaine. La pose de la ligature devrait causer un très léger inconfort aux souris (principalement dû à l’accumulation de bactéries entre deux dents), mais ne devrait pas nécessiter d’utilisation d’analgésiques. Aucune complication n’est attendue après la pose de ligature effectuée par une personne formée.
2. Utilisez les élastiques pour stabiliser la tête de la souris et ouvrez sa bouche.
   REMARQUE : La bande autour des incisives mandibulaires rétracte également la langue, et la tension est passive pour ouvrir la mâchoire sans tirer dessus. La visualisation des molaires est facilitée lorsque la source lumineuse est orientée en angle afin d’empêcher les ombres d’obscurcir le champ de vision. Le lit dentaire de la souris a été conçu spécifiquement pour le modèle murin de parodontite induite par ligature simplifiée. La distance entre le nez de la souris et le cône est nécessaire pour permettre à la souris d’avoir de petits mouvements corporels pendant la procédure expérimentale. Ce mouvement de la souris permet de surveiller correctement la manœuvre de la main de l’opérateur lors de l’utilisation du porte-ligature et contrôle la force exercée lors du placement de la ligature. La pose des ligatures devrait prendre 5 à 10 minutes par souris. Les procédures doivent être réalisées dans une hotte bien ventilée pour réaliser des expériences sur les animaux
3. Pour placer une ligature sur le côté droit, tenez le porte-ligature dans la main droite et l’explorateur dans la main gauche.
   REMARQUE : Si les nœuds de la ligature ne sont pas centrés entre les extrémités mais plutôt plus proches d’une extrémité, alors la ligature peut être mieux placée sur un côté spécifique. Par exemple, si les nœuds sont placés plus près de la pointe droite du support de ligature, cette ligature peut être plus facile à placer du côté droit.
4. Placez doucement la pointe de l’explorateur sous le contact interproximal des première et deuxième molaires du côté palatal.
   1. Faites d’abord toucher la pointe de l’explorateur sur les dents puis glisse vers le bas et reposer contre la gencive pour éviter de traumatiser les tissus mous ; Reposez la poignée Explorer en angle horizontale une fois correctement positionnée.
   2. Note quelle extrémité de l’explorateur est utilisée pour le côté droit et laquelle est utilisée pour le côté gauche. Assurez-vous que la pointe de l’explorateur s’accroche à la zone de contact proximale en direction ascendante tout en laissant la courbure de la tige se placer sur le côté controlatéral pour stabiliser la tête contre les forces réactionnaires lors du placement.
5. En utilisant le Porte-Ligature en angulation horizontale, rétractez la joue en positionnant d’abord le Porte-Ligature au-dessus du contact interproximal entre les deuxième et troisième molaires, en poussant le bord du Porte-Ligature contre la joue pour le déplacer, puis en plaçant le Porte-Ligature au contact interproximal des première et deuxième molaires.
   REMARQUE : Cette étape permet de s’assurer qu’aucune muqueuse buccale ne reste coincée entre la ligature et les dents, ce qui gênerait le placement.
6. Une fois la ligature positionnée au-dessus du contact interproximal entre les première et deuxième molaires, faites pivoter la poignée du support de ligature à 45°, et combinant un léger balancement et glissement, poussez la ligature à travers le contact.
7. Coupe du fil excédentaire :
   1. Utilisez une pince fine pour attacher le fil excédentaire attaché au nœud du côté droit, tirez le fil à travers les dents vers la gauche, et à l’aide de ciseaux légèrement ouverts, faites glisser les ciseaux le long du fil jusqu’à ce qu’ils soient positionnés à ~1,5 mm du nœud avant de couper.
      REMARQUE : Cela aide à réduire le risque de traumatisme muqueuseux involontaire lors de la coupe de l’excédent.
   2. Répétez ce qui précède avec les directions inversées pour l’autre nœud.
8. Imitez les étapes ci-dessus de la version 3.3. à 3.7.2. lors de la mise en place d’une ligature du côté opposé de la bouche.
   REMARQUE : La collecte des ligatures au sacrifice est recommandée, car le décalage dysbiotique peut être modifié par le test de différentes conditions^{expérimentales 12}. Pour faciliter la collecte, les souris sont placées dans le lit dentaire murin et un des nœuds de la ligature est découpé, suivi d’un retrait interproximal doux à l’aide de pinces. L’utilisation du lit dentaire de la souris lors de la collecte de la ligature permet une stabilité appropriée de la souris et un accès facile au site de la ligature.

