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Article de méthode

Valorisation de l’algue rouge Gracilaria gracilis par une approche de bioraffinage

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DOI :

10.3791/65923

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21 novembre 2023

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1MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, ESTM, Polytechnic University of Leiria, 2MARE-Marine and Environmental Sciences Centre/ARNET-Aquatic Research Network, Department of Life Sciences, University of Coimbra

Dans cet article

Résumé

Nous décrivons ici plusieurs protocoles visant à une valorisation intégrée de Gracilaria gracilis : récolte d’espèces sauvages, culture en interne et extraction de principes bioactifs. Les effets antioxydants, antimicrobiens et cytotoxiques des extraits sont évalués, ainsi que l’évaluation nutritionnelle et de la stabilité des aliments enrichis en biomasse et pigments d’algues entières.

Résumé

L’intérêt pour les algues en tant que matière première abondante pour obtenir des ingrédients bioactifs précieux et multicibles ne cesse de croître. Dans ce travail, nous explorons le potentiel de Gracilaria gracilis, une algue rouge comestible cultivée dans le monde entier pour son intérêt commercial en tant que source d’agar et d’autres ingrédients pour des applications cosmétiques, pharmacologiques, alimentaires et animales.

Les conditions de croissance de G. gracilis ont été optimisées par la multiplication végétative et la sporulation tout en manipulant les conditions physico-chimiques pour obtenir un stock de biomasse important. Des méthodologies d’extraction verte à l’éthanol et à l’eau ont été réalisées sur la biomasse d’algues. Le potentiel bioactif des extraits a été évalué à l’aide d’un ensemble de tests in vitro concernant leur cytotoxicité, leurs propriétés antioxydantes et antimicrobiennes. De plus, la biomasse d’algues séchées a été incorporée dans les formulations de pâtes alimentaires pour augmenter la valeur nutritionnelle des aliments. Des pigments extraits de G. gracilis ont également été incorporés dans le yogourt en tant que colorant naturel, et leur stabilité a été évaluée. Les deux produits ont été soumis à l’appréciation d’un panel sensoriel semi-entraîné visant à obtenir la meilleure formulation finale avant d’arriver sur le marché.

Les résultats confirment la polyvalence de G. gracilis , qu’il soit appliqué sous forme de biomasse entière, d’extraits et/ou de pigments. Grâce à la mise en œuvre de plusieurs protocoles optimisés, ce travail permet le développement de produits ayant le potentiel de profiter aux marchés de l’alimentation, des cosmétiques et de l’aquaculture, en promouvant la durabilité environnementale et une économie circulaire bleue.

De plus, et conformément à une approche de bioraffinerie, la biomasse résiduelle d’algues sera utilisée comme biostimulant pour la croissance des plantes ou convertie en matériaux carbonés pour être utilisée dans la purification de l’eau des systèmes d’aquaculture internes de MARE-Polytechnic de Leiria, au Portugal.

Introduction

Les algues peuvent être considérées comme une matière première naturelle intéressante dont profitent les secteurs pharmaceutique, alimentaire, alimentaire et environnemental. Ils biosynthétisent une panoplie de molécules, dont beaucoup ne se trouvent pas dans les organismes terrestres, avec des propriétés biologiques pertinentes 1,2. Cependant, des protocoles de culture optimisés pour les algues doivent être mis en place pour assurer un stock de biomasse important.

Les méthodes de culture doivent toujours tenir compte de la nature des thalles d’algues et de leur morphologie générale. Gracilaria gracilis est un taxon clonal, c’est-à-dire que l’organe d’attache produit plusieurs axes végétatifs. La multiplication par fragmentation (reproduction végétative) est ainsi réalisée, car chacun de ces axes est tout à fait capable d’adopter une vie indépendante du thalle principal3. Les taxons clonaux peuvent être intégrés avec succès avec des méthodologies de culture simples et rapides en une seule étape, car de grandes quantités de biomasse sont obtenues en divisant le thalle en petits fragments qui se régénèrent rapidement et se développent en de nouveaux individus génétiquement identiques. Les thalles haplontiques et diplontiques peuvent être utilisés dans ce processus. Bien que le genre présente un cycle de vie triphasique isomorphe haplo-diplonique complexe, la sporulation est rarement nécessaire, sauf lorsque le renouvellement génétique des stocks est nécessaire pour obtenir des cultures améliorées. Dans ce cas, les tétraspores (spores haplontiques formées par méiose) et les carpospores (spores diplontiques formées par mitose) donnent naissance à des thalles macroscopiques qui peuvent ensuite être cultivés et multipliés par reproduction végétative4. Les cycles de croissance sont dictés par les conditions environnementales et l’état physiologique des individus, entre autres facteurs biologiques tels que l’émergence d’épiphytes et l’adhésion d’autres organismes. Par conséquent, l’optimisation des conditions de croissance est cruciale pour assurer une productivité élevée et produire une biomasse de bonne qualité5.

L’extraction des composés bioactifs des algues, y compris G. gracilis, peut être réalisée par diverses méthodes 6,7. Le choix de la méthode d’extraction dépend des composés spécifiques d’intérêt, de l’application cible et des caractéristiques de l’algue. Dans cette étude, nous nous sommes concentrés sur l’extraction par solvant, qui consiste à utiliser des solvants verts, tels que l’eau ou l’éthanol, pour dissoudre et extraire les composés bioactifs de la biomasse d’algues. L’extraction peut être réalisée par macération de manière polyvalente et efficace et peut être utilisée pour une large gamme de composés. Il s’agit d’une méthode simple et largement utilisée qui consiste à faire tremper la biomasse dans un solvant pendant une période prolongée, généralement à température ambiante ou légèrement élevée. Le solvant est agité pour améliorer le processus d’extraction. Après le temps d’extraction souhaité, le solvant est séparé de la matière solide par filtration ou centrifugation.

