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Modèle translationnel de culture cellulaire 3D pour évaluer les effets de l’hyperoxie sur les cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales humaines

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DOI :

10.3791/65913

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12 juillet 2024

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1Department of Pediatrics, Section of Neonatal-Perinatal Medicine, Center for Pregnancy and Newborn Health, University of Oklahoma Health Sciences Center, 2Department of Medicine, Section of Pulmonary, Critical Care & Sleep Medicine, University of Oklahoma Health Sciences Center

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons un protocole pour établir un modèle de culture d’interface air-liquide (ALI) utilisant des cellules épithéliales des voies respiratoires trachéales néonatales (nTAEC) et effectuons une exposition à l’hyperoxie physiologiquement pertinente pour étudier l’effet du stress oxydatif induit par l’atmosphère sur les cellules dérivées de l’épithélium de surface des voies respiratoires néonatales en développement.

Résumé

L’épithélium des voies respiratoires du nouveau-né prématuré est constamment exposé à des facteurs de stress environnementaux. L’un de ces facteurs de stress chez les nouveau-nés atteints d’une maladie pulmonaire comprend une tension d’oxygène (O2) supérieure à celle de l’atmosphère ambiante - appelée hyperoxie (>21 % O2). L’effet de l’hyperoxie sur les voies respiratoires dépend de divers facteurs, notamment du stade de développement des voies respiratoires, du degré d’hyperoxie et de la durée de l’exposition, les expositions variables pouvant conduire à des phénotypes uniques. Bien qu’il y ait eu des recherches approfondies sur l’effet de l’hyperoxie sur l’alvéolarisation pulmonaire néonatale et l’hyperréactivité des voies respiratoires, on sait peu de choses sur l’effet sous-jacent à court et à long terme de l’hyperoxie sur les cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales humaines. L’une des principales raisons à cela est la rareté d’un modèle in vitro efficace pour étudier le développement et la fonction épithéliales des voies respiratoires néonatales humaines. Ici, nous décrivons une méthode d’isolement et d’expansion des cellules épithéliales des voies respiratoires trachéales néonatales humaines (nTAEC) en utilisant des aspirations trachéales néonatales humaines et en cultivant ces cellules en culture d’interface air-liquide (ALI). Nous démontrons que les nTAECs forment une monocouche cellulaire polarisée mature en culture ALI et subissent une différenciation mucociliaire. Nous présentons également une méthode d’exposition modérée à l’hyperoxie de la monocouche cellulaire dans la culture d’ALI à l’aide d’un incubateur spécialisé. De plus, nous décrivons un test pour mesurer le stress oxydatif cellulaire après une exposition à l’hyperoxie dans une culture ALI en utilisant la quantification fluorescente, ce qui confirme qu’une exposition modérée à l’hyperoxie induit un stress oxydatif cellulaire mais ne provoque pas de dommages significatifs à la membrane cellulaire ou d’apoptose. Ce modèle peut potentiellement être utilisé pour simuler l’exposition à l’hyperoxie cliniquement pertinente rencontrée par les voies respiratoires néonatales dans l’unité de soins intensifs néonatals (USIN) et utilisé pour étudier les effets à court et à long terme de l’O2 sur la programmation épithéliale des voies respiratoires néonatales. Des études utilisant ce modèle pourraient être utilisées pour explorer des moyens d’atténuer les lésions oxydatives précoces des voies respiratoires en développement, qui sont impliquées dans le développement de maladies des voies respiratoires à long terme chez les anciens nourrissons prématurés.

Introduction

L’oxygène thérapeutique (O2) est l’une des thérapies les plus utilisées dans l’unité de soins intensifs néonatals (USIN)1. Par conséquent, l’exposition à l’hyperoxie (>21 % d’O2) est un facteur de stress atmosphérique courant rencontré par les nouveau-nés avec et sans maladie pulmonaire importante. Les réponses pulmonaires à l’hyperoxie peuvent varier en fonction de l’intensité et/ou de la durée de l’exposition et de l’emplacement anatomique, du type de cellule et du stade de développement pulmonaire 2,3,4,5,6. La majeure partie de la recherche sur les lésions pulmonaires liées à l’hyperoxie néonatale a porté sur l’effet de l’exposition à l’hyperoxie dans le contexte de l’alvéolarisation postnatale pour modéliser la dysplasie bronchopulmonaire (DBP) - la maladie pulmonaire chronique la plus courante affectant les prématurés 6,7,8,9,10,11. La gravité du TPL est classée en fonction de la quantité d’assistance respiratoire et de l’O2 nécessaire à 36 semaines après la menstruation. La plupart des bébés atteints de DBP s’améliorent cliniquement au fil du temps à mesure que les poumons continuent de se développer, la majorité d’entre eux se sevrant de la soutien respiratoire avant leur premier anniversaire12,13. Quelle que soit la gravité de la DBP après la naissance, les morbidités importantes qui affectent les anciens bébés prématurés comprennent un risque 5 fois plus élevé de respiration sifflante préscolaire, d’asthme, d’infections respiratoires récurrentes tout au long de l’enfance et de bronchopneumopathie chronique obstructive précoce 12,14,15,16,17,18,19. L’effet de l’hyperoxie sur les maladies des voies respiratoires à long terme et les infections pulmonaires chez les nouveau-nés prématurés a été étudié à l’aide de modèles animaux in vitro et in vivo 20,21,22,23,24. Cependant, la plupart de ces modèles se sont concentrés sur le rôle du tissu mésenchymateux, de l’épithélium alvéolaire et du muscle lisse des voies respiratoires 25,26,27,28.

L’épithélium de surface des voies respiratoires borde tout le trajet du système respiratoire, s’étendant de la trachée jusqu’à la bronchiole terminale, se terminant juste avant le niveau des alvéoles29. Les cellules basales des voies respiratoires sont les cellules souches primaires de l’épithélium des voies respiratoires, avec la capacité de se différencier dans l’ensemble du répertoire des lignées épithéliales matures des voies respiratoires, qui comprend les cellules ciliées et sécrétoires (cellules club : non productrices de mucus et cellules caliciformes : productrices de mucus)29,30,31,32. Les études de culture cellulaire dans le contexte des lésions pulmonaires hyperoxiques néonatales ont principalement utilisé des lignées cellulaires cancéreuses adultes, humaines ou murines33,34. De plus, la plupart des expériences in vitro ont utilisé des systèmes de culture submergés, qui ne permettent pas la différenciation des cellules en un épithélium des voies respiratoires mucociliaire ressemblant à l’épithélium des voies respiratoires in vivo chez l’homme35. Par conséquent, il existe un manque de connaissances concernant les effets des lésions pulmonaires induites par l’hyperoxie sur le développement des cellules épithéliales des voies respiratoires des nouveau-nés humains. L’une des raisons est la rareté des modèles translationnels pour étudier les effets de l’exposition atmosphérique sur l’épithélium néonatal des voies respiratoires humaines. Les lésions pulmonaires hyperoxiques au début de la vie peuvent entraîner une maladie des voies respiratoires à long terme et un risque accru d’infection, entraînant des conséquences qui changent la vie des anciens prématurés 14,36,37. Chez les nourrissons non survivants atteints d’une DBP sévère, l’épithélium de surface des voies respiratoires présente des anomalies distinctes, notamment une hyperplasie des cellules caliciformes et un développement ciliaire désordonné, indiquant une clairance mucociliaire anormale et une augmentation de la hauteur épithéliale compromettant le calibre des voies respiratoires38. Au cours de la dernière décennie, on s’est intéressé de plus en plus à la culture de cellules épithéliales primaires des voies respiratoires à l’interface air-liquide (ALI) pour étudier le développement épithélial postnatal des voies respiratoires 39,40,41,42. Cependant, les modèles ALI de cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales n’ont pas été utilisés dans le contexte des modèles de perturbation redox atmosphérique tels que l’exposition à l’hyperoxie.

