Dépistage de drogues basé sur la transcriptomique rentable

Summary

Ce protocole décrit un flux de travail allant des cultures cellulaires ex vivo ou in vitro au prétraitement des données transcriptomiques pour un criblage rentable de médicaments basés sur le transcriptome.

Abstract

La transcriptomique permet d’obtenir des informations complètes sur les programmes cellulaires et leurs réponses aux perturbations. Malgré une baisse significative des coûts de production et de séquençage des bibliothèques au cours de la dernière décennie, l’application de ces technologies à l’échelle nécessaire au criblage des médicaments reste prohibitive, ce qui entrave l’immense potentiel de ces méthodes. Notre étude présente un système rentable de criblage de médicaments basé sur le transcriptome, combinant des cultures de perturbation miniaturisées avec une transcriptomique mini-en vrac. Le protocole mini-bulk optimisé fournit des signaux biologiques informatifs à une profondeur de séquençage rentable, ce qui permet un criblage approfondi de médicaments connus et de nouvelles molécules. En fonction du traitement choisi et du temps d’incubation, ce protocole permettra d’obtenir des banques de séquençage dans un délai d’environ 2 jours. En raison de plusieurs points d’arrêt au sein de ce protocole, la préparation de la bibliothèque, ainsi que le séquençage, peuvent être effectués indépendamment du temps. Il est possible de traiter simultanément un grand nombre d’échantillons ; La mesure de jusqu’à 384 échantillons a été testée sans perte de qualité des données. Il n’y a pas non plus de limites connues au nombre d’affections et/ou de médicaments, malgré la prise en compte de la variabilité des temps d’incubation optimaux des médicaments.

Introduction

Le développement de nouveaux médicaments est un processus complexe et chronophage qui implique l’identification de médicaments potentiels et de leurs cibles, l’optimisation et la synthèse de candidats-médicaments, et le test de leur efficacité et de leur innocuité dans le cadre d’essais précliniques et cliniques¹. Les méthodes traditionnelles de criblage de médicaments, c’est-à-dire l’évaluation systématique de bibliothèques de composés candidats à des fins thérapeutiques, impliquent l’utilisation de modèles animaux ou de tests cellulaires pour tester les effets sur des cibles ou des voies spécifiques. Bien que ces méthodes aient permis d’identifier des médicaments candidats, elles n’ont souvent pas fourni suffisamment d’informations sur les mécanismes moléculaires complexes sous-jacents à l’efficacité des médicaments, ainsi que sur leur toxicité et leurs mécanismes d’effets secondaires potentiels.

L’évaluation des états transcriptionnels à l’échelle du génome présente une approche puissante pour surmonter les limites actuelles du criblage des médicaments, car elle permet des évaluations complètes de l’expression des gènes en réponse aux traitements médicamenteux². En mesurant les transcrits d’ARN exprimés à l’échelle du génome à un moment donné, la transcriptomique vise à fournir une vue holistique des changements transcriptionnels qui se produisent en réponse aux médicaments, y compris les changements dans les modèles d’expression génique, l’épissage alternatif et l’expression de l’ARN non codant³. Ces informations peuvent être utilisées pour déterminer les cibles des médicaments, prédire l’efficacité et la toxicité des médicaments et optimiser les schémas posologiques et de traitement des médicaments.

L’un des principaux avantages de la combinaison de la transcriptomique et du criblage non biaisé des médicaments est la possibilité d’identifier de nouvelles cibles médicamenteuses qui n’ont pas été envisagées auparavant. Les approches conventionnelles de criblage de médicaments se concentrent souvent sur des molécules ou des voies cibles établies, ce qui entrave l’identification de nouvelles cibles et peut entraîner la mise en place de médicaments ayant des effets secondaires imprévus et une efficacité limitée. La transcriptomique peut surmonter ces limites en fournissant des informations sur les changements moléculaires qui se produisent en réponse au traitement médicamenteux, en découvrant des cibles ou des voies potentielles qui n’auraient peut-être pas été envisagées auparavant².

En plus de l’identification de nouvelles cibles médicamenteuses, la transcriptomique peut également être utilisée pour prédire l’efficacité et la toxicité des médicaments. En analysant les modèles d’expression génique associés aux réponses aux médicaments, il est possible de développer des biomarqueurs qui peuvent être utilisés pour prédire la réponse d’un patient à un médicament ou à un schéma thérapeutique particulier. Cela peut également aider à optimiser la posologie des médicaments et à réduire le risque d’effets secondaires indésirables⁴.