L’eau est un solvant couramment utilisé dans les applications alimentaires en raison de sa sécurité, de sa disponibilité et de sa compatibilité avec une large gamme de produits alimentaires. L’extraction à l’eau convient aux composés polaires tels que les polysaccharides, les peptides et certains composés phénoliques. Cependant, il peut ne pas extraire efficacement les composés non polaires. L’éthanol est également un solvant largement utilisé dans les applications alimentaires et peut être efficace pour extraire une variété de molécules bioactives, y compris les composés phénoliques, les flavonoïdes et certains pigments. L’éthanol est généralement reconnu comme sûr pour une utilisation dans les aliments et peut être facilement évaporé, laissant derrière lui les composés extraits. Il convient de noter que le choix de la méthode d’extraction doit tenir compte de facteurs tels que l’efficacité, la sélectivité, la rentabilité et l’impact environnemental. L’optimisation des paramètres d’extraction, tels que la concentration en solvant, le temps d’extraction, la température et la pression, est cruciale pour obtenir des rendements optimaux de composés bioactifs de G. gracilis ou d’autres algues.

Il a été constaté que les algues présentent une activité antimicrobienne contre un large éventail de micro-organismes, y compris les bactéries, les champignons et les virus8. Cette activité est attribuée à des composants bioactifs, notamment des composés phénoliques, des polysaccharides, des peptides et des acides gras. Plusieurs études ont démontré leur efficacité contre des agents pathogènes tels que Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Salmonella sp. et Pseudomonas aeruginosa, entre autres9. L’activité antimicrobienne des algues est attribuée à la présence de composés bioactifs qui peuvent interférer avec les parois cellulaires microbiennes, les membranes, les enzymes et les voies de signalisation10. Ces composés peuvent perturber la croissance microbienne, inhiber la formation de biofilm et moduler les réponses immunitaires.

Les algues rouges, également connues sous le nom de rhodophytes, sont un groupe d’algues qui peuvent présenter une activité antimicrobienne contre une variété de micro-organismes. Au sein de ce groupe, G. gracilis contient divers composés bioactifs qui peuvent contribuer à son activité antimicrobienne signalée. Bien que les molécules spécifiques puissent varier, les classes communes qui ont été signalées chez G. gracilis et qui peuvent posséder des propriétés antimicrobiennes sont les polysaccharides, les composés phénoliques, les terpénoïdes et les pigments11. Cependant, il est important de noter que la présence et les quantités de ces composants peuvent varier en fonction de facteurs tels que l’emplacement de la collecte des algues, la saisonnalité, l’état physiologique des thalles et les conditions environnementales. Par conséquent, la classe et la concentration spécifiques de composés antimicrobiens chez G. gracilis peuvent varier en conséquence.

Il a également été démontré que G. gracilis possède des propriétés antioxydantes, contenant divers composés phénoliques, dont il a été démontré qu’ils éliminent les radicaux libres et réduisent le stress oxydatif12.Les antioxydants aident à protéger les cellules contre les dommages causés par les espèces réactives de l’oxygène et ont des avantages potentiels pour la santé. La capacité antioxydante peut être évaluée directement par différentes méthodes, y compris l’activité de piégeage des radicaux libres du 2,2-diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH) et, indirectement, par la quantification de la teneur totale en polyphénols (TPC)13.

Même si l’on rapporte qu’un ingrédient a une bioactivité importante, son évaluation de la cytotoxicité est indispensable pour évaluer les substances naturelles et synthétiques à utiliser en contact avec des cellules ou des tissus vivants. Il existe plusieurs méthodes de mesure de la cytotoxicité, chacune ayant des avantages et des limites. Dans l’ensemble, ils offrent une gamme d’options pour évaluer les effets nocifs de nombreuses substances sur les cellules et, en même temps, pour étudier les mécanismes de l’endommagement et de la mort cellulaires14.

Dans ce travail, nous utilisons le dosage du bromure de 3-(4,5-diméthylthiazol-2-yl)-2,5-diphényltétrazolium (MTT), une méthode colorimétrique introduite par Mosmann (1983)15. Cette méthode mesure la réduction des sels de tétrazolium en un produit de formazan violet par des cellules métaboliquement actives. Plus la quantité de cristaux de formazan est élevée, plus le nombre de cellules viables est élevé, fournissant ainsi une mesure indirecte de la cytotoxicité14. Étant donné que dans ce travail, l’eau de G. gracilis et les extraits d’éthanol sont destinés à être incorporés dans des formulations dermo-cosmétiques, l’évaluation de la cytotoxicité in vitro est réalisée dans une lignée cellulaire de kératinocytes (HaCaT).

En ce qui concerne l’application alimentaire, les algues sont généralement faibles en calories et nutritionnellement riches en fibres alimentaires, en éléments essentiels et en acides aminés, en polysaccharides, en acides gras polyinsaturés, en polyphénols et en vitamines 2,16. G. gracilis ne fait pas exception, ayant une valeur nutritionnelle intéressante. Freitas et al. (2021)4 ont constaté que le G. gracilis cultivé avait des niveaux plus élevés de protéines et de vitamine C et maintenait le niveau de lipides totaux par rapport aux algues sauvages. Cela peut représenter un avantage économique et environnemental, car nutritionnellement parlant, la production est préférable à l’exploitation des ressources sauvages. De plus, les consommateurs sont de plus en plus préoccupés par le type d’aliments qu’ils consomment, il est donc important d’introduire de nouveaux ingrédients pour l’enrichissement des aliments et d’utiliser de nouvelles ressources pour obtenir des extraits qui peuvent ajouter de la valeur à un produit et revendiquer un « clean label ». En outre, le marché actuel est très concurrentiel, ce qui nécessite le développement de nouveaux produits et de stratégies innovantes pour différencier les fabricants de leurs concurrents17.

L’enrichissement de produits à faible valeur nutritionnelle, tels que les pâtes, avec des ressources marines, y compris les algues, est une stratégie visant à introduire cette ressource en tant que nouvel aliment et une stratégie de différenciation du marché grâce à un produit à valeur nutritionnelle distincte. D’autre part, G. gracilis est une source de pigments rouges naturels tels que les phycobiliprotéines18, ayant un fort potentiel d’applications dans l’industrie alimentaire. Cette algue a montré un grand intérêt dans plusieurs domaines, et son application peut être faite en utilisant l’algue entière, des extraits et/ou la biomasse restante. Dans ce travail, nous montrons quelques exemples de telles applications.