À l’aide d’une méthode précédemment publiée39, nous avons utilisé des échantillons d’aspiration trachéale néonatale obtenus à partir de nouveau-nés intubés dans l’unité de soins intensifs néonatals et avons réussi à isoler et à élargir les cellules épithéliales trachéales néonatales primaires (nTAEC). Nous avons utilisé des inhibiteurs de la signalisation Rho, Smad, Glycogen synthase kinase (GSK3) et de la cible mammalienne de la rapamycine (mTOR) pour augmenter la capacité d’expansion et retarder la sénescence dans ces cellules, comme décrit précédemment39,42, ce qui permet un passage efficace et plus tardif des nTAECs. Le protocole décrit les méthodes d’établissement de cultures ALI 3D à l’aide de nTAECs et d’exposition à l’hyperoxie sur les monocouches de nTAEC. L’inhibition de Rho et Smad est utilisée pendant les 7 premiers jours de la culture de l’ALI (jours 0 à 7 de l’ALI), après quoi ces inhibiteurs sont retirés du milieu de différenciation pour le reste de la durée de la culture de l’ALI. La surface apicale de la monocouche de cellules épithéliales des voies respiratoires cultivée par l’ALI reste exposée à l’environnement43, ce qui permet d’étudier les perturbations atmosphériques et ressemble beaucoup à la pathobiologie d’une voie respiratoire néonatale en développement exposée à l’hyperoxie in vivo. La concentration d’O2 utilisée dans les études antérieures sur les cultures cellulaires (qu’il s’agisse de cellules immortalisées ou primaires) de lésions pulmonaires hyperoxiques néonatales varie considérablement (allant de 40 % à 95 %), de même que la durée de l’exposition (allant de 15 minutes à 10 jours)36,44,45,46,47. Pour cette étude, la monocouche de cellules ALI a été exposée à 60 %d’O2 pendant 7 jours du 7e au 14e jour de l’ALI (après élimination des inhibiteurs de Rho/Smad du milieu de différenciation). L’exposition à l’hyperoxie a été réalisée au cours de la phase précoce-intermédiaire de la différenciation mucociliaire (jours 7 à 14 de l’ALI), par opposition à l’épithélium mature entièrement différencié, et simule ainsi le développement in vivo de l’épithélium des voies respiratoires chez les nouveau-nés prématurés. Cette stratégie d’exposition minimise le risque de toxicité aiguë de l’O2 (qui est attendu avec des concentrations plus élevées d’O2) tout en exerçant un stress oxydatif dans une plage physiologiquement pertinente et ressemble à la fenêtre critique de transition d’un environnement intra-utérin relativement hypoxique à un environnement externe hyperoxique chez les nouveau-nés humains prématurés.

Protocole

Les échantillons néonatals d’aspiration trachéale n’ont été prélevés qu’après le consentement éclairé des parents, et le protocole utilisé pour la collecte, le transport et le stockage a été approuvé par l’Institutional Review Board (IRB) du Centre des sciences de la santé de l’Université de l’Oklahoma (IRB 14377).

1. Préparation à l’isolement, au passage et à la culture ALI de nTAEC

  1. Préparation des milieux
    1. Milieu des voies respiratoires épithéliales bronchiques (BLEAM) avec inhibiteurs (BLEAM-I) : Préparez 500 mL (1 flacon, conservé à 4 °C) de BLEAM en ajoutant 1,25 mL de supplément HLL (500 μg/mL d’albumine sérique humaine, 0,6 μM d’acide linoléique, 0,6 μg/mL de lécithine), 15 mL de L-Glutamine (6 mM), 2 mL d’extrait P (0,4 %, extrait hypophysaire bovin), 5 mL de TM1 (1 μM d’épinéphrine, 5 μg/mL de transferrine, 10 nM de triiodothyronine, 0,1 μg/mL d’hydrocortisone, 5 ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF), 5 ng/mL d’insuline), 1 mL de solution d’antibiotique (Normocin, 0,1 mg/mL). Pour prévenir la sénescence des cellules primaires et améliorer l’efficacité de l’expansion, ajoutez les inhibiteurs du facteur de croissance suivants, comme décrit précédemment39 : Y-27632 (protéine kinase associée à Rho ou inhibiteur de ROCK) avec une concentration finale de 5 μM, A83-01 (inhibe la signalisation Smad) avec une concentration finale de 1 μM, CHIR 99021 (inhibiteur de la glycogène synthase kinase-3 ou inhibiteur de GSK3) avec une concentration finale de 0,4 μM et Rapamycine (inhibiteur de la cible moléculaire de la rapamycine ou mTOR) avec une concentration finale concentration de 5 nM. Filtrez le média à travers un filtre de la taille des pores de 0,22 μm. Reportez-vous au Tableau 1 pour obtenir la liste des composants du support.
    2. Milieu ALI à cellules épithéliales bronchiques/trachéales humaines (HBTEC) : Préparez 500 ml de milieu HBTEC en décongelant le flacon à 37 °C et en ajoutant 1 ml de solution d’antibiotique (Normocin, 0,1 mg/mL). Une fois ajouté, filtrez le média à travers un filtre de la taille d’un pore de 0,22 μm.
    3. Milieu HBTEC avec inhibiteurs (HBTEC-I) : Préparez le milieu HBTEC comme ci-dessus. Avant de filtrer, ajoutez les inhibiteurs suivants : Y-27632 avec une concentration finale de 5 μM et A83-01 avec une concentration finale de 0,5 μM. Filtrez le média à travers un filtre de la taille d’un pore de 0,22 μm.
      REMARQUE : Conservez les milieux BLEAM-I, HBTEC et HBTEC-I à 4 °C, datés et étiquetés, dans l’obscurité (enveloppés dans du papier d’aluminium) et ne réchauffez que les aliquotes de ce qui est nécessaire (la durée de conservation est de 30 jours).
    4. HEPES/FBS : Ajouter 500 mL de solution saline tamponnée HEPES et 88 mL de FBS (la concentration finale est de 15 %). Une fois ajoutée, filtrez la solution à travers un filtre de la taille d’un pore de 0,22 μm et conservez-la à 4 °C, daté et étiqueté.
      REMARQUE : Aliquote et BLEAM CHAUD, HEPES-FBS et Trypsine-EDTA à 37 °C (au moins 30 min) avant utilisation.
  2. Enrobage des flacons de culture et des inserts de culture cellulaire ALI avec un milieu conditionné 804G
    1. Préparez des milieux conditionnés matriciels à base de cellules 804G (lignée de cellules épithéliales de la vessie de rat) comme décrit précédemment39.
    2. Enduire le ballon de culture cellulaire et les inserts de culture cellulaire avec un milieu conditionné 804G pendant au moins 4 h dans l’incubateur à 37 °C, avec 5 % de CO2. Voir le tableau 2 pour connaître les quantités de milieu nécessaires pour enduire les différents flacons de culture et inserts de culture cellulaire.