Malgré ses avantages potentiels, le coût de la transcriptomique reste un obstacle important à son application généralisée dans le dépistage des drogues. L’analyse transcriptomique nécessite un équipement spécialisé, une expertise technique et une analyse des données, ce qui peut rendre difficile l’utilisation de la transcriptomique pour les petites équipes de recherche ou les organisations disposant d’un financement limité dans le dépistage des médicaments. Cependant, le coût de la transcriptomique n’a cessé de diminuer, ce qui la rend plus accessible aux communautés de recherche. De plus, les progrès de la technologie et des méthodes d’analyse des données ont rendu la transcriptomique plus efficace et plus rentable, ce qui en a encore accru l’accessibilité².

Dans ce protocole, nous décrivons un système exploratoire de grande dimension pour le criblage de médicaments basé sur le transcriptome, combinant des cultures de perturbation miniaturisées avec une analyse transcriptomique en mini-vrac ^5,6. Avec ce protocole, il est possible de réduire le coût par échantillon à 1/6^ème du coût actuel des solutions commerciales pour le séquençage de l’ARNm pleine longueur. Le protocole ne nécessite que des équipements de laboratoire standard, la seule exception étant l’utilisation de technologies de séquençage à lecture courte, qui peuvent être externalisées si les instruments de séquençage ne sont pas disponibles en interne. Le protocole mini-bulk optimisé fournit des signaux biologiques riches en informations à une profondeur de séquençage rentable, ce qui permet un criblage approfondi de médicaments connus et de nouvelles molécules.

L’objectif de l’expérience est de dépister l’activité des médicaments sur les PBMC dans différents contextes biologiques. Ce protocole peut être appliqué à n’importe quelle question biologique où plusieurs médicaments doivent être testés avec une lecture transcriptomique, donnant une vue à l’échelle du transcriptome de l’effet cellulaire du traitement.

Protocol

Ce protocole suit les directives des comités d’éthique locaux de l’Université de Bonn.

1. Préparation des tampons, des solutions et de l’équipement

1. Préparez les solutions et rassemblez les matériaux décrits dans le tableau des matériaux.
2. Chauffer le bain-marie à 37 °C et réchauffer le milieu de croissance complet (RPMI-1640 + 10 % de sérum de veau fœtal (FCS) + 1 % de pénicilline/streptomycine).
3. Pour le prélèvement de cellules, utilisez une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) glacée.
   REMARQUE : Gardez un environnement propre lorsque vous travaillez avec des cellules pour maintenir la stérilité.

2. Manipulation des cellules

NOTE : Un protocole détaillé pour la cryoconservation des cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC) à partir de sang humain se trouve au^{point 7}.

1. Décongélation et comptage des cellules
   1. Retirez les cryoflacons de l’azote liquide et décongelez-les au bain-marie à 37 °C pendant 2 à 3 min tout en les inversant doucement.
   2. Transférer les cellules décongelées dans un tube conique de 50 ml.
   3. Rincez le cryoflacon avec 1 mL de milieu de culture complet chaud et ajoutez cette solution goutte à goutte aux cellules du tube (1^ère étape de dilution).
   4. Répétez la dilution 1 :1 jusqu’à ce que vous atteigniez un volume de 32 mL (5 dilutions au total avec respectivement 1, 2, 4, 8 et 16 mL de milieu de culture complet chaud). Ajouter le milieu goutte à goutte pour réduire la perturbation cellulaire tout en agitant légèrement le tube conique.
   5. Centrifuger la suspension cellulaire pendant 5 min (300 x g, 20 °C) et retirer le surnageant en inclinant doucement le tube conique d’un seul mouvement fluide.
   6. Remettre les cellules en suspension dans 3 mL de milieu de culture complet chaud et procéder au comptage des cellules.
   7. Pour le comptage, mélangez 10 μL de suspension cellulaire avec du bleu de trypan (dilution de 1 :2 à 1 :10 selon la densité de la suspension cellulaire) pour distinguer les cellules vivantes des cellules mortes pendant le comptage. Les cellules mortes ou endommagées apparaîtront bleues en raison de l’absorption du colorant, tandis que les cellules vitales ne sont pas colorées.
      REMARQUE : Le bleu de trypan est légèrement cytotoxique, les cellules colorées ne doivent pas être stockées plus de 5 minutes.
   8. Comptez les cellules à l’aide d’un compteur de cellules automatisé ou d’une chambre de comptage en utilisant 10 μL de solution cellulaire colorée.
      1. Lors de l’utilisation de la chambre cellulaire améliorée par Neubauer, comptez toutes les cellules à l’intérieur des quatre grands carrés situés aux coins et utilisez l’équation suivante pour calculer la concentration de la suspension cellulaire.
         