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Protocole

1. Récolte et préparation de la biomasse

  1. Récoltez les spécimens de G. gracilis à marée basse et transportez-les rapidement au laboratoire dans des boîtes sombres et réfrigérées pour éviter le dessèchement, la lumière et l’exposition à l’air.
  2. En laboratoire, lavez chaque thalle à l’eau de mer courante et nettoyez-le soigneusement pour éliminer les débris, les parties nécrotiques, les épiphytes et autres organismes de la surface.
  3. Conservez la biomasse sauvage dans de l’eau de mer constamment aérée (31-35 psu) dans une pièce climatique (20 ± 1 °C) avec une faible irradiance fournie par la lumière du jour, des lampes blanches froides et fluorescentes et une photopériode réglée à 16h08 (lumière : obscurité) pendant 7 jours. Pendant cette période, ne pas fournir de milieu nutritif ; Cela permet aux algues de s’adapter lentement aux nouvelles conditions intérieures.

2. Entretien des stocks

  1. Après la période d’acclimatation, coupez les extrémités saines des thalles d’algues avec une lame stérile. À la suite de Redmond et al. (2014)19 et dans des conditions stériles, faites glisser chaque pointe dans un gel de gélose préalablement préparé dans des boîtes de Pétri (gélose bactériologique à 1,0 %, dans un rapport eau distillée/eau de mer de 1 :1) pour éliminer tout contaminant restant. Effectuez le glissement de gélose trois fois pour chaque pointe et faites toujours glisser la pointe à travers les parties inutilisées du gel d’agar-agar.
  2. Lavez la verrerie à l’acide dans une solution d’acide chlorhydrique (HCl, 15 %) et rincez-la abondamment à l’eau distillée. Stériliser tous les outils, la verrerie, la gélose, l’eau de mer et l’eau distillée utilisés dans le processus de nettoyage par autoclave (121 °C, 15 min).
    ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de HCl livrée par le fournisseur.
  3. Les pointes poussent dans de l’eau de mer stérilisée à 35 psu, complétée par une solution enrichie de Von Stosch (VSE) modifiée pour les algues rouges, selon Redmond et al. (2014)19. Ajouter du dioxyde de germanium (GeO2) au milieu (1 mL/L) pour empêcher la croissance de diatomées épiphytes.
    ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du GeO2 livrée par le fournisseur.
    REMARQUE : Les pointes qui présentent une perte de pigmentation, telle qu’observée par une décoloration partielle ou totale, sont soumises à un stress ou sont déjà mortes et doivent être jetées.

3. Culture et mise à l’échelle

  1. Après la période d’acclimatation, répartir au hasard environ 8 à 10 pointes saines dans des flacons à fond plat de 250 ml dans une pièce climatique réglée à 20 ± 1 °C avec la lumière blanche froide de 20 ± 0,5 μmol photons m-2 s-1 (1500 lux), une photopériode réglée à 16 h : 8 h (lumière : obscurité) et de l’eau de mer stérile enrichie de milieux de culture VSE renouvelée chaque semaine.
  2. Effectuez des mesures de poids hebdomadaires, en évitant de fatiguer excessivement les thalles20. Pour cela, retirez soigneusement les pointes du milieu de culture, rincez doucement et pesez les milligrammes sur une balance de laboratoire.
    REMARQUE : Cette procédure peut être effectuée en même temps que le renouvellement hebdomadaire des milieux de culture.
  3. Les thalles peuvent se développer dans ces flacons jusqu’à une densité de 2 g/L. À ce stade, effectuez une mise à l’échelle du receveur (250 mL, 1 L et 5 L). Transférez la culture dans des récipients blancs ouverts en plein air de 50 L et plus lorsque le volume atteint 5 L.
  4. Calculer le taux de croissance relatif (RGR) selon Patarra et al. (2017)21 :
    RGR (% fw/jour) = ([Ln (fw) - Ln (iw)]/t) x 100
    où iw et fw sont respectivement le poids frais initial et final, exprimé en grammes, et t est le temps en jours.
    REMARQUE : Dans cette configuration de laboratoire, RGR atteint des valeurs allant jusqu’à 21% par jour. La récolte de la biomasse peut être effectuée à tout moment. La biomasse doit être traitée rapidement pour éviter sa dégradation, soit par séchage au four, soit par lyophilisation, soit simplement stockée congelée (-20 °C), selon l’utilisation prévue. La biomasse séchée peut être conservée à température ambiante (RT) ou conservée congelée.

4. Procédure d’extraction

REMARQUE : Pour évaluer la cytotoxicité in vitro , les propriétés antioxydantes et antimicrobiennes des extraits de G. gracils , sa préparation prend en compte deux paramètres différents : la température d’extraction et le type de solvant.

  1. Pour effectuer les extractions, séchez la biomasse de G. gracilis au four et broyez-la (par exemple, dans un moulin à café domestique) jusqu’à ce que la poudre passe à travers un tamis de 200 μm.
  2. Peser la biomasse séchée (10 g) et la dissoudre dans 100 mL de solvant (éthanol absolu ou eau stérile).
  3. Remuer dans un récipient à l’abri de la lumière pendant 30 min.
  4. Effectuer des extractions séquentielles d’éthanol > d’eau et d’eau > d’éthanol à RT, 40 °C et 70 °C.
  5. Pour chaque température, effectuez les extractions avec de l’éthanol et de l’eau séparément deux fois.
  6. Séparer les extraits liquides de la biomasse restante par filtration à travers du papier filtre (Whatman n°1), suivie d’une centrifugation à 8000 x g pendant 10 min à RT.
  7. Réutiliser la biomasse algale restante pour une extraction ultérieure avec l’autre solvant. Si un échantillon a d’abord été extrait avec de l’éthanol, extrayez-le ensuite avec de l’eau, et vice-versa.
  8. Lyophiliser les extraits aqueux et évaporer les extraits d’éthanol dans un évaporateur rotatif à 40 °C.
  9. Conservez les extraits secs à 4 °C.
  10. Dissoudre les extraits à une concentration de 50 mg/mL (dosages antimicrobiens) ou 10 mg/mL (dosages antioxydants). Dissoudre les extraits aqueux dans de l’eau stérile et les extraits éthanoliques dans de l’éthanol absolu.