2. Isolement et expansion des nTAECs et préparation à la culture ultérieure de l’ALI

  1. Prélever une aspiration trachéale fraîche (environ 1 ml) lors de l’aspiration régulière de la sonde endotrachéale des nouveau-nés intubés et recueillir l’aspiration dans un piège à mucus. Si le volume d’aspiration est insuffisant pour atteindre le piège à mucus, rincez le cathéter d’aspiration avec 1 à 3 ml de solution saline stérile.
  2. Étiquetez l’échantillon et rangez-le dans un sac à risque biologique sur de la glace.
    REMARQUE : Les échantillons peuvent être conservés sur de la glace à 4 °C pendant un maximum de 24 h. Cependant, le rendement est plus élevé avec des échantillons frais.
  3. Transporter l’échantillon de l’USIN au laboratoire. Enduire un flacon T25 d’un milieu conditionné au 804G et préparer l’inoculation de l’échantillon au moment du transport de l’aspiration trachéale au laboratoire.
  4. Retirez le piège à mucus du sac à matières biodangereuses et nettoyez soigneusement les surfaces extérieures avec de l’éthanol à 70 % pour éviter toute contamination. Ouvrez avec précaution le capuchon du piège à mucus sous un capot stérile de culture cellulaire.
  5. Diluez l’échantillon d’aspiration trachéale avec du PBS stérile à 5 mL (pour diluer le mucus) et transférez tout le contenu dans un tube conique de 50 mL.
  6. Centrifugez le tube à 250 x g, 20 °C-23 °C pendant 5 min, et jetez le surnageant (y compris le mucus).
    REMARQUE : Toutes les centrifugations ici sont effectuées à 250 x g, 20 °C-23 °C pendant 5 min, sauf indication contraire.
  7. Remettre la pastille en suspension dans 5 mL de BLEAM-I.
  8. Retirez le ballon T25 de l’incubateur et jetez le milieu conditionné 804G avant de plaquer l’échantillon.
  9. Plaquez l’échantillon dans la fiole T25 et placez-le dans l’incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 (on parlera de passage 0 ou P0).
  10. Changez le média avec BLEAM-I 24 h après le placage pour laver les cellules non attachées, puis toutes les 48 h.
    REMARQUE : Après le traitement de l’échantillon d’aspiration trachéale et son incubation dans le milieu BLEAM-I, des cellules de forme cuboïde apparaissent 7 à 10 jours après le placage. Environ 3 semaines après le placage, les cellules sont densément tassées et nécessitent une trypsinisation pour le passage, l’expansion et le stockage ultérieurs. Les cellules à passage précoce (P1 - P2) sont placées dans des cryotubes (2,5 x 106 cellules par 500 μL de milieu de congélation par cryotube) et stockées dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme.
  11. Décongelez rapidement les cellules congelées de l’azote liquide dans un bain d’eau à 37 °C et transférez la suspension cellulaire dans un tube stérile de taille appropriée contenant du BLEAM-I.
  12. Comptez les cellules pour déterminer le nombre total et le nombre de cellules vivantes à l’aide d’un colorant au bleu trypan et d’un compteur de cellules automatisé ou manuel, comme décrit précédemment48. Diluer la suspension cellulaire avec un volume approprié de BLEAM-I, de sorte que la concentration finale soit de 2,1 x 106 cellules dans 15 mL de suspension cellulaire (pour la fiole T75).
    REMARQUE : Pour une fiole T25, on utilise généralement 0,7 x 106 cellules dans 5 mL de suspension cellulaire pour l’ensemencement.
  13. Transvaser la suspension cellulaire de 15 mL dans une fiole T75 et incuber toute la nuit à 37 °C, 5 % de CO2.
  14. Le lendemain matin, échangez le média avec le nouveau BLEAM-I. Ensuite, remplacez le support par un nouveau BLEAM-I tous les 2 jours. Une fois que les cellules sont d’environ 80 à 90 %, elles sont prêtes à être trypsinisées pour la culture ALI.
  15. Appliquer 5 mL de trypsine-EDTA (T75) sur la monocouche cellulaire.
    REMARQUE : N’oubliez pas d’utiliser de la trypsine fraîche. Évitez d’utiliser de la trypsine qui a été chauffée plusieurs fois.
  16. Incuber le ballon à 37 °C pendant 5 min dans l’incubateur. Ensuite, tapotez le côté de la fiole 8x-10x pour déloger les cellules. Vérifiez au microscope pour confirmer que les cellules ont été délogées après la trypsinisation. Si >50 % des cellules restent sur le ballon, laver avec du PBS 2x et répéter l’étape de trypsinisation avec un temps d’incubation réduit de 2 à 3 minutes.
  17. Arrêtez la réaction avec 15 ml de HEPES-FBS et pipetez de haut en bas 4x-5x. Transférez les cellules dans un tube stérile de taille appropriée et centrifugez à 250 x g pendant 5 min pour granuler les cellules.
  18. Après la centrifugation, aspirez soigneusement le surnageant. Dissoudre la pastille cellulaire dans 1 mL de BLEAM-I en pipetant doucement de haut en bas 5x-10x.
  19. Comptez les cellules pour déterminer le nombre total et le nombre de cellules vivantes. Diluer la suspension cellulaire avec un volume approprié de BLEAM-I, de sorte que la concentration finale soit de 1 x 105 cellules vivantes pour 100 μl de suspension cellulaire.

3. Culture ALI des nTAEC

REMARQUE : Les inserts de culture cellulaire doivent être recouverts d’un milieu conditionné au 804G et incubés pendant au moins 4 h à 37 °C, 5 % de CO2 avant l’étape suivante (voir étape 1.2).

  1. Retirez de l’incubateur la ou les plaques de culture cellulaire à 24 puits contenant les inserts de culture cellulaire et jetez le milieu conditionné au 804G.
  2. Ajouter 1 mL de BLEAM-I dans la chambre basolatérale (inférieure) de chaque puits ALI. Ajouter 100 μL de suspension cellulaire (1 x 105 cellules) dans la chambre apicale des inserts de culture cellulaire ALI et incuber les cellules à 37 °C, 5 % CO2. Cette étape est définie comme le jour ALI -2.
  3. Le lendemain, changer le milieu dans les chambres basolatérale (1 mL) et apicale (100 μL) avec du BLEAM-I frais. Lors du changement de média dans la chambre apicale, veillez à ne pas perturber la monocouche cellulaire. Cette étape est définie comme le jour ALI -1.
  4. Le lendemain, retirez le milieu des chambres basolatérale et apicale.
    REMARQUE : Il faut 2 jours pour que les cellules de la membrane de culture cellulaire deviennent confluentes dans des conditions immergées. À ce stade, l’ALI peut être établie.
  5. Ajouter 1 mL de média HBTEC-I dans la chambre basolatérale, mais laisser le média de la chambre apicale libre et exposé à l’air. Cette étape est définie comme le jour 0 de l’ALI.
  6. Continuez à remplacer le milieu HBTEC-I (1 ml) dans la chambre basolatérale toutes les 48 heures du jour 0 à 6 de l’ALI. Passer à un substrat HBTEC régulier (sans inhibiteurs) le jour 7 de l’ALI jusqu’au moment désiré de la récolte.
    REMARQUE : Au cours des 7 premiers jours de la culture de l’ALI, les milieux de la chambre basolatérale peuvent s’infiltrer dans la chambre apicale. Ce milieu doit être aspiré soigneusement chaque jour pour maintenir la santé de la couche cellulaire et lui permettre de se différencier.
  7. Récoltez des cellules, des inserts de culture cellulaire et des milieux basolatéraux à différents moments pour des techniques moléculaires, des tests et des analyses.
    1. Pour ce protocole, les jours 0, 7 et 28 de l’ALI, récolter des cellules pour l’analyse de l’expression génique qPCR (protocole standard du fabricant) des marqueurs de différenciation épithéliale. Les jours 0, 7, 14 et 28 de l’ALI, prélever des inserts de culture cellulaire pour tester la fonction barrière (méthodes décrites ci-dessous).
    2. Les jours 0 et 28 de l’ALI, utiliser des inserts de culture cellulaire fixés au formol pour la coloration immunofluorescente avec des marqueurs de différenciation épithéliale (en utilisant le protocole précédemment publié)49. Le 14e jour de l’ALI, récolter les milieux basolatéraux pour la libération de lactate déshydrogénase (LDH) (protocole standard du fabricant), les lysats cellulaires pour la qPCR des marqueurs de stress oxydatif, l’immunotransfert avec des anticorps caspase-3 et la caspase-3 clivée (protocole standard du fabricant), et des inserts de culture cellulaire pour le dosage du stress oxydatif (méthode décrite ci-dessous).

4. Test de la fonction barrière lors de la différenciation ALI

  1. Mesure de la résistance électrique trans-épithéliale (TEER)
    REMARQUE : Mesurer TEER à l’aide d’un voltmètre/ohmmètre épithélial (EVOM) pendant la différenciation ALI pour évaluer l’intégrité de la couche cellulaire50.
    1. Avant de mesurer les valeurs de résistance du filtre de test, utilisez une culture cellulaire enrobée d’un média conditionné 804G (dépourvue de toute cellule) pour mesurer la valeur de résistance de fond en Ohms (Ω)
    2. Soustrayez la valeur de résistance de fond des valeurs de résistance du filtre d’essai et multipliez la différence par la surface de croissance cellulaire pour obtenir la valeur TEER pour chaque filtre d’essai.
      FEER = (ΩT - ΩB) X C
      TEER = Résistance électrique trans-épithéliale (Ω,cm2)
      ΩT = Valeur de résistance du filtre d’essai (Ω)
      ΩB = Valeur de résistance d’arrière-plan (Ω)
      C = Surface de croissance cellulaire (cm2)
      REMARQUE : Les inserts de culture cellulaire utilisés pour les mesures TEER sont ensuite fixés avec du formol tamponné à 10 % et utilisés immédiatement pour la coloration immunofluorescente et la microscopie fluorescente (méthode décrite ci-dessous) ou stockés à 4 °C pour une coloration ultérieure.
  2. Dosage de la perméabilité épithéliale de l’iséthionate de fluorescéine dextran (FITC-dextran)
    REMARQUE : Le test de perméabilité épithéliale a été réalisé en utilisant deux poids moléculaires différents de FITC-dextran (10 kD et 20 kD) lors de la différenciation ALI.
    1. Préparez la solution de travail FITC-dextran (1 mg/mL) : mesurez 5 mg de FITC et mélangez 1 mL de DMSO (5 mg/mL). Mettre à nouveau en suspension 5 mg/mL dans un milieu HBTEC chauffé à 37 °C à une concentration de 1 mg/mL. Protégez la solution de la lumière.
    2. Transférez les filtres d’essai (contenant des cellules) dans une nouvelle plaque à 12 puits et ajoutez 1 mL de média HBTEC dans le compartiment basolatéral.
    3. Aspirer le milieu du compartiment apical (le cas échéant) et le remplacer par 250 μL de solution de travail FITC-dextran. Incuber à température ambiante à l’abri de la lumière pendant 60 min.
    4. Terminez le test FITC-dextran en retirant les filtres d’essai (contenant la solution de travail FITC-dextran) de la plaque à 12 puits.
    5. Prélever le milieu basolatéral de la plaque à 12 puits dans des tubes de microcentrifugation de 1,5 mL et un vortex.
    6. Transférez 100 μL d’aliquotes de chaque tube dans une microplaque de polystyrène noir à fond transparent de 96 puits en trois exemplaires. Transférez 100 μL de milieu HBTEC vers des puits supplémentaires dans la plaque de 96 puits comme contrôle négatif pour mesurer la fluorescence de fond.
    7. Mesurez l’intensité de la fluorescence à l’aide d’un spectrophotomètre en utilisant des maxima d’excitation de 490 nm et d’émission de 520 nm.
    8. Soustraire la valeur moyenne de fluorescence de fond des valeurs de fluorescence du filtre d’essai pour obtenir la fluorescence corrigée et exprimer les valeurs en pourcentage par rapport aux valeurs de fluorescence corrigées au jour 0 de l’ALI pour les CTFI de 10 kD et 20 kD.