   9. Diluer les cellules jusqu’à une concentration finale de 1 x 10⁶ cellules/mL avec un milieu de culture complet chaud. Centrifuger uniquement si le volume requis est inférieur à 3 mL et remettre en suspension la pastille cellulaire au bon volume.
2. Ensemencement et traitement cellulaire
   1. Ensemencer 100 μL de suspension cellulaire par puits dans une plaque de culture cellulaire à 96 puits (1 x 10⁵ cellules/puits).
      REMARQUE : Le nombre de cellules pour l’ensemencement a été optimisé pour les cultures PBMC. Bien que de faibles concentrations cellulaires ne produisent pas une quantité suffisante d’ARN pour le séquençage, un nombre excessif de cellules augmentera le risque de lyse cellulaire sous-optimale et d’inhibition de la réaction de transcription inverse.
   2. Préparer des dilutions de médicaments à une concentration deux fois supérieure à celle utilisée pour le traitement (2x). Choisir le solvant en fonction de la solubilité du composé, de préférence milieu de culture complet.
      REMARQUE : Le PBS ou le diméthylsulfoxyde (DMSO) peut être utilisé si une solubilité suffisante ne peut être atteinte autrement. La concentration maximale de DMSO dans le volume d’incubation résultant ne doit pas dépasser 0,5 % pour éviter la cytotoxicité induite par le solvant.
   3. Ajouter 100 μL de la dilution 2x du médicament (concentration finale dans le puits 1X) et incuber à 37 °C pendant la durée définie.
      NOTA : Des investigations complémentaires doivent être menées afin d’établir le temps d’incubation optimal du médicament et d’exclure les mécanismes potentiels de cytotoxicité.
3. Prélèvement et lyse cellulaires
   1. Centrifuger la plaque de culture cellulaire pendant 10 min (300 x g, 20 °C). Retirez délicatement le surnageant à l’aide d’une pompe à vide en maintenant la plaque en biais (30°-45°) tout en dirigeant la pointe vers le coin bas du puits pour éliminer le moins de cellules possible.
   2. Lavez les cellules en ajoutant 200 μL de PBS glacé dans chaque puits et centrifugez la plaque pendant 5 min (300 x g, 4 °C). Retirez le surnageant à l’aide d’une pompe à vide, encore une fois, en gardant la plaque à un angle aigu pour éliminer autant de PBS que possible.
   3. Préparez le tampon de lyse comme décrit dans le tableau 1 pour le nombre de réactions (rxn) nécessaires, en ajoutant 10 % de dépassement.
   4. Ajouter 15 μL de tampon de lyse dans chaque puits et sceller la plaque avec un film d’étanchéité adhésif pour protéger les échantillons contre la contamination. Faire vortex la plaque avant de la centrifuger pendant 1 min (1000 x g, 4 °C) et incuber pendant 5 min sur glace.
   5. Prélever 6 μL de solution cellulaire lysée dans une plaque PCR et congeler brièvement le lysat cellulaire à -80 °C pour assurer une lyse cellulaire optimale. Assurez-vous d’éviter les multiples cycles de congélation des plaques.
      REMARQUE : POINT D’ARRÊT : Si la production d’ADNc n’est pas effectuée par la suite, le lysat cellulaire peut être stocké à -80 °C pendant plusieurs mois sans diminution considérable de la qualité de l’ARN.