5. Activité antimicrobienne

REMARQUE : Les extraits éthanolique et aqueux doivent être testés individuellement contre Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347), Escherichia coli (DSM 5922) et Listonella anguillarum (DSM 21597). Les tests antimicrobiens doivent être effectués conformément aux recommandations du National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS, 2012)22. Toutes les cultures ont été obtenues à partir de la collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires (DSMZ). L. anguillarum a été cultivé sur du bouillon de soja tryptique (TSB) ou de la gélose tryptique de soja (TSA) additionnée de chlorure de sodium (NaCl) à 1 %. Les deux souches restantes ont été cultivées sur un milieu LB (VWR Chemicals). Les cultures de Bacillus subtilis subsp. spizizenii (DSM 347) et de Listonella anguillarum (DSM 21597) ont été incubées à 30 °C, tandis que les cultures d’Escherichia coli (DSM 5922) ont été incubées à 37 °C, selon les instructions du fournisseur. La méthode de microdilution du bouillon peut être utilisée pour la détermination de l’activité antimicrobienne dans un milieu liquide, et cela doit être effectué à l’échelle microscopique, ce qui permet de déterminer le potentiel antimicrobien rapidement et efficacement. Cette méthode peu coûteuse permet d’obtenir des résultats en seulement 24 h, ce qui permet de déterminer, à un stade précoce, les meilleures conditions d’extraction qui permettent, pour une souche microbienne donnée, d’obtenir des résultats en termes d’action inhibitrice de croissance. Cependant, la méthodologie nécessite l’utilisation de microplaques stériles avec un couvercle spécifique pour la croissance microbienne, ainsi que la disponibilité d’un lecteur de microplaques pour la longueur d’onde de 600 nm.

  1. Effectuer les essais de microdilution du bouillon à l’aide de microplaques à 96 puits à fond rond non traitées contenant 170 μL de bouillon Muller-Hinton (MHB), inoculées avec 10 μL d’inoculum normalisé (à 0,5 norme McFarland) et 20 μL de chaque extrait (50 mg/mL).
  2. Incubez les plaques pendant 24 h à la température optimale pour chaque souche.
  3. Détecter l’activité antimicrobienne par la réduction de la turbidité visible mesurée par l’enregistrement de la densité optique (OD 600) dans un spectrophotomètre à microplaques, à 0 h et 24 h.
  4. Exprimez les résultats en pourcentage d’inhibition :
    figure-protocol-1
    où Abs. ext est la différence d’absorbance mesurée, entre 0 h et 24 h, dans les puits qui contiennent une souche bactérienne qui se développe en présence de l’extrait, et Abs se réfère à la même mesure dans les puits qui contiennent la souche bactérienne et le solvant.
  5. Dans cette méthode, inclure des réactions témoins, avec des puits contenant uniquement un milieu de culture qui sera le témoin négatif, mais aussi des puits avec un milieu inoculé avec la souche standard ajoutée au solvant (éthanol ou eau) et un milieu avec la souche bactérienne et l’antibiotique témoin positif (chloramphénicol).

6. Activité antioxydante et quantification des polyphénols totaux

  1. Teneur totale en polyphénols
    NOTE : La teneur en polyphénols totaux (TPC) est réalisée selon la méthode Folin-Ciocalteu23 et adaptée à l’échelle microscopique.
    1. Ajouter à chaque puits d’une microplaque à 96 puits, à l’abri de la lumière, 158 μL d’eau ultrapure, 2 μL de l’échantillon et 10 μL de réactif Folin-Ciocalteu.
      ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du réactif Folin-Ciocalteu livré par le fournisseur.
    2. Au bout de 2 min, ajouter 30 μL de Na2CO3 (20 %).
    3. Après incubation dans l’obscurité à RT pendant 1 h, mesurer les échantillons par spectrophotométrie à 755 nm.
    4. Utilisez de l’acide gallique (qui permet de tracer la courbe d’étalonnage) ou de l’eau ultrapure (2 μL) comme témoins.
    5. Exprimez les résultats sous forme d’équivalents d’acide gallique (mg GAE/g d’extrait).
  2. Activité de piégeage des radicaux 2,2 diphényl-1-picrylhydrazyl (DPPH)
    NOTE : L’activité antioxydante des extraits est évaluée telle que décrite par Duan et al. (2006)24, adaptée à l’échelle microscopique
    1. Dans une microplaque à 96 puits à l’abri de la lumière, placer 2 μL de chaque échantillon (à une concentration de 10 mg/mL) et 198 μL de DPPH dissous dans de l’éthanol absolu (0,1 mM).
      ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de DPPH livrée par le fournisseur.
    2. Exécutez la réaction pendant 30 minutes à RT dans l’obscurité. Mesurer l’absorbance à 517 nm dans un spectrophotomètre à microplaques.
    3. Effectuer une réaction de contrôle avec 2 μL d’éthanol/eau distillée absolue et 198 μL de solution DPPH. Effectuez une mesure à blanc avec 2 μL d’extrait et 198 μL d’éthanol absolu.
    4. Exprimez les résultats sous forme de pourcentage d’inhibition de la DPPH à l’aide de l’équation suivante :
      figure-protocol-2
      où As est l’absorbance de l’extrait d’algue, Ab est l’absorbance des échantillons blancs et Ac est l’absorbance du témoin.

7. Évaluation de la cytotoxicité dans les cellules épidermiques

NOTE : L’effet cytotoxique in vitro des extraits aqueux et éthanols de G. gracilis est évalué dans les kératinocytes humains (cellules HaCaT - 300493) par le test colorimétrique MTT comme décrit précédemment25. Les cellules ont été acquises auprès de Cell Lines Services, Allemagne (CLS) et la méthode a été réalisée conformément aux directives institutionnelles et aux instructions du CLS.
ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de MTT livrée par le fournisseur)

  1. Maintenance de la culture cellulaire
    1. Cultivez des cellules HaCaT dans le milieu hyperglycémique (DMEM) de Dulbecco Modified Eagle complété par 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 1 % de solution antibiotique/antimycosique (amphotéricine B, 0,25 mM ; pénicilline, 60 mM ; streptomycine, 100 mM).
    2. Utilisez la trypsine-EDTA pour dissocier les cellules.
      REMARQUE : La sous-culture des cellules HaCaT est réalisée après que les cellules ont atteint la confluence totale.
    3. Cultiver les cellules dans une chambre à 37 °C avec 5 % de CO2 et 95 % d’humidité.
    4. Sous-culture des cellules selon les instructions de la biobanque chaque fois que les cultures atteignent 80 % à 85 % de confluence.
  2. Évaluation de la cytotoxicité
    1. Après avoir ensemencé les cellules dans des plaques de 96 puits et les avoir incubées pendant la nuit, traiter les cellules HaCaT (4 x 104 cellules/puits) avec les extraits séchés préalablement dissous dans du DMSO (100 mg/mL). Ensuite, ajouter 2 μL de la solution d’extrait à 198 μL de milieu et incuber les plaques pendant 24 h.
    2. Retirez le milieu de culture et ajoutez 100 μL de MTT (0,5 mg/mL) aux cellules. Incuber les cellules pendant 30 min dans l’obscurité dans les conditions de culture normales mentionnées ci-dessus.
    3. Retirer la solution de MTT et solubiliser les cristaux intracellulaires de formazan avec 100 μL de DMSO.
    4. Mesurer l’absorbance à 570 nm à l’aide d’un lecteur de microplaques. Exprimez les résultats en pourcentage de cellules témoins non traitées.