4. Quantification de la destruction osseuse

1. Analyse μCT
   1. Ouvre le logiciel et clique sur Fichier | Importer l’image...
   2. Cliquez sur Parcourir dans le menu contextuel, allez dans le dossier contenant les fichiers Dicom pour un scan, et sélectionnez le premier fichier.
   3. Cliquez sur Examiner pour trouver et sélectionner d’autres fichiers dans le dossier faisant partie du même échantillon numérisé. Cliquez sur OK.
   4. Après le chargement de l’image, cliquez sur Visualiser et Isosurface.
   5. Changez le seuil d’image à 5 000 et le facteur de qualité de surface ( %) à 55.
   6. Cochez les cases Activer le lissage d’image et Clipper la surface avec le ROI actuel et cliquez sur Mettre à jour.
   7. Ajustez les propriétés du niveau en cliquant droit sur Fenêtre/Niveau en bas (Figure 7A) et cliquez sur Modifier les propriétés de la fenêtre/du niveau. Sélectionnez une valeur de densité osseuse standard pour tous les échantillons. Pour suivre ce protocole, utilisez 2 000 mais changez cela en fonction de la densité osseuse des échantillons et gardez-la constante pour toutes les mesures.
   8. Pour manipuler les plans :
      1. Utilisez les raccourcis clavier I/J/K, cacher/afficher pour les trois plans différents.
      2. Faites un clic droit et déplacez le curseur pour zoomer et dézoomer.
      3. Appuyez sur Majus, puis cliquez sur le bouton gauche pour faire le panoramique.
      4. Cliquez sur Trancher pour déplacer et faire pivoter les plans.
      5. Cliquez sur le centre du plan pour le déplacer vers l’avant ou l’arrière ou placez le curseur au centre du plan désiré et utilisez les flèches haut et bas pour déplacer le plan une tranche à la fois.
      6. Cliquez sur le bord du plan pour faire tourner autour d’une droite parallèle à cette arête au centre du plan.
      7. Cliquez sur le coin d’un plan pour faire tourner autour du plan.
   9. Orientez l’axe z (vitre bleue en haut de l’écran - la tranche z) de sorte que les surfaces/formes des trois dents deviennent visibles en même temps (ou aussi proches que possible) (Figure 7B).
   10. Faites défiler ce même plan (panneau bleu en haut de l’écran-z-slice) afin que les racines des^1re et^2e molaires soient visibles (Figure 7C). Essayez de choisir un point suffisamment profond dans les racines pour que toute l’anatomie environnante soit visible, mais aussi où les canaux paraissent bien définis et en ligne droite.
       REMARQUE : Le plan peut devoir être tourné pour orienter verticalement les canaux.
   11. Orientez l’axe des x (ligne verte verticale dans le panneau de la tranche Z) pour qu’elle s’aligne avec les racines buccales des^1re et^2e molaires (essayez d’aligner la partie centrale de chaque radicule/canal si possible ; sinon, alignez par la racine buccale de la^1re molaire et la racine distobucale de la^2e molaire) (Figure 7D).
   12. Utilisez l’orientation de la tranche en x comme référence pour l’alignement de la tranche en y (ligne bleue verticale dans le panneau de la tranche en x).
       1. Alignez la tranche en y de façon à ce qu’elle soit verticalement parallèle à travers la racine de la première molaire dans le panneau de la tranche en X (Figure 7E). Faites pivoter le plan pour orienter la racine verticalement. Observez que la ligne bleue traverse le milieu de la racine.
          REMARQUE : Dans les zones de perte osseuse (comme on peut s’y attendre avec ce modèle), la crête alvéolaire peut présenter un défaut ; par conséquent, la ligne médiane de la racine doit être estimée car l’os environnant peut ne pas être présent pour idéalement définir le milieu de l’alvéole.
   13. Dans le panneau en tranche en y, mesurez la distance entre la jonction cimentémaillée (CEJ) et la crête osseuse alvéolaire (ABC) en plaçant le curseur au point le plus profond de la rainure au niveau du CEJ et en appuyant sur 1, puis en plaçant le curseur au point le plus proche de l’ABC et en appuyant sur 2 comme montré (Figure 7F). Le^{premier point est} indiqué par une flèche bleue et le second par une flèche verte.
       1. Si les flèches n’apparaissent qu’une fois les deux points sélectionnés, sélectionnez-les en survolant les zones souhaitées et appuyez sur les touches numériques du clavier, car un simple clic de souris ne fonctionnera pas.
       2. Si le CEJ est difficile à déterminer, utilisez les flèches haut et bas pour faire défiler les tranches adjacentes afin de confirmer sa position.
       3. Mesurez plusieurs points de l’ABC si le « point le plus proche » est difficile à déterminer pour confirmer qu’il y a peu ou pas de variation dans la mesure.
          REMARQUE : Pour confirmer que la bonne mesure est prise, il faut voir les tranches x et z qui s’entrecroisent sur la racine désirée et pouvoir confirmer visuellement la mesure en vue 3D en masquant les plans (Figure 7F).
2. Quantification de l’expression gingivale de Rankl/Opg et Rankl/Rank
   1. Collectez le tissu gingival comme décrit précédemment⁹.
      REMARQUE : Les meilleurs résultats d’extraction d’ARN sont obtenus à partir d’échantillons de tissus frais et la purification de l’ARN doit être traitée dès que possible.
   2. Extraire l’ARN du tissu gingival par battage de billes en utilisant le kit référencé et les billes en céramique. Suivez les instructions du kit et conservez l’échantillon à -80 °C jusqu’à l’analyse par qRT-PCR.