5. Exposition à l’hyperoxie à l’aide de l’incubateur TriGas

  1. Le jour 7 de l’ALI, déterminer le nombre d’inserts de culture cellulaire à mettre en hyperoxie en fonction des besoins expérimentaux et de récolte.
  2. Réglez le niveau O2 dans l’incubateur TriGas à 60 % O2. Il faut généralement ~30-45 min pour que le niveau O2 atteigne 60 %.
  3. Une fois que le niveau O2 se stabilise à 60 %, placez la plaque de culture cellulaire à 24 puits avec les inserts de culture cellulaire attribués au groupe d’hyperoxie à l’intérieur de l’incubateur et fermez la porte de l’incubateur.
    REMARQUE : Cette étape doit être réalisée le plus efficacement possible pour éviter une baisse significative du niveau de O2 à l’intérieur de l’incubateur.
  4. Changer le milieu dans les inserts de culture cellulaire exposés à l’hyperoxie en suivant le même schéma que les puits témoins (21 % d’O2 exposés). Vérifiez tous les jours que les inserts de culture cellulaire ne présentent pas de fuite et aspirez doucement toute fuite dans la chambre de culture cellulaire.
  5. Poursuivre l’exposition à l’hyperoxie pendant 7 jours (jours 7 à 14 de l’ALI). Une fois l’exposition à l’hyperoxie terminée, prélever des cellules ou effectuer des tests à l’aide d’inserts de culture cellulaire le 14e jour de l’ALI.

6. Test de stress oxydatif pour évaluer les effets de l’hyperoxie

REMARQUE : Nous avons utilisé le kit de dosage CM-H2DCFDA et mesuré l’intensité de la fluorescence le jour 14 de l’ALI comme marqueur du stress oxydatif dans les inserts de culture cellulaire après une exposition à l’O2 . H2DCFDA est une forme chimiquement réduite et acétylée de 2′,7′-dichlorofluorescéine (DCF) qui est un indicateur d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) perméé dans les cellules vivantes. CM-H2DCFDA est le dérivé chlorométhyle thiol-réactif de H2DCFDA, qui favorise une liaison covalente supplémentaire aux composants intracellulaires, permettant une rétention plus longue du colorant dans la cellule. Ces molécules ne sont pas fluorescentes jusqu’à ce que les groupes acétate soient éliminés par l’action des estérases intracellulaires, et l’oxydation se produit dans la cellule51. Après l’oxydation intracellulaire, l’augmentation résultante de la fluorescence peut être mesurée avec un microscope fluorescent comme mesure de substitution du stress oxydatif cellulaire52. Le réactif est léger et sensible à l’air et doit donc être protégé de la lumière et maintenu étanche à l’air dans la mesure du possible.

  1. Préparation de la solution de dosage CM-H2DCFDA : Chaque flacon contient 50 μg de colorant réactif sous forme de poudre. Pour obtenir une solution mère de 1 mM, ajoutez 80 μL de DMSO stérile dans le flacon, mélangez bien à l’aide d’une pipette et agitez doucement. Pour une concentration finale de 1 μM du colorant dans les inserts de culture cellulaire, ajouter 0,1 μL de la substance mère de 1 mM par 100 μL de PBS (p. ex., ajouter 0,6 μL de solution mère à 600 μL de PBS pour 6 inserts de culture cellulaire).
    REMARQUE : La concentration finale du colorant peut varier entre 1 et 5 μM. La dose doit être optimisée pour chaque condition de culture.
  2. Ajouter 100 μL de la solution de colorant 1 μM dans chaque culture cellulaire pour le groupe exposé à l’hyperoxie ou à la normoxie. Utiliser au moins 1 culture cellulaire comme témoin négatif de chaque groupe de traitement (100 μL de PBS sans colorant). Incuber à 37 °C pendant 30 min, à l’abri de la lumière. Laver 1x avec du PBS.
  3. Préparation des lames : Égouttez tout excès de PBS. Tenez soigneusement les inserts de culture cellulaire et utilisez une lame pour découper lentement la membrane de culture cellulaire. Versez 1 à 2 gouttes de liquide de montage sur la lame. À l’aide d’une pince à bout plat, tenez soigneusement le coin de la membrane, placez-le côté cellulaire vers le bas sur le support et couvrez-le avec une lamelle. Retirez l’excès de liquide de montage et laissez sécher à l’air libre pendant 15 minutes à température ambiante à l’abri de la lumière. Les diapositives sont maintenant prêtes à être numérisées.
    REMARQUE : La préparation de la lame et la microscopie fluorescente doivent être effectuées aussi rapidement que possible car l’intensité fluorescente diminue considérablement en 2-3 h.
  4. Microscopie fluorescente : Capturez des images à l’aide d’un microscope à fluorescence en utilisant le canal Cy2 (cyanine-2). Capturez des images à partir de trois zones distinctes et non superposées par culture cellulaire.
  5. Détection fluorescente du stress oxydatif
    REMARQUE : Utilisez les images de la microscopie fluorescente pour mesurer la fluorescence totale corrigée (CTCF) à l’aide du logiciel ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/) et du flux de travail décrit ci-dessous. Le CTCF sert de marqueur du stress oxydatif dans les inserts de culture cellulaire après une exposition à l’hyperoxie et est mesuré en éliminant la fluorescence de fond à l’aide du logiciel ImageJ.
    1. Ouvrez l’image de microscopie dans ImageJ et sélectionnez la zone d’intérêt à l’aide de l’outil rectangle. Enregistrez la zone de sélection (α) en cliquant avec le bouton droit de la souris et sélectionnez Ajouter au gestionnaire de retour sur investissement (région d’intérêt). Utilisez cette zone de sélection sur toutes les images.
    2. Sélectionnez les paramètres de mesure sous Analyser > Définir les mesures , puis sélectionnez Surface, Densité intégrée et Valeur de gris moyenne dans l’onglet Paramètres.
    3. Pour chaque image, utilisez la même zone de sélection dans le gestionnaire de retour sur investissement et sélectionnez Analyser > mesurer. La valeur de la densité intégrée représente la fluorescence totale (Ft) de la zone sélectionnée. Notez les valeurs de mesure dans la fenêtre contextuelle.
    4. Pour corriger la fluorescence d’arrière-plan (Fb) dans chaque image, sélectionnez une petite zone de région non fluorescente à l’aide de l’outil rectangle. Sélectionnez Analyser > mesurer pour cette région. La valeur moyenne de l’intensité représente F,b. Notez les valeurs de mesure dans la fenêtre contextuelle.
    5. Calculez le CTCF en multipliant l’intensité moyenne de fluorescence des lectures de fond par la surface totale du retour d’intérêt et en soustrayant ce nombre de la valeur de densité intégrée du point d’intérêt. Répétez ce flux de travail pour toutes les images des deux groupes de traitement (Contrôle et Hyperoxie).
      CTCF = Ft - (Fb x α)
      CTCF = Fluorescence cellulaire totale corrigée (U.A.)
      Ft = Fluorescence totale
      Fb = Fluorescence de fond
      α = Zone de sélection

Résultats

Pour isoler les nTAEC, nous avons prélevé des aspirations trachéales de nouveau-nés intubés dans l’unité de soins intensifs néonatals et les avons transportées sur de la glace jusqu’au laboratoire pour un traitement ultérieur (figure 1A). Après l’ensemencement des échantillons d’aspiration trachéale dans un milieu de croissance épithéliale des voies respiratoires (BLEAM-I contenant des inhibiteurs de Rho/Smad, GSK3 et mTOR), les cellules cuboïdes sont apparues en 7 à 10 jours. Au bout de 14 jours, les cellules étaient confluentes à 50 % à 60 %, et environ 21 jours après le placage, les cellules étaient densément tassées et nécessitaient une trypsinisation pour le passage et l’expansion ultérieurs. Des passages en série de ces cellules (jusqu’à P3) ont été cryoconservés dans de l’azote liquide pour un stockage à long terme. Les cellules (≤ passage 3) ont ensuite été décongelées pour la culture ALI.