8. L’innovation alimentaire

  1. Nouveau produit alimentaire : Pâtes aux algues
    1. Sélection des ingrédients et formulation des pâtes
      NOTE : La sélection des ingrédients a été faite en collaboration avec une entreprise de pâtes. Le choix des ingrédients clés (décrits dans la section 8.2) a été fait en tenant compte de leur facilité d’accès et de leur compatibilité avec les lignes de production existantes, en utilisant les ressources marines pour obtenir des pâtes à valeur nutritionnelle ajoutée.
      1. Après le choix des ingrédients, concevez la formulation en fonction de la valeur nutritionnelle souhaitée (source de fibres, de vitamines et d’éléments minéraux, faibles graisses saturées) en analysant la composition chimique théorique des formulations à l’aide d’un tableur.
      2. Lorsque les exigences théoriques sont satisfaites, procédez à la production à l’échelle du laboratoire comme décrit à l’étape 8.1.2.
      3. Réaliser un test sensoriel avec un panel semi-formé (>10 dégustateurs) pour valider la nécessité d’une reformulation ou l’acceptation de la formulation pour les étapes suivantes.
        REMARQUE : Le panel a été préalablement formé pour la dégustation de pâtes et a évalué hédoniquement les formulations présentées en fonction d’attributs tels que la saveur, le goût, l’odeur, la texture et l’apparence.
    2. Production de pâtes
      REMARQUE : Produisez des échantillons de pâtes Chifferi à l’aide d’une extrudeuse de pâtes.
      1. Dans l’équipement, mélangez des portions préalablement définies de farine de riz, de G. gracilis et de Chlorella vulgaris, et ajoutez environ 30% d’eau au mélange.
      2. Pour obtenir des pâtes sèches, séchez Chifferi à 68 °C pendant 42 min, puis 5 h, 30 min à 76 °C, simulant un processus industriel.
      3. Enfin, emballez et scellez sous vide les échantillons et conservez-les dans un endroit sombre à RT jusqu’à une analyse plus approfondie.
    3. Analyse nutritionnelle
      REMARQUE : Pour les analyses du profil nutritionnel, utiliser des échantillons séchés et macérés en trois exemplaires.
      1. Teneur en protéines brutes : Effectuer le dosage des protéines totales par la méthode de Kjeldahl , adaptée de Duarte et al. (2022)26, en suivant les étapes 8.1.3.2-8.1.3.6.
      2. Peser avec précision 1,0 g d’échantillon (ou d’eau distillée pour l’essai à blanc) et mélanger avec deux comprimés de Kjeldahl et 25 mL de H2SO4 dans des tubes de digestion.
        ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de H2SO4 livrée par le fournisseur.
      3. Effectuer la digestion des échantillons dans un digesteur Kjeldahl à 220 °C pendant 30 min, puis 90 min à 400 °C.
      4. Après avoir refroidi jusqu’à RT, ajouter 80 mL d’eau distillée et distiller l’ammoniac formé dans 30 mL d’une solution à 4 %H 3 BO3 contenant du vert de bromocrésol et du rouge de méthyle. Cette étape s’effectue dans des conditions alcalines (distillation avec 40% de NaOH à l’aide d’un distillateur Kjeldahl.
        ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de lasolution H 3 BO3 contenant du vert de bromocrésol, du rouge de méthyle et 40 % de NaOH livrée par le fournisseur.
      5. Titrer les échantillons distillés avec HCl 0,1 M jusqu’à ce qu’un changement de couleur vers un rose grisâtre soit observé.
      6. Calculez la teneur en protéines brutes, représentée par la teneur en azote de l’échantillon, et exprimez-la en g pour 100 g à l’aide de l’équation suivante :
        figure-protocol-3
        où Vs correspond au volume de HCl (mL) utilisé pour le titrage de l’échantillon ; Vb correspond au volume utilisé dans l’ébauche ; N correspond à la normalité de HCl ; w correspond au poids de l’échantillon (g).
      7. Teneur totale en matières grasses : Déterminer la teneur totale en matières grasses à l’aide de la méthode de Folch, adaptée de Folch et coll. (1957)27, en suivant les étapes 8.1.3.8 à 8.1.3.14.
      8. Préparer le réactif de Folch en mélangeant le CHCl3 et le MeOH dans une proportion de 2 :1 (v :v).
        ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du réactif Folch livré par le fournisseur.
      9. Pour tester des tubes contenant 1 g d’aliquotes d’échantillons, ajouter 5 mL de réactif Folch et 0,8 mL d’eau distillée. Mélangez dans un vortex pendant 1 min.
      10. Ensuite, ajouter 5 mL de réactif Folch et homogénéiser pendant 5 min. Ajouter 1,2 mL de solution de NaCl à 0,8 % et homogénéiser pendant 2 min.
      11. Centrifuger les échantillons à 7000 x g pendant 10 min. Filtrez la phase organique (phase inférieure) à travers du coton hydrophile et du sulfate de sodium anhydre dans une fiole en verre à fond rond.
      12. Pour éviter la perte d’échantillon, répétez les étapes d’ajout de 5 mL deCHCl 3, d’homogénéisation, de centrifugation et de filtration dans les mêmes conditions.
      13. Éliminer le solvant organique des phases organiques collectées par évaporation à basse pression et laisser enfourner à 105 °C pendant 4 h. Refroidir les échantillons dans un dessiccateur.
      14. Calculer la teneur en matières grasses, exprimée en g pour 100 g, à l’aide de l’équation suivante :
        figure-protocol-4
        où W1 est le poids de la fiole en verre vide à fond rond ; W2 est le poids initial de l’échantillon ; W3 est le flacon en verre à fond rond avec le poids de l’échantillon.
      15. Teneur en fibres brutes : Déterminer la teneur en fibres brutes à l’aide d’une méthodologie adaptée de l’ISO 6865 (2000)28, en suivant les étapes 8.1.3.16 à 8.1.3.22.
      16. Peser 1 g de l’échantillon (W0) dans un creuset en verre avec un fond filtrant (référence P2) et le placer dans l’analyseur de fibres.
      17. La première étape est l’hydrolyse acide : Ajouter 150 mL de 1,25 % H 2 SO4, préchauffé, et2mL d’agent anti-mousse (n-octanol) dans la colonne de chaque creuset ; Chauffer jusqu’à ébullition et garder pendant 30 min.