3. Préparation de la bibliothèque pour le séquençage

1. Réaction de transcriptase inverse (RT)
   REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec de l’ARN, placez tous les échantillons sur de la glace et assurez-vous d’utiliser du matériel exempt de nucléases (articles en plastique stériles et jetables) et de l’eau.
   1. Préparez le mélange réactionnel RT tel que décrit dans le tableau 2 pour le nombre de réactions nécessaires, en ajoutant 10 % de dépassement. Faites tourner brièvement le mélange et faites-le tourner brièvement vers le bas. Conservez le mélange sur de la glace jusqu’à utilisation.
   2. Décongelez le lysat cellulaire à température ambiante (RT) et faites-le tourner brièvement pour recueillir tout le lysat cellulaire au fond de la plaque.
   3. Effectuer la dénaturation de l’ARNm sur un thermocycleur conformément au tableau 3.
   4. Sortez la plaque du thermocycleur et essorez-la brièvement pour recueillir le condensat potentiel. Ajouter 6 μL de mélange réactionnel RT dans chaque puits pour obtenir un volume final de 12 μL. Scellez la plaque pour la protéger et éviter l’évaporation, le vortex et la faire tourner.
   5. Placez la plaque sur le thermocycleur et démarrez le programme de réaction RT comme indiqué dans le tableau 3.
2. Pré-amplification
   1. Décongeler l’amorce d’ADN polymérase haute fidélité et de PCR in situ (ISPCR) à température ambiante.
   2. Préparez le mélange de préamplification selon le tableau 4 pour le nombre de réactions nécessaires, en ajoutant 10 % de dépassement. Faites tourner brièvement le mélange et faites-le tourner.
      REMARQUE : Le mélange enzymatique est stable à température ambiante pendant des heures.
   3. Essorez la plaque PCR, ajoutez 15 μL du mélange de préamplification dans chaque puits et scellez la plaque.
   4. Placez-le sur le thermocycleur et démarrez la réaction de pré-amplification comme indiqué dans le tableau 5.
      1. Ajustez le nombre de cycles en fonction de la teneur en ARN. Commencez par un nombre plus faible et augmentez si le rendement en ADNc n’est pas suffisant.
         REMARQUE : D’après notre expérience, le nombre optimal de cycles doit être établi pour chaque type de cellule, les conditions expérimentales et le traitement n’influenceront pas le nombre optimal de cycles. Nous recommandons donc d’établir expérimentalement le nombre optimal de cycles lors de l’établissement de ce protocole pour un nouveau type de cellule. En général, les cellules primaires nécessiteront un nombre de cycles plus élevé que les lignées cellulaires. POINT D’ARRÊT : Le produit de préamplification peut être stocké à - 20 °C.
3. Nettoyage de l’ADNc et contrôle de la qualité (CQ)
   REMARQUE : Le nettoyage des échantillons peut être effectué séquentiellement pour chaque plaque car les échantillons sont plutôt stables à ce stade. L’augmentation du nombre d’échantillons entraînera une durée plus longue du protocole, mais ne limitera pas le nombre d’échantillons pouvant être traités simultanément.
   1. Avant de commencer, amenez les billes de purification magnétique à température ambiante et à vortex à grande vitesse pendant 1 min pour les remettre complètement en suspension.
   2. Ajouter 0,8 bille de purification magnétique v/v (20 μL) dans chaque puits et incuber à température ambiante pendant 5 min.
   3. Placez la plaque PCR sur une grille magnétique pendant 5 min jusqu’à ce que les billes soient complètement séparées. Retirez le surnageant avec précaution.
   4. En gardant la plaque sur la grille magnétique, ajoutez délicatement 100 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé pour laver les billes et incuber pendant 30 s. Utilisez une pipette de petit volume pour retirer le surnageant. Répétez l’opération pour une étape de lavage supplémentaire. Assurez-vous d’éliminer autant d’éthanol que possible.
   5. Faites sécher les billes à l’air libre sur la grille magnétique à température ambiante jusqu’à 5 minutes jusqu’à ce que l’éthanol soit complètement évaporé et que les billes ne soient plus brillantes.