Les nTAEC ont été cultivés en ALI une fois qu’ils ont atteint une confluence d’environ 80 % à 90 % dans une plaque T75 dans des conditions immergées. Nous avons effectué une coloration par immunofluorescence de la monocouche nTAEC le jour 0 de l’ALI avec les marqueurs spécifiques des cellules basales - cytokératine-5 (KRT5)53 et protéine tumorale p63 (TP63)54 (Figure 1B). Au jour 0 de l’ALI, presque toutes les cellules sont positives pour KRT5 et TP63, ce qui suggère un phénotype de cellules basales des voies respiratoires avec une différenciation minimale. Après l’établissement de l’ALI, le TEER a été mesuré à l’aide de l’EVOM (figure 1C) et a rapidement augmenté dans la phase précoce de la culture de l’ALI (jour 0 à 7 de l’ALI) lorsque les nTAECs ont commencé à former une monocouche de cellules polarisées matures, avec un plafonnement ultérieur du TEER entre le jour 7 et le jour 28 de l’ALI (figure 1D). De plus, le FITC-dextran de deux poids moléculaires (10 kD et 20 kD) a été utilisé pour évaluer la perméabilité paracellulaire pendant la différenciation ALI et a montré une diminution progressive globale de la fluorescence au fil du temps (Figure 1E). Ceci est corrélé à la formation d’une cellule mature monocouche pendant la différenciation ALI avec une perméabilité décroissante aux solutés. 

Au cours de la culture ALI, les cellules basales se différencient en lignées épithéliales matures, qui comprennent des cellules ciliées, des cellules club non sécrétrices de mucus et des cellules caliciformes sécrétant du mucus39. L’analyse de l’expression génique de marqueurs spécifiques des cellules épithéliales matures au jour 0 de l’ALI a montré une expression minimale ou nulle de la protéine J155 (FOXJ1, marqueur de cellules ciliées), de l’utéroglobine56 (SCGB1A1, marqueur de cellules de club) et de la mucine-5AC57 (MUC5AC, marqueur de cellules caliciformes ; Figure 2A), avec une augmentation ultérieure (jours 7 et 28 de l’ALI) suggérant une différenciation en ces sous-types épithéliales matures des voies respiratoires au cours de la culture ALI. De plus, nous avons effectué une coloration immunofluorescente le jour 28 de l’ALI à l’aide de marqueurs spécifiques des cellules épithéliales matures et d’une différenciation épithéliale quantifiée composée de cellules ciliées positives à la tubulineacétylée 58 (TUBA4A) (~22 %), de cellules de club SCGB1A1 positives (~13 %) et de cellules caliciformes positives à MUC5AC (~3 %), le reste étant des cellules basales positives à KRT5 (~51 %) et d’autres types de cellules rares (Figure 2B).

Des inhibiteurs de Rho et de Smad ont été utilisés pendant les 7 premiers jours de la culture de l’ALI (jours 0 à 7 de l’ALI), puis retirés du milieu de différenciation pendant le reste de la durée de la culture de l’ALI (figure 3A). La surface apicale de la monocouche cellulaire pendant la culture ALI est exposée à l’air, ce qui permet d’étudier les perturbations atmosphériques. L’exposition à l’hyperoxie de la monocouche cellulaire a été réalisée avec 60 % d’O2 en continu pendant 7 jours du 7e au 14e jour ALI à l’aide de l’incubateur TriGas. Le groupe témoin a été maintenu dans un incubateur séparé avec une exposition à l’air ambiant (21 % d’O2). Étant donné l’intention future d’étudier les conséquences à long terme (1 à 2 semaines après la fin de l’exposition à l’O2) de l’exposition à l’O2 sur le développement et la régénération de l’épithélium des voies respiratoires, il était essentiel que l’exposition à l’O2 n’entraîne pas de cytotoxicité grave ou de lésions membranaires au point de perturber de manière significative la monocouche de cellules ALI. Pour évaluer les lésions de la membrane cellulaire, nous avons mesuré la libération de LDH dans le milieu basolatéral au jour 14 de l’ALI, qui n’a montré aucune différence significative entre l’hyperoxie et les cultures traitées à l’air ambiant (Figure 3B). Pour évaluer plus en détail si les effets cytotoxiques de l’O2 étaient suffisamment significatifs pour induire l’apoptose dans les nTAEC, nous avons effectué un immunotransfert pour la caspase-3 totale et la caspase-359 clivée sur des lysats cellulaires récoltés dans des groupes exposés à l’hyperoxie et à l’air ambiant le jour 14 de l’ALI (Figure 3C). L’expression totale de la caspase-3 était comparable entre les deux groupes, et l’expression de la caspase-3 clivée n’a pas été détectée, ce qui suggère que 7 jours d’exposition à 60 % d’O2 n’ont pas induit d’apoptose dans les nTAEC le 14e jour de l’ALI. De plus, un témoin positif a été conçu avec l’incubation nocturne de nTAEC dans des conditions immergées avec des concentrations croissantes de staurosporine (0,5 μM, 1 μM et 2 μM), un agent cytotoxique et un inducteur d’apoptose. L’immunotransfert pour l’expression totale de la caspase-3 et de la caspase-3 clivée a confirmé l’induction réussie de l’apoptose. Pour mesurer le stress oxydatif induit par une exposition à 60 % d’O2, un test de stress oxydatif cellulaire avec mesure de l’intensité fluorescente a été effectué sur les monocouches de cellules nTAEC sur ALI 14 (Figure 3D). L’exposition à l’hyperoxie a provoqué une augmentation significative de l’intensité de la fluorescence (calculée par fluorescence cellulaire totale corrigée ou CTCF) par rapport aux cellules exposées à l’air ambiant, suggérant une augmentation du stress oxydatif cellulaire. L’analyse de l’expression génique des gènes antioxydants a montré que 60 % d’O2 provoquait une régulation positive de ces gènes antioxydants le jour 14 de l’ALI, la catalase, la SOD1, la SOD2 et la GPX3 étant significativement régulées à la hausse (Figure 3E).