      18. Après avoir éliminé ce solvant, laver trois fois avec de l’eau déminéralisée pour procéder à l’hydrolyse de base. Ajouter 150 mL de NaOH à 1,25 %, préchauffé, et 5 mL d’agent anti-mousse dans la colonne sans liquide, et effectuer la même procédure de chauffage que pour l’hydrolyse acide.
      19. Enfin, faites un triple lavage avec 150 mL d’acétone pour l’extraction à froid.
      20. Après ce processus, retirez délicatement les creusets du système et placez-les dans un four à 150 °C pendant 1 h. Notez le poids final (W1).
      21. Placer les creusets dans un four à moufle à 500 °C pendant 3 h, puis noter le poids final (W2).
      22. Calculez la teneur en fibres brutes et exprimez les résultats en pourcentages à l’aide de l’équation suivante :
        % de fibres brutes = 100 x (W1-W2)/W0
      23. Profil d’acides gras (AG) : Déterminer le profil d’acides gras selon Fernández et al.(2015)29, en suivant les étapes 8.1.3.24 à 8.1.3.29.
        REMARQUE : Les esters méthyliques d’acides gras (EMAG) sont obtenus par transméthylation directe catalysée par l’acide des échantillons lyophilisés broyés. Toutes les analyses sont effectuées en trois exemplaires.
      24. Ajouter 2 mL d’une solutionH2SO4 à 2 % (v/v) dans du méthanol à un échantillon de 50 mg et verser le mélange à 80 °C pendant 2 h en agitant continuellement.
        ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du méthanol livrée par le fournisseur.
      25. Après refroidissement à RT, ajoutez 1 mL d’eau ultra-pure et 2 mL de n-heptane à chaque échantillon, faites tourbillonner le mélange pendant 1 min et centrifugez-le pendant 5 min.
        ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du n-heptane livrée par le fournisseur.
      26. Récupérer la phase supérieure n-heptane (organique) contenant les EMAG et la transférer dans des flacons de chromatographie en phase gazeuse (GC).
      27. Analysez dans un chromatographe en phase gazeuse équipé d’une colonne capillaire TR-FAME (60 m × 0,25 mm de diamètre intérieur, 0,25 μm d’épaisseur de film), d’un échantillonneur automatique et d’un détecteur à ionisation de flamme (FID).
      28. Réglez l’injecteur (mode splitless) à 250 °C et le détecteur à 280 °C. Réglez la température initiale de la colonne à 75 °C et maintenez-la pendant 1 min. Augmenter ensuite à 5 °C/min à 170 °C et maintenir pendant 10 min. Augmenter ensuite à 5 °C/min à 190 °C et maintenir encore 10 min. Enfin, augmenter à 2 °C/min à 240 °C et maintenir pendant 10 min. Utilisez l’hélium comme gaz vecteur à un débit de 1,5 mL/min. Fournir de l’air et de l’hydrogène à des débits respectifs de 350 et 35 mL/min.
      29. Déterminer le profil de l’AG en comparant les temps de rétention qui en résultent avec une norme et exprimer les résultats en pourcentage de la graisse totale.
      30. Profil des éléments minéraux : Déterminer les éléments minéraux (Ca, P, Mg, Na, K, Fe, Cu, Mn, Zn) analysés par l’ICP-OES, en suivant la méthode adaptée de Pinto et al. (2022)30, en suivant les étapes 8.1.3.31-8.1.3.34.
      31. Peser avec précision environ 0,4 g de chaque échantillon sec et ajouter 7,5 mL de HNO3 et 2,5 mL de HCl.
        ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité de HNO3 et HCl livrée par le fournisseur.
      32. La digestion suit un processus en deux étapes : augmenter la température de RT à 90 °C en 30 min (et maintenir 30 min supplémentaires à cette température) suivie de 60 min à 105 °C.
      33. Refroidissez les solutions d’échantillonnage, diluez-les à 25 ml, filtrez-les et conservez-les dans des tubes étiquetés. À chaque digestion, effectuez le même processus avec un matériau de référence et un blanc. Obtenir la concentration des différents éléments par ICP-OES.
      34. Exprimez les résultats en mg pour 100 g de poids corporel.
      35. Teneur en glucides : Calculez la teneur en glucides en suivant les étapes 8.1.3.36-8.1.3.37.
      36. Calculer la teneur en glucides disponibles (à l’exclusion des fibres) par la différence des facteurs précédemment déterminés pour 100 g, à l’aide de l’équation suivante, selon l’Organisation des Nations Unies pour l’alimentation et l’agriculture (FAO ; 2003)31
        figure-protocol-5
      37. Exprimez les résultats en g pour 100 g.
      38. Teneur en humidité et en cendres : Estimez la teneur en humidité et en cendres en suivant les étapes 8.1.3.39 à 8.1.3.45.
      39. Incuber les creusets en porcelaine pendant 3 h à 105 °C, les refroidir dans un dessiccateur et les peser.
      40. Peser 10 g de l’échantillon dans le creuset et le placer dans une étuve de séchage à 105 °C pendant des cycles de 3 h jusqu’à ce que les valeurs des pondérations successives ne diffèrent pas de plus de 10 mg.
      41. Calculer la teneur en eau, exprimée en g par 100 g de poids corporel, à l’aide de l’équation suivante :
        figure-protocol-6
        où W1 est le poids du creuset vide, W2 est le poids du creuset avec l’échantillon frais et W3 est le poids du creuset avec l’échantillon séché.
      42. Après le dosage de la teneur en humidité, placer les creusets avec les échantillons séchés dans un incinérateur à 525 °Cpendant 4 h.
      43. Répétez cette procédure jusqu’à ce que les pondérations successives ne diffèrent pas de plus de 1 mg.
      44. Refroidissez les échantillons jusqu’à ce qu’ils soient RT dans un dessiccateur, puis pesez-les.
      45. Calculer la teneur en cendres, exprimée en g pour 100 g de poids corporel, à l’aide de l’équation suivante :
        figure-protocol-7
        où W1 est le poids du creuset vide, W2 est le poids du creuset avec l’échantillon frais, W3 est le poids du creuset avec le poids.
      46. Valeur énergétique : Calculez la valeur énergétique en suivant les étapes 8.1.3.47 à 8.1.3.48.