   6. Retirer la plaque de la grille magnétique, remettre les billes en suspension dans 20 μL d’eau sans nucléase et incuber pendant 2 min.
   7. Placez à nouveau la plaque sur la grille magnétique jusqu’à ce que les perles soient séparées.
   8. Récupérer l’éluat dans une nouvelle plaque PCR pour le contrôle qualité de l’ADNc et le marquage.
   9. Effectuez un test TapeStation ou FragmentAnalyser pour évaluer la distribution granulométrique et la concentration de la banque d’ADNc (Recommandé : test TapeStation D5000). Pour plus de détails, consultez les instructions du fabricant. Il faut s’attendre à un rendement typique de 20 ng.
4. Tagmentation avec kit
   REMARQUE : D’autres protocoles de marquage peuvent être utilisés s’ils sont déjà établis.
   1. Diluer l’ADNc à une concentration finale de 150 à 300 pg/μL en utilisant de l’eau sans nucléase.
   2. Préprogrammez le thermocycleur conformément au tableau 6 pour assurer un démarrage immédiat de la réaction de marquage après l’ajout de l’ADNc au mélange enzymatique.
   3. Préparez le mélange de marquage selon le tableau 7 pour le nombre de réactions nécessaires, en ajoutant 10 % de dépassement.
   4. Verser 3 μL du mélange de marquage par réaction sur une nouvelle plaque PCR et ajouter 1 μL d’ADNc à chaque réaction.
   5. Démarrez la réaction de marquage immédiatement après l’ajout de l’ADNc.
   6. Inactiver la réaction en ajoutant 1 μL de tampon de marquage neutralisant (NT ; on peut également utiliser du dodécylsulfate de sodium (SDS) à 0,2 %.
5. PCR d’enrichissement
   1. Préparez le mélange d’enrichissement PCR Tableau 7 pour le nombre de réactions, en ajoutant 10 % de dépassement. (Recommandé : Nextera UDI réglé pour empêcher le saut d’index sur les cellules d’écoulement à motifs (par exemple, Illumina NovaSeq 6000)).
   2. Ajouter 9 μL du mélange de PCR d’enrichissement à chaque réaction pour un volume total de 14 μL.
   3. Exécutez le programme de PCR d’enrichissement conformément au tableau 8.
      REMARQUE : Pour la PCR d’enrichissement, 16 cycles sont standard. Si la qualité de l’ADNc est médiocre, des cycles supplémentaires peuvent être ajoutés.
6. Nettoyage et contrôle qualité
   1. Avant de commencer, amenez les billes de purification magnétiques à température ambiante et à vortex à grande vitesse pendant 1 min pour remettre complètement les billes en suspension.
   2. Ajouter 1,0 billes de purification magnétique v/v (14 μL) et incuber à température ambiante pendant 5 min.
   3. Placez l’assiette sur une grille magnétique et attendez 5 min jusqu’à ce que les perles soient complètement séparées. Retirez le surnageant avec précaution.
   4. En gardant la plaque sur la grille magnétique, ajoutez délicatement 100 μL d’éthanol à 80 % fraîchement préparé pour laver les billes et incuber pendant 30 s. Utilisez une pipette de petit volume pour retirer le surnageant. Répétez l’opération pour une étape de lavage supplémentaire. Assurez-vous d’éliminer autant d’éthanol que possible.
   5. Faites sécher les perles à l’air libre à température ambiante pendant 3 minutes ou jusqu’à ce qu’elles ne soient plus brillantes.
   6. Retirer la plaque de la grille magnétique, remettre les billes en suspension dans 20 μL d’eau sans nucléase et incuber pendant 2 min.
   7. Placez à nouveau la plaque sur la grille magnétique jusqu’à ce que les billes se séparent et récupérez l’éluat dans une nouvelle plaque PCR pour le contrôle qualité de la bibliothèque.
   8. Effectuez un test TapeStation ou Fragment Analyzer pour évaluer la distribution granulométrique et la concentration de la banque d’ADNc (recommandé : test haute sensibilité TapeStation D1000). Pour plus de détails, consultez les instructions du fabricant. En moyenne, il faut s’attendre à un rendement de 10 ng.
      REMARQUE : POINT D’ARRÊT : Le produit PCR peut être conservé à - 20 °C.