figure-results-1
Figure 1 : Les cellules épithéliales des voies respiratoires trachéales néonatales (nTAEC) sont isolées avec succès à partir d’aspirations trachéales néonatales et cultivées à l’interface air-liquide (ALI). (A) Les nTAECs isolés à l’aide de l’aspiration trachéale de nouveau-nés intubés ont été passés à l’état immergé avec une culture ALI ultérieure. (B) Les cellules ont été récoltées le jour 0 de l’ALI pour une coloration immunofluorescente avec des marqueurs de cellules basales des voies respiratoires - KRT5 (rouge) et TP63 (rouge). Les noyaux sont colorés en bleu avec du DAPI. Barre d’échelle = 50 μm. (C) Mesure de la résistance électrique trans-épithéliale (TEER) dans des inserts de culture cellulaire à l’aide d’un voltmètre/ohmmètre épithélial (EVOM). (D) Le TEER a été mesuré lors de la différenciation de l’ALI. Données présentées sous forme de moyenne (n = 2 donateurs, 5 à 10 puits par donneur et par point temporel). (E) Un test de perméabilité trans-épithéliale de l’isothiocyanate-dextran de fluorescéine (FITC-dextran) a été effectué lors de la différenciation ALI en utilisant deux poids moléculaires différents de FITC-dextran (10 kD et 20 kD). Une solution de FITC-dextran (10 kD ou 20 kD) a été ajoutée à la chambre apicale et les inserts de culture cellulaire ont été incubés à température ambiante pendant 60 min. La fluorescence dans le milieu de la chambre basolatérale a été mesurée par spectrophotométrie dans des plaques à 96 puits. La fluorescence de fond (milieu HBTEC) a été soustraite des mesures d’essai pour obtenir une valeur de fluorescence corrigée (exprimée en pourcentage par rapport aux valeurs du jour 0). Les données sont présentées sous forme de moyenne (n = 2 donneurs, trois puits par donneur et par point temporel pour chaque poids moléculaire de FITC-dextran). Les barres d’erreur indiquent SEM. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Les cellules épithéliales des voies respiratoires trachéales néonatales (nTAEC) subissent une différenciation mucociliaire lors de la culture de l’interface air-liquide (ALI). (A) Les cellules ont été prélevées aux jours 0, 7 et 28 de l’ALI pour l’analyse qPCR de marqueurs spécifiques des cellules épithéliales : cytokératine-5 (KRT5) pour la protéine basale, protéine de boîte à tête fourchue J1 (FOXJ1) pour les cellules ciliées, utéroglobine (SCGB1A1) pour le club et mucine-5AC (MUC5AC) pour les cellules caliciformes. L’expression relative de chaque gène a été déterminée à l’aide de la méthode δCt avec GAPDH comme contrôle endogène. Données présentées sous forme de moyenne (de n = 3 donneurs, trois puits par donneur et par point temporel). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide de l’ANOVA à deux facteurs avec l’analyse post-hoc de Tukey, *p=0,0114, ***p=0,0005, ***p<0,0001. (B) Une coloration immunofluorescente des cellules basales (KRT5, rouge), ciliées (tubuline acétylée ou TUBA4A, verte), massue (SCGB1A1, rouge) et caliciforme (MUC5AC, verte) a été réalisée au jour 28 de l’ALI pour quantifier la différenciation épithéliale. Les noyaux sont colorés en bleu avec du DAPI. Les données pour le pourcentage ( %) de cellules positives sont présentées sous forme de moyenne (n = 2 donneurs, deux inserts de culture cellulaire par donneur, 6 à 8 images non chevauchantes par lame, minimum de 3000 cellules comptées par lame). Les barres d’erreur indiquent SEM. Barre d’échelle = 50 μm.  Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : L’hyperoxie induit un stress oxydatif cellulaire dans les cellules épithéliales des voies respiratoires trachéales néonatales (nTAEC) mais ne provoque pas de lésions significatives de la membrane cellulaire ni d’apoptose. (A) Chronologie expérimentale de l’exposition à l’hyperoxie des nTAECs à l’aide de l’incubateur Trigas. L’exposition à l’oxygène a commencé après que les inhibiteurs ont été retirés des milieux de différenciation le jour 7 de l’ALI et s’est poursuivie pendant 7 jours (jours 7 à 14 de l’ALI). (B) Un milieu basolatéral a été prélevé pour un essai de libération de LDH afin d’évaluer les dommages à la membrane cellulaire entre l’air ambiant (témoin) et le groupe exposé à 60 % d’O2 (hyperoxie) le jour 14 de l’ALI. Les données sont présentées sous forme de points de données individuels (absorbance corrigée) avec des lignes indiquant la moyenne générale pour chaque groupe, n = 3 donneurs indiqués par des cercles noirs, des carrés et des triangles avec quatre puits par donneur, respectivement. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test t non apparié, p = 0,6184. (C) Les cellules ont été récoltées le jour 14 de l’ALI, et l’immunotransfert pour les marqueurs de l’apoptose (caspase-3 et caspase-3 clivée) a été effectué pour comparer les réponses entre l’air ambiant et les nTAEC exposés à l’O2. Le contrôle positif de l’essai a été conçu en incubant des nTAEC pendant la nuit avec de la staurosporine (Stau 0,5 μM, 1 μM et 2 μM) ou un témoin véhicule (Veh Ctrl) dans des conditions de culture submergée. Des cellules ont été prélevées pour l’immunotransfert avec des anticorps totaux de caspase-3 et des anticorps caspase-3 clivés. La densitométrie a été réalisée avec de la α-tubuline comme gène d’entretien ménager. Données présentées sous forme de moyenne (n=2-3 donneurs, un à deux puits par donneur). Les barres d’erreur indiquent SEM. Un test t non apparié a été utilisé pour comparer l’expression totale de la caspase-3 entre l’air ambiant et le groupe O2 à 60 %, p = 0,4. L’ANOVA à un facteur a été utilisée pour comparer l’expression totale de la caspase-3 et de la caspase-3 clivée entre les groupes exposés Veh Ctrl et Stau, *p<0,05, ***p<0,0005. (D) Un dosage CM-H2DCFDA pour le stress oxydatif cellulaire a été effectué le jour 14 de l’ALI avec des inserts de culture cellulaire prélevés dans l’air ambiant et des nTAEC exposés à l’O2. Des images représentatives de la microscopie fluorescente d’inserts de culture cellulaire exposés à l’air ambiant (contrôle) et à 60 % d’O2 (hyperoxie) sont présentées. La fluorescence cellulaire totale corrigée (CTCF) a été calculée pour comparer le stress oxydatif cellulaire entre l’air ambiant et les nTAEC exposés à 60 % d’O2. Les données CTCF sont présentées sous forme de points de données individuels avec une ligne indiquant la moyenne générale pour chaque groupe, 6-7 images/groupe provenant de 2 donneurs individuels (cercles et carrés noirs) avec deux puits par donneur. L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test t non apparié, *p<0,05. Barre d’échelle = 50 μm. (E) Les cellules ont été prélevées le jour 14 de l’ALI dans l’air ambiant, et des puits exposés à l’hyperoxie pour l’analyse qPCR des gènes de stress oxydatif, y compris la catalase, la superoxyde dismutase 1 et 2 (SOD1 et SOD2), la glutathion peroxydase 1, 2 et 3 (GPX1, GPX2 et GPX3) a été effectuée. Les données de changement de pli de chaque gène ont été déterminées à l’aide de la méthode δCt avec l’ARNr 18s comme contrôle endogène. Données présentées sous forme de moyenne (de n = 3 donneurs, deux puits par donneur). L’analyse statistique a été effectuée à l’aide d’un test t non apparié, *p<0,05, **p=0,006.  Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Composant multimédiaQuantitéConcentration finale
BLEAM-I
Médias BLEAM500 ml
Supplément HLL1,25 mL500 μg/mL d’albumine sérique humaine
0,6 μM Acide linoléique ; 0,6 μg/mL de lécithine
L-Glutamine15 ml6 millions d’euros
Extrait P2 mL0,4 % d’extrait hypophysaire bovin
TM15 mL1 μM d’épinéphrine ; 5 μg/mL de transferrine
10 nM de triiodothyronine ; 0,1 μg/mL d’hydrocortisone
5ng/mL de facteur de croissance épidermique (EGF)
5 ng/mL d’insuline
Normocin1 mL0,1 mg/mL
Y-27632Peut varier en fonction du numéro de lot5 μM
N° A83-01Peut varier en fonction du numéro de lot1 μM
RÉF. CHIR 99021Peut varier en fonction du numéro de lot0,4 μM
RapamycinePeut varier en fonction du numéro de lot5 nM
HBTEC
Médias HBTEC500 ml
Normocin1 mL0,1 mg/mL
HBTEC-I
Médias HBTEC500 ml
Normocin1 mL0,1 mg/mL
Y-27632Peut varier en fonction du numéro de lot5 μM
N° A83-01Peut varier en fonction du numéro de lot0,5 μM

Tableau 1 : Composants des milieux pour les milieux des voies respiratoires épithéliales bronchiques avec inhibiteurs (BLEAM-I), les milieux ALI des cellules épithéliales bronchiques/trachéales humaines avec inhibiteurs (HBTEC-I) et les HBTEC.

Fiole de culture cellulaire/inserts de culture cellulaireSupports conditionnés par cellules 804G (mL)
Fiole T253 ml
Fiole T755 mL
Insert de culture cellulaire à 24 puits (taille des pores de 0,4 μm, surface de 0,33 cm2 )400 μL

Tableau 2 : Volumes de milieux conditionnés par matrice dérivée de cellules 804G nécessaires pour les flacons de culture et les inserts de culture cellulaire.

Discussion

Le protocole décrit ici détaille une méthode de collecte et de traitement d’échantillons d’aspiration trachéale néonatale de nouveau-nés intubés dans l’unité de soins intensifs néonatals, avec isolement et expansion ultérieurs de nTAECs vivants à partir de ces échantillons à l’aide de méthodes précédemment établies39. De plus, nous avons décrit une méthode pour cultiver des nTAEC sur l’ALI et caractériser leur différenciation en un épithélium des voies respiratoires mucociliaire polarisé en fonction du temps par mesure de TEER, dosage FITC-dextran, coloration immunofluorescente et analyse qPCR de marqueurs spécifiques du type cellulaire (c’est-à-dire basal, cilié, massue et gobelette). L’aspect nouveau de ce protocole est la perturbation redox atmosphérique réalisée par une exposition modérée à l’hyperoxie (60 % O2) sur des monocouches de nTAEC en développement. Nous avons montré qu’une exposition à 60 %d’Io2 pendant 7 jours induit un stress oxydatif cellulaire dans les nTAECs. Nous montrons en outre que la stratégie d’exposition à l’O2 n’induit pas de manière aiguë une apoptose cellulaire significative ou des dommages à la membrane cellulaire, ce qui permet le maintien de ces nTAEC dans la culture de l’ALI au-delà du moment de la fin de l’exposition à l’O2 . Ainsi, le modèle peut potentiellement être utilisé pour étudier les effets à court et à long terme de l’exposition à l’O2 sur la programmation épithéliale des voies respiratoires néonatales.