      47. Calculer la valeur énergétique des échantillons selon le règlement de l’UE :La fourniture d’informations alimentaires aux consommateurs (règlement 1169/2011)32, à l’aide des équations suivantes :
        Énergie (kcal/ 100 g) = 4 x (g de protéines) + 4 x (g de glucides) + 9 x (g de lipides) + 2 x (g de fibres)
        Énergie (kJ/ 100 g) = 17 x (g protéines) + 17 x (g glucides) + 37 x (g lipides) + 8 x (g fibres)
      48. Exprimez les résultats en kilocalories pour 100 g et en kilojoules pour 100 g.
    4. Acceptation par les consommateurs
      1. Évaluez l’acceptation par les consommateurs à l’aide d’échantillons de pâtes cuites dans de l’eau distillée pendant 8 minutes.
      2. Effectuer un test d’acceptation par le consommateur : évaluez l’apparence visuelle, la couleur, la texture, l’odeur, le goût marin, le goût général, l’évaluation globale et l’intention d’achat des échantillons.
        REMARQUE : Le test d’acceptation par le consommateur est basé sur des tests hédoniques évaluant l’apparence visuelle, la couleur, la texture, l’odeur, le goût de la mer, le goût général, l’évaluation globale et l’intention d’achat sur une échelle de 1 à 9, où 1 est une mauvaise évaluation et 9 est une très bonne évaluation.
      3. Effectuer des tests sensoriels dans des cabines sensorielles individuelles dans un laboratoire d’analyse sensorielle (avec contrôle de la température et de l’éclairage). Fournissez des couverts, des serviettes et des tasses en verre d’eau minérale pour nettoyer le palais entre les échantillons.
        NOTE : Les dégustateurs sont âgés de 16 à 64 ans et viennent de tous les horizons (n > 80).
  2. Yaourt
    1. Extraction de pigments
      REMARQUE : Effectuez l’extraction du pigment selon la méthodologie décrite dans Pereira et al. (2020)18.
      1. Préparer le solvant d’extraction, tampon de phosphate de sodium à 0,1 M, avec du phosphate de sodium dibasique (0,03 M) et du phosphate de sodium monobasique (0,07 M). Réglez le pH à un pH de 6,8 à l’aide de NaOH ou de HCl.
      2. Peser 1 g de G. gracilis et ajouter 50 mL de tampon phosphate de sodium (pH 6,8). Homogénéiser pendant 10 min, suivi de 10 min de macération au mortier et au pilon.
      3. Transvaser la solution dans un tube et centrifuger pendant 20 min à 12 298 x g (4 °C).
      4. Mettez le surnageant en commun et ajoutez lentement 65 % de sulfate d’ammonium. Lorsque tout le sulfate d’ammonium est dissous, couvrez la solution d’une feuille d’aluminium et laissez-la précipiter à 4 °C pendant la nuit.
        ATTENTION : Voir la fiche de données de sécurité du sulfate d’ammonium livrée par le fournisseur.
      5. Centrifuger le précipité pendant 20 min à 12 298 x g (4 °C). Récupérer la pastille et la dissoudre dans de l’eau distillée (environ 5 ml).
      6. Effectuer la dialyse de l’extrait à l’aide d’une membrane tubulaire (14 kDa) contre l’eau pendant 24 h, suivie d’une lyophilisation. Conservez l’extrait lyophilisé à l’abri de la lumière à 4 °C jusqu’à utilisation.
    2. Préparation du yogourt
      1. Préparez le yaourt nature en mélangeant 1 L de lait pasteurisé, 120 g de yaourt nature, 20 g de sucre et 50 g de lait en poudre dans un thermomélangeur pendant 5 min, 50 °C, vitesse 3.
      2. Placez le mélange dans le bocal du thermomélangeur dans un incubateur à 37 °C pendant 12 h.
      3. Incorporez l’extrait en le mélangeant à du yogourt à une concentration de 0,21%. Conserver les échantillons dans des flacons individuels en verre à 4 °C jusqu’à l’analyse.
      4. Conserver des portions individuelles de yogourt sans pigment (témoin) à 4 °C jusqu’à l’analyse.
    3. Stabilité des couleurs
      REMARQUE : Évaluez la stabilité du pigment dans les yaourts par une analyse de la couleur pendant 12 jours. Effectuez une analyse des couleurs à l’aide d’un colorimètre à réflectance, d’un observateur standard à 2 degrés et d’un illuminant D65. Les résultats sont présentés sous forme de coordonnées CIELab avec les paramètres L (luminosité, noir - blanc, 0 - 100), a* (vert - rouge, -60 - 60) et b* (bleu - jaune, -60 - 60). Le paramètre a* a des valeurs positives pour les couleurs rougeâtres et des valeurs négatives pour les couleurs verdâtres. Le paramètre b* prend des valeurs positives pour les couleurs jaunâtres et des valeurs négatives pour les couleurs bleuâtres. L* est le paramètre de luminosité, qui est la propriété selon laquelle chaque couleur peut être considérée comme équivalente à un membre de l’échelle de gris entre le noir et le blanc33.
      1. Calibrer le colorimètre à l’aide d’une plaque en céramique blanche (L* 88,5, a* 0,32, b* 0,33) fournie par le fabricant.
      2. Remplissez une cellule avec environ 28 g de l’échantillon (ou du témoin) et analysez la couleur à l’aide d’un logiciel d’analyse des données de couleur.
        REMARQUE : Le logiciel utilisé pour l’analyse des données de couleur était le SpectraMagic NX.
      3. Effectuer des lectures 5 fois en trois exemplaires d’échantillonnage/contrôle.
    4. Analyse sensorielle
      REMARQUE : Effectuer une évaluation sensorielle des yogourts avec incorporation de pigments à l’aide d’un test triangulaire (ISO 4120, 2004)34 et d’une évaluation hédonique de la couleur, du goût et de l’appréciation globale.
      1. Pour le test triangulaire, donnez aux panélistes trois échantillons (un échantillon de yogourt avec pigment et deux échantillons de témoin, ou deux échantillons de yogourt avec pigment et un témoin) et demandez-leur de choisir un échantillon différent en fonction de l’arôme, de la texture et du goût. Fournir des échantillons dans des volumes similaires identifiés par des codes aléatoires à 3 chiffres.
      2. Pour l’évaluation hédonique du yogourt avec pigment, donnez aux panélistes un échantillon de yogourt avec pigment et demandez-leur d’évaluer la couleur, le goût et l’appréciation globale à l’aide d’une échelle hédonique à 9 points (de l’aversion extrême à l’appréciation extrême).