Résultats

une analyse représentative des données des mesures de l’os alvéolaire linéaire chez des souris femelles et mâles WT au départ (santé) et 9 jours après la ligature est présentée dans la Figure 1A. Le calcul de puissance indique qu’un total de 10 souris (4 à 5 souris par groupe) sont nécessaires pour détecter les différences entre ces groupes si le critère principal considéré est les niveaux osseux linéaires mesurés par μCT (Figure 1B

Discussion

La présente étude fournit des informations éclairantes et des directives détaillées, étape par étape, sur le protocole simplifié du modèle murin de parodontite induite par ligature précédemment^{présenté 10}. Les détails inclus dans le présent article peuvent avoir un impact considérable sur la reproductibilité et sont confirmés par l’expérience du groupe avec ce modèle spécifique de parodontite induite par ligature 11,12,13,18,19,21.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Lame	Integra	4-315C	Lame 15C
Perles en céramique	VWR	10158-608	0,5 mL x 1,4 mm Billes en céramique
Matériau colle/résine	La Société de la Colle Gorille	8401519
Porte-ligature (avec encoche)	Cœur de l’installation UNC au Centre de conception BeAM de Chapel Hill	non applicable	118,01 mm x 13 mm x 13,74 mm
Verrou de support de ligature	Cœur de l’installation UNC au Centre de conception BeAM de Chapel Hill	non applicable	17,5 mm x 14,57 mm x 17,8 mm
Imprimante 3D Lulzbot mini v1.0 & nbsp ;	Lulzbot (Fargo Additive Manufacturing Equipment 3D, LLC)	non applicable	Objets Aleph, modèle Lulzbot Mini v1.0
Logiciel MicroView	Parallax Innovations	2.5.0-3139	Logiciels utilisés pour les mesures osseuses
Lit dentaire pour souris (avec encoches)	Cœur de l’installation UNC au Centre de conception BeAM de Chapel Hill	non applicable	103,86 mm x 196,85 mm x 50,99 mm
Plateau de lit dentaire pour souris	Cœur de l’installation UNC au Centre de conception BeAM de Chapel Hill	non applicable	99,8 mm x 77 mm x 21,5 mm
Filament d’acide polylactique (PLA)	Mot à mot	55259	PLA 3,0 mm
Kit tissulaire ARN Rapidpure	MP Biomédicals	112721050
Poignée de lame de scalpel	Bard-Parker	371030	Poignée de lame de scalpel 15C
Suture-Soie	Instrument chirurgical Roboz	SUT-15-1
Amorces qPCR Taqman	Thermo Fisher	Grade (Mm00437135_ m1), Rankl (Mm00441906_ m1), Opg (Mm00435452_ m1), Gapdh (Mm99999915_g 1)
VX-765	; InvivoGen, San Diego, États-Unis	#inh-vx765-1	Inhibiteur de caspase-1 utilisé pour la modulation de l’hôte