La culture de nTAEC dans l’ALI confère certains avantages par rapport à la culture submergée conventionnelle car elle favorise la formation d’une monocouche épithéliale polarisée des voies respiratoires avec formation de jonctions serrées et différenciation mucociliaire60,61. Des études antérieures avec des nTAECs ont montré que dans la phase précoce de la culture ALI (jours 0 à 7 de l’ALI), les cellules subissent une pseudo-stratification (apparaissant comme multicouches par opposition à une seule couche cellulaire) et forment finalement un épithélium pseudostratifié mature à la fin de la deuxième semaine42,62. La formation de jonctions serrées suit une trajectoire similaire dans la phase précoce de la culture de l’ALI, accompagnée d’une augmentation rapide de la TEER avec un plateau ultérieur de63, démontré dans le modèle avec des nTAEC. De plus, les cellules épithéliales des voies respiratoires cultivées dans l’ALI améliorent l’expression et la localisation apico-latérale de la claudine-1 (un composant du complexe de jonctions serrées), ce qui augmente les propriétés d’étanchéité des jonctions serrées pendant la culture de l’ALI, favorisant la formation d’une monocouche cellulaire mature63. Cela est corrélé à une diminution de la perméabilité paracellulaire, qui a été testée dans le modèle avec le dosage FITC-dextran et a démontré une tendance généralement à la baisse de la perméabilité monocouche. Nous avons délimité le modèle de différenciation mucociliaire dans les nTAECs avec immunomarquage pour les marqueurs spécifiques des cellules ciliées (TUBA4A), de massue (SCGB1A1) et de gobelet (MUC5AC) au jour 28 de l’ALI. De plus, nous avons effectué l’expression génique de marqueurs spécifiques aux cellules ciliées (FOXJ1), de club (SCGB1A1) et caliciformes (MUC5AC) au cours de l’évolution temporelle de l’ALI. D’autres groupes ont montré que le facteur de transcription FOXJ1 est essentiel à la ciliogenèse mobile, tandis que TUBA4A est présent dans les cils primaires et mobiles64,65. Dans ce modèle, le profil d’expression génique de FOXJ1 lors de la différenciation ALI des nTAECs est grossièrement corrélé avec le moment d’apparition des cils mobiles dans la culture épithéliale des voies respiratoires d’études antérieures64,66.

Une étude récente de Teape et al. a évalué les effets protéomiques et métabolomiques de l’exposition à l’hyperoxie sur la culture de l’ALI67. Cependant, les cellules ont été dérivées de donneurs adultes. Des études antérieures sur le virus respiratoire syncytial (VRS)62,68,69,70 et la récente pandémie de COVID-1971 ont mis en évidence l’importance des différences liées à l’âge dans la réponse et la fonction épithéliales des voies respiratoires. Zhao et al. ont utilisé des flux de travail similaires pour isoler les cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales et adultes et ont montré qu’après 21 jours de différenciation de l’ALI, il n’y avait pas de différences significatives dans la composition cellulaire entre les cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales etadultes62. Cependant, il y avait des différences distinctes dans leur réponse à l’infection par le VRS, les cellules néonatales montrant plus de cellules infectées par le VRS et de lésions épithéliales par rapport aux adultes. En général, les conditions de culture utilisées par Zhao et al. ont produit une différenciation plus robuste dans les nTAECs par rapport aux nôtres, avec un nombre plus élevé de cellules ciliées (41 % contre 22 %) et gobelettes (10 % contre 3 %). Ces différences pourraient être attribuées à l’utilisation de milieux de croissance différents. Il a été démontré que le milieu PneumaCult-ALI utilisé par leur groupe (par opposition au milieu HBTEC-ALI) induit une différenciation plus robuste avec un nombre plus élevé de cellules ciliées et caliciformes72. Dans ce modèle, l’expression génique de marqueurs spécifiques du type cellulaire pour les cellules ciliées, en massue et en gobelet a montré une augmentation rapide initiale (jour 0 à 7 de l’ALI) avec une diminution ultérieure vers le 28e jour de l’ALI. Une raison possible pourrait être le plafonnement de la différenciation après le jour 14 de l’ALI, qui a été démontré dans des études antérieures avec des nTAECs42.

Nous avons décrit l’utilisation d’une hyperoxie modérée (60 % d’O2) pendant 7 jours, ce qui, selon nous, simule plus étroitement les expériences réelles des nouveau-nés prématurés dans l’unité de soins intensifs néonatals par rapport à l’utilisation de niveaux très élevés d’O2 (> 80 % d’O2)67 où le risque de toxicité aiguë de l’O2 est augmenté1, 5. Planche à billets En effet, il a été démontré que l’exposition à 95 % de l’O2 du tissu pulmonaire du nouveau-né induit l’apoptose cellulaire par l’activation de la caspase73. Cependant, cette stratégie d’exposition n’est pertinente que chez un faible pourcentage de bébés de l’unité de soins intensifs néonatals qui, à la suite de l’insuffisance pulmonaire aiguë induite par l’O2, développent une DBP sévère avec des pathologies bronchiques chroniques (modèle de lésions pulmonaires aiguës)37. À l’ère moderne de l’utilisation judicieuse de la thérapie O2, la plupart des bébés prématurés ne sont pas exposés à un O2 aussi élevé ; Cependant, ils sont toujours à risque de développer de futures maladies des voies respiratoires (modèle de perturbation du développement). Dans ce dernier groupe, les lésions causées par la perturbation redox au début de la vie peuvent être silencieuses au début, mais se manifester plus tard à l’âge de la petite enfance ou au-delà sous la forme d’une maladie chronique des voies respiratoires37. Nos données utilisant le test de stress oxydatif cellulaire ont montré qu’une exposition modérée à l’hyperoxie (60 % O2) augmentait significativement le stress oxydatif dans la monocouche de cellules nTAEC. L’analyse de la libération de LDH et de l’activation cellulaire de la caspase-3 a suggéré que notre stratégie d’exposition à l’hyperoxie n’a pas provoqué de mort cellulaire significative. Les méthodes et le système modèle que nous décrivons peuvent potentiellement être utilisés pour découvrir des mécanismes moléculaires sensibles à l’O2 tôt dans la vie en tant que lien avec le développement ultérieur de la maladie pulmonaire chez les anciens prématurés.

Au cours de la vie fœtale, les cellules épithéliales des voies respiratoires sont immergées dans le liquide pulmonaire et existent dans l’environnement intra-utérin relativement hypoxique26. Les cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales subissent un renouvellement et une différenciation rapides et forment une barrière critique entre le poumon et le monde extérieur. Lorsque les nouveau-nés passent à la vie postnatale, les cellules épithéliales des voies respiratoires sont exposées à un environnement postnatal relativement hyperoxique. Cette transition est rendue plus abrupte chez les nouveau-nés prématurés et cliniquement malades, car ils ont également régulièrement besoin d’O2 thérapeutique dans le cadre de leurs soins40,74, ce qui les expose à un risque élevé de lésions oxydatives après la naissance1. Alors que les effets de l’hyperoxie sur l’alvéolarisation pulmonaire postnatale ont été bien caractérisés à l’aide de modèles animaux75, les effets de l’exposition à l’hyperoxie sur le développement des cellules épithéliales des voies respiratoires sont relativement peu étudiés38. L’utilisation de cellules épithéliales des voies respiratoires dérivées du nouveau-né humain avec une exposition à l’hyperoxie physiologiquement pertinente pendant l’ALI ajoute une pertinence translationnelle à notre modèle. De plus, l’utilisation de l’exposition à l’hyperoxie au cours de la phase précoce-intermédiaire de la différenciation active et de la formation d’une monocouche cellulaire plutôt que de l’épithélium67 mature des voies respiratoires entièrement différencié simule potentiellement le scénario clinique chez les nouveau-nés extrêmement prématurés (< 28 semaines de gestation) qui naissent pendant les stades précoces (canaliculaire à sacculaire) du développement pulmonaire plutôt que le stadealvéolaire 7.