4. Séquençage et prétraitement des données

1. Séquençage
   REMARQUE : La directive suivante s’appliquera à tous les instruments Illumina pour le séquençage à lecture courte. Si l’instrumentation n’est pas disponible, le séquençage peut être effectué par une installation de séquençage externe. D’autres approches de séquençage pourraient également être utilisées. Pour simplifier, nous avons choisi de ne rapporter que la technologie de séquençage la plus utilisée.
   REMARQUE : Les étapes suivantes liées à l’utilisation du logiciel décrivent la procédure sur un séquenceur Illumina NovaSeq6000.
   1. Regrouper des bibliothèques indexées de manière unique dans un rapport équimolaire selon les résultats obtenus à l’étape 3.6.8.
   2. Mesurer la concentration de la piscine finale à l’aide d’un test à haute sensibilité pour calculer la molarité de l’échantillon comme suit :
      
   3. Charger la cellule d’écoulement selon les spécifications de l’instrument et l’optimisation expérimentale. Le tableau 9 donne des exemples de concentrations de charge d’instruments courants.
   4. En touchant l’écran, sélectionnez Séquence pour lancer la configuration de l’exécution.
   5. Suivez les instructions à l’écran et chargez la cellule d’écoulement, la cartouche séquence par synthèse, la cartouche de clustering, la cartouche tampon et assurez-vous que les conteneurs à déchets sont vides.
   6. Une fois que tous les réactifs ont été reconnus par l’instrument, cliquez sur Run Setup (Exécuter la configuration). Définissez ici le nom de l’exécution et le dossier de sortie pour stocker les données.
   7. Définissez les détails de séquençage comme appariés avec les deux lectures de 51 pb. Deux lectures d’index sont également séquencées avec 8 pb chacune.
   8. Appuyez sur Vérifier et après avoir vérifié si tous les détails du séquençage sont corrects, appuyez sur Démarrer l’exécution.
      REMARQUE : La profondeur de séquençage recommandée est de 5 x 10⁶ lectures/échantillon, avec un minimum de 1 x 10⁶ lectures/échantillon.
2. Pré-traitement des données
   1. Transformez les données brutes de séquençage au format FASTQ et démultiplexez en fonction des index d’échantillons avec l’outil Bcl2Fastq2. Effectuez le démultiplexage avec les paramètres par défaut. Pour obtenir des instructions détaillées sur Bcl2Fastq2, consultez le manuel de référence.
      REMARQUE : La conversion et le démultiplexage FASTQ sont généralement effectués par l’installation de séquençage si le séquençage n’est pas effectué en interne. Les installations de séquençage fournissent généralement un FASTQ démultiplexé pour un traitement ultérieur.
   2. Plusieurs options sont disponibles pour l’alignement des données et la quantification de l’abondance des lectures de séquençage (recommandé : pipeline de séquençage de l’ARN nf-core (https://nf-co.re/rnaseq)). Le pipeline offre plusieurs options, utilisez le paramètre par défaut avec STAR⁸ comme aligné et Salmon⁹ pour quantifier l’abondance du transcrit.
   3. REMARQUE : Pour une analyse bioinformatique plus poussée, plusieurs méthodes sont disponibles. Il n’entre pas dans le cadre de ce protocole de couvrir tous les (Recommandé : DEseq2 pipeline¹⁰). Un script standard basé sur le workflow DEseq2 que nous avons développé est disponible sur GitHub (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Results

Suivant le protocole rapporté, les PBMC humains ont été ensemencés, traités avec différents médicaments immunomodulateurs et, après différents temps d’incubation, récoltés pour une analyse transcriptomique en vrac à l’aide du protocole de séquençage (Figure 1).

Les concentrations idéales de médicaments et les temps d’incubation des composés d’essai doivent être identifiés en amont de ce protocole à l’aide de stratégies expérimentales complémentaires et sur la base de la question scientifique spécifique. Dans la plupart des cas, une incubation de 2 à 4 h et de 24 h devrait fournir une représentation des réponses transcriptionnelles précoces et tardives au traitement.

Les résultats les plus importants pour évaluer les exécutions correctes du protocole sont l’ADNc et les QC de la bibliothèque (Figure 2 et Figure 3). Le profil d’ADNc doit avoir une large distribution avec une taille moyenne de > 1000 pb (Figure 2), une taille moyenne inférieure ou une accumulation de molécules à faible poids moléculaire (Figure 4) pourrait indiquer un faible apport d’ARN ou une dégradation de l’ARN.

La préparation d’une bonne bibliothèque de séquençage est également une étape importante du protocole ; les bibliothèques post-marquage devraient avoir une distribution assez étroite de l’ordre de 250 pb (Figure 3) ; Les fragments plus longs seront moins performants lors du séquençage (Figure 5).