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Résultats

Activité antimicrobienne

Lors de l’interprétation des résultats obtenus, il convient de garder à l’esprit que plus le pourcentage d’inhibition est élevé, plus l’efficacité de l’extrait pour inhiber la croissance de cette souche spécifique est grande et, par conséquent, plus l’extrait est intéressant en tant qu’antimicrobien. Grâce à cette méthodologie, nous pouvons rapidement identifier les extraits qui ont la p...

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Discussion

Les tests d’activité antimicrobienne en milieu liquide sont utilisés pour évaluer l’efficacité des substances antimicrobiennes contre les micro-organismes en suspension dans un milieu liquide et sont généralement effectués pour déterminer la capacité d’une substance à inhiber la croissance ou à tuer les micro-organismes35,36,37,38. Ils sont utilisés pour évaluer la sensibilité des micro-organis...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par la Fondation portugaise pour la science et la technologie (FCT) à travers les projets stratégiques accordés au Centre des sciences marines et environnementales MARE-(UIDP/04292/2020 et UIDB/04292/2020) et au laboratoire associé ARNET (LA/P/0069/2020). FCT a également financé les bourses doctorales individuelles accordées à Marta V. Freitas (UI/BD/150957/2021) et Tatiana Pereira (2021. 07791. BD). Ce travail a également été soutenu financièrement par le projet HP4A - HEALTHY PASTA FOR ALL (co-promotion n° 039952), cofinancé par le FEDER - Fonds européen de développement régional, dans le cadre du programme Portugal 2020, à travers le programme opérationnel COMPETE 2020 - Compétitivité et internationalisation.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Éthanol absoluAga, Portugal64-17-5
Chlorure d’ammoniumPanReac12125-02-9
Amphotéricine BSigma-Aldrich1397-89-3
Balance analytiqueSartorius, TE124S22105307
Bacillus subtilis subsp. spizizeniiCollection allemande de micro-organismes et Cultures cellulaires (DSMZ)DSM 347
BiotinePanreac AppliChem58-85-5
CentrifugeuseEppendorf, 5810R5811JH490481
ChloramphénicolPanReac56-75-7
CO2 ChambreMemmertN/A
Lampes fluorescentes blanc froidOSRAM Lumilux SkywhiteN/A
Densitomètre McFarlandGrant InstrumentsN/A
DMEM moyenSigma-AldrichD5796
DMSOSigma-Aldrich67-68-5
DPPHSigma, Steinheim, Allemagne1898-66-4
Escherichia coli (DSM 5922)Collection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires (DSMZ)
Éthanol 96 %AGA-Portugal64-17-5
Acide éthylènediaminetétraacétique Sel disodique dihydraté (Na2EDTA)J.T.Baker6381-92-6
Sérum fœtal de veau (FBS)Sigma-AldrichF7524
Papier filtre (Whatman No.1)WhatmanWHA1001320
flaconsVWR International, Alcabideche, Portugal  ;N/A
Folin-CiocalteuVWR Chemicals31360.264
Acide gallique  ;Merck149-91-7
Oxyde de germanium (IV), 99,999 %AlfaAesar1310-53-8
Cellules HaCaT &ndash ; 300493CLS-Cell Lines Services, Allemagne  ;
Hot Plate Magnetic StirrerIKA, C-MAG HS706.090564
Sulfate de ferVWR Chemicals10124-49-9
Hotte à flux laminaireTelStar, Portugal526013
LB Medium  ;VWR ChemicalsJ106
Listonella anguillarumCollection allemande de micro-organismes et de cultures cellulaires (DSMZ)  ; DSM 21597
Chlorure de manganèseVWR Chemicals7773.01.5
Micropipettes  ;Eppendorf, PortugalN/A
MicroplaquesVWR International, Alcabideche, Portugal  ;10861-666
MicroplaquesGreiner738-0168
Microplaques (stériles)Fisher Scientific10022403
Lecteur de microplaques  ; Spectrophotomètre de microplaques Epoch, BioTek, Vermont, États-Unis1611151E
MTTSigma-Aldrich289-93-1
Muller-Hinton Broth (MHB)VWR Chemicals90004-658
Liant de four, FD11512-04490
Liant de four, BD11504-62615
PénicillineSigma-Aldrich1406-05-9
pH-mètre Inolab  ; VWR International, Alcabideche, Portugal  ;
pointes PippeteEppendorf, Portugal5412307
Pyrex Bottles Media Storage  ; VWR International, Alcabideche, Portugal  ;16157-169
Évaporateur rotatifHeidolph, Laborota 400080409287
RotavaporIKA HB10, VWR International, Alcabideche, Portugal07.524254
Carbonate de sodium (Na2CO3)Chem-Lab497-19-8
Chlorure de sodium (NaCl)  ;Normax Chem7647-14-5
Phosphate de sodium dibasiqueRiedel-de Haë ; n7558-79-4
SpectraMagic NXKonica Minolta, JaponLogiciel d’analyse des données colorimétriques
SpectrophotomètreEvolution 201, Thermo Scientific, Madison, WI, États-Unis5A4T092004
StreptomycineSigma-Aldrich57-92-1
ThiaminePanreac AppliChem59-43-8
Trypsine-EDTAGélose tryptique Sigma-AldrichT4049
(TSA)VWR ChemicalsICNA091010617
Bouillon de soja tryptique (TSB)  ;VWR Chemicals22091
Eau ultrapure  ;Advantage A10 Milli-Q lab, Merck, Darmstadt, AllemagneF5HA17360B
Pompe à videBuchi, SuisseFIS05-402-103
Vitamine B12Merck68-19-9
DSM592230049315212099

Références

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