Notre modèle a des limites qui doivent être prises en compte lorsqu’on l’applique au développement humain et à la maladie. Nous avons utilisé la reprogrammation conditionnelle de cellules épithéliales primaires des voies respiratoires néonatales précédemment publiée dans un modèle ALI de nTAECs39. L’utilisation d’inhibiteurs de facteurs de croissance (Rho/Smad/GSK3/mTOR) permet un passage plus rapide et plus tardif de ces cellules. Nous avons tenté de cultiver des nTAECs dans des conditions immergées et ALI sans inhibiteurs dans le milieu de croissance ; cependant, l’expansion et le passage de ces cellules étaient significativement plus lents, et la monocouche cellulaire de l’ALI est devenue perméable à la fin de la deuxième semaine (données non présentées). Un autre groupe utilisant les mêmes inhibiteurs pour la culture de cellules épithéliales primaires des voies respiratoires néonatales42 a effectué un séquençage de l’ARN sur cellule unique pour montrer que la présence de ces inhibiteurs ne provoquait pas d’expression différentielle significative des gènes impliqués dans le stress oxydatif, la transition épithélio-mésenchymateuse ou la sénescence cellulaire. Néanmoins, nous avons pris en compte cette limitation dans notre modèle et avons décidé d’effectuer une exposition à l’hyperoxie après que les inhibiteurs de Rho et de Smad aient été retirés des milieux de différenciation. Pour cette étude, nous n’avons testé que des effets modérés d’hyperoxie (60 % O2) sur les nTAECs. Cependant, les études futures visent à utiliser l’exposition à l’hyperoxie graduelle (40 %, 60 % et 95 % O2) et à comparer les réponses dans les nTAEC. Bien que le modèle décrit ici ait un attrait translationnel compte tenu de l’utilisation de cellules de nouveau-nés humains admis à l’USIN, il s’agit d’un modèle de culture cellulaire in vitro et, par conséquent, des résultats significatifs utilisant ce modèle justifieraient une confirmation avec un modèle animal in vivo complémentaire.

En conclusion, nous avons décrit la méthode étape par étape pour établir un modèle de culture ALI 3D in vitro utilisant des cellules épithéliales des voies respiratoires néonatales isolées à partir d’aspirations trachéales de nouveau-nés intubés dans l’unité de soins intensifs néonatals. Nous avons utilisé ce modèle pour examiner les effets d’une exposition modérée à l’hyperoxie, une agression environnementale courante chez les nouveau-nés prématurés à l’USIN. L’exposition à l’hyperoxie a induit un stress oxydatif cellulaire dans la monocouche cellulaire sans causer de dommages significatifs à la membrane cellulaire ou la mort cellulaire, ce qui a permis de poursuivre la culture de l’ALI pour étudier les effets à long terme de l’exposition à l’O2 sur le développement et la fonction épithéliales des voies respiratoires néonatales. De futures applications utilisant ces méthodes pourraient potentiellement découvrir des mécanismes pathologiques précoces impliqués dans le développement à long terme de maladies pulmonaires induites par l’hyperoxie fréquemment observées chez les anciens prématurés.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer et aucun conflit d’intérêts à signaler.

Remerciements

Ce travail est soutenu par le financement de la Presbyterian Health Foundation (PHF) et de l’Oklahoma Shared Clinical and Translational Resources (U54GM104938 avec un prix de développement institutionnel (IDeA) du NIGMS) à AG. Nous tenons à remercier le Dr Paul LeRou et le Dr Xingbin Ai du Massachusetts General Hospital, Harvard Medical School, Boston, Massachusetts, pour avoir fourni des cellules de donneurs néonatals utilisées dans certaines des expériences. Les figurines ont été créées avec Biorender. L’analyse statistique a été réalisée avec GraphPad Prism.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Formol tamponné à 10 %Fisher Scientific23-426796
1X solution saline tamponnée au phosphate, pH 7,4Gibco10010049
A 83-01Tocris29-391-0
Inserts ALI Transwell, 6,5 mmCorning3470
Anticorps anti-tubuline acétylée, souris monoclonaleSigmaT7451
Anticorps anti-alpha tubulineAbcamab7291
Anticorps anti-cytokératine 5Abcamab53121
BronchiaLife Epithelial Airway Medium (BLEAM)LifeLine Cell TechnologyLL-0023
CHIR 99021Tocris44-231-0
Anticorps anti-caspase-3 clivéeSignalisation cellulaire9664T
Protéine SCGB1A1 ou à cellules club (CC16) humaine, Anticorps polyclonaux de lapinBioVendor R& DRD181022220-01
CM-H2DCFDA (Indicateur Général de Stress Oxydatif)Thermo ScientificC6827
Corning Culture Cellulaire Traitée T25 FiolesCorning430639
Corning Culture Cellulaire en U T75 FiolesCorning430641U
CyQUANT LDHCytotoxicité Thermo ScientificC20300
DAPI Solution (1 mg/mL)Fisher ScientificEN62248
Dimethyl sulfoxyde [DMSO] Hybri-MaxSigmaD2650
Eau distilléeGibco15230162
EVOM Manual for TEER MeasurementWorld Precision InstrumentEVM-MT-03-01
FBS (Fetal Bovin Serum)Gibco10082147
Isothiocyanate de fluorescéine Dextran (poids moyen 10 000)Fisher ScientificF0918100MG
Isothiocyanate de fluorescéine&ndash ; dextran (moyenne mol wt 20,00)SigmaFD20-100MG
Chèvre Anti-Souris IgG(H+L), Humain ads-HRPSouthern Biotech1031-05
anti-souris IgG2b Anticorps secondaire à adsorption croisée, Alexa Fluor 488InvitrogenA-21141
Chèvre anti-lapin IgG (H+L) Anticorps secondaire à haute adsorption croisée, Alexa Fluor 546InvitrogenA-11035
Chèvre Anti-Lapin IgG (H+L), Souris/Humain ads-HRPSouthern Biotech4050-05
HBTEC Différenciation de l’interface air-liquide (ALI) MediumLifeLine Cell TechnologyLM-0050
HEPESLonzaCC-5024
Heracell VIOS 160i Incubateur de CO2 tri-gaz, 165 LThermo Scientific51030411
Kit de transcription inverse d’ADNc haute capacitéThermo Scientific4368814
supplément HLLLifeLine Cell TechnologyLS-1001
ImageJNIHN/A
Invivogen Normocin - Réactif antimicrobienFisher ScientificNC9273499
L-GlutamineLifeLine Cell TechnologyLS-1013
Sérum de chèvre normalGibco
NormocinInvivogenant-nr-05
p63 anticorpsSanta Cruz Biotechnologysc-25268
ProLong Gold Antifade MountantInvitrogenP36930
PureLink RNA Mini KitThermo Scientific12183025
RAPAMYCINThermo ScientificAAJ62473MC
TaqMan Fast Advanced Master MixThermo Scientific4444964
Taqman Tests d’exression de gènes : 18S rRNAThermo ScientificHs99999901_s1
Taqman Tests d’exression de gènes : CATThermo ScientificHs00156308_m1
Taqman Tests d’exression de gènes : FOXJ1Thermo ScientificHs00230964_m1
Taqman Tests d’exression de gènes : GAPDHThermo ScientificHs02786624_g1
Taqman Tests d’exression génétique : GPX1Thermo ScientificHs00829989_gH
Taqman Tests d’exression génétique : GPX2Thermo ScientificHs01591589_m1
Taqman Tests d’exression génétique : GPX3Thermo ScientificHs01078668_m1
Taqman Tests d’exression génétique : KRT5Thermo Scientific
Dosages d’exression de gènes Taqman : MUC5ACThermo ScientificHs01365616_m1
Dosages d’exression de gènes Taqman : SCGB1A1Thermo ScientificHs00171092_m1
Taqman Dosages d’exression de gènes : SOD1Thermo ScientificHs00533490_m1
Taqman Dossions d’exression de gènes : SOD2Thermo ScientificHs00167309_m1
Thermo Scientific Nalgene Unités de filtration stériles jetables à débit rapide avec membrane PES (0,22 &mu ; m pores, 500 ml)Thermo Scientific5660020
TM-1 Supplément combinéLifeLine Cell TechnologyLS-1055
Anticorps total contre la caspase-3Signalisation cellulaire14220S
Triton X-100Sigma9036-19-5
Trypsine-EDTA (0,05 %), Rouge de phénolGibco25300062
Y-27632 2 HClTocrisRéférence 12-541-0
Chèvre imagej.nih.gov/ij/ PCN5000Hs00361185_m1

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Culture cellulaire 3Dexposition l hyperoxiecellules des voies respiratoires n onatalesinterface air liquidedosage du stress oxydatifisolation d aspirats trach auxdiff renciation mucociliairepolarisation de la monocouche cellulairemaladie pulmonaire n onatale
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