Après le séquençage, les fichiers FASTQ bruts sont alignés sur le génome de référence approprié (par exemple, humain ou souris) et l’abondance des transcrits est quantifiée pour chaque échantillon (voir pipeline de séquençage de l’ARN nf-core (https://nf-co.re/rnaseq)). Une analyse exploratoire des données sera maintenant effectuée pour vérifier la qualité globale des données. Les données alignées devraient permettre de capturer un grand nombre de gènes codant pour des protéines, car seul l’ARN polyadénylé sera capturé avec ce protocole (Figure 6A). Dans les échantillons humains, nous prévoyons de capturer entre 15000 et 20000 transcrits (cette valeur est basée sur l’annotation du génome humain de référence GENCODE 27¹¹). D’autres analyses exploratoires des données peuvent inclure l’analyse en composantes principales (ACP). Ici, la structure sous-jacente des données peut être visualisée dans un graphique bidimensionnel. Dans la figure 6B, nous montrons un exemple de diagramme d’ACP ; Les points ici sont colorés par traitement, montrant trois groupes différents de conditions expérimentales conduisant à des profils transcriptomiques similaires. On peut également voir ici que les répétitions biologiques (points de la même couleur) sont transcriptionnellement similaires, ce qui montre une bonne robustesse du protocole. Les résultats présentés dans cette figure ont été générés avec un pipeline disponible sur GitHub en fonction du flux de travail DESeq2 (https://github.com/jsschrepping/RNA-DESeq2).

Figure 1 : Estimations du temps et flux de travail. (A) Estimations du temps de ce protocole pour une exécution avec 96 échantillons. (B) Schéma de chaque étape du protocole, de la décongélation des cellules jusqu’au prétraitement des données. Le diagramme doit être lu de haut en bas en suivant les flèches. Les flèches encerclées décrivent une répétition de l’étape. Les points rouges représentent les points d’arrêt décrits plus en détail dans le protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Résultats exemplaires pour les banques d’ADNc. Résultats d’une électrophorèse miniaturisée montrant la distribution de taille d’une banque d’ADNc exemplaire. Les signaux supérieurs et inférieurs représentent les marqueurs utilisés pour aligner l’échantillon. Les lignes bleues indiquent la taille moyenne des fragments (crochets bleus). Le profil de l’ADNc montre une large distribution avec une taille moyenne de > 1000 pb. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Résultats exemplaires pour les bibliothèques de séquençage. Résultats d’une électrophorèse miniaturisée montrant la distribution granulométrique de banques de séquençage préparées avec succès avec une distribution étroite et une taille moyenne d’environ 250 pb. Les signaux supérieurs et inférieurs représentent les marqueurs utilisés pour aligner l’échantillon. Les lignes bleues indiquent la taille moyenne des fragments (crochets bleus). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Résultats sous-optimaux exemplaires pour les banques d’ADNc. Résultats d’une électrophorèse miniaturisée montrant la distribution granulométrique d’une banque d’ADNc sous-optimale d’une taille moyenne de < 200 pb. Les signaux supérieurs et inférieurs représentent les marqueurs utilisés pour aligner l’échantillon. Les lignes bleues indiquent la taille moyenne des fragments (crochets bleus). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Résultats sous-optimaux exemplaires pour les bibliothèques de séquençage. Résultats d’une électrophorèse miniaturisée montrant la distribution granulométrique d’une banque de séquençage sous-optimale contenant des fragments plus longs de 200 à 1000 pb. Les signaux supérieurs et inférieurs représentent les marqueurs utilisés pour aligner l’échantillon. Les lignes bleues indiquent la taille moyenne des fragments (crochets bleus). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Analyse exploratoire des données. Résultats représentatifs de l’analyse exploratoire des données montrant l’effet de certains médicaments immunomodulateurs sur les PBMC. (A) Graphique à barres du nombre de gènes détectés (axes Y) séparés par type de gène (axes X). (B) PCA de tous les gènes de l’ensemble de données colorés par les différents traitements médicamenteux. Les points de la même couleur sont des répliques biologiques. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Réactif	Concentration	Volume [μL] /rxn
Chlorhydrate de guanidine	80 mM	7.50
Désoxynucléotides triphosphates (dNTP)	10 mM chacun	6.52
Apprêt SMART dT30VN	100 μM	0.33
Eau sans nucléase		0.65
Volume total		15.00

Tableau 1 : Tampon de lyse.

Réactif	Volume [μL] /rxn
Tampon SSRT II (5x)	2.00
TNT (100 mM)	0.50
Bétaïne (5 M)	2.00
MgCl2 (1 M)	0.14
SSRT II (200 U/μL)	0.25
Inhibiteur de l’ARNase (40 U/μL)	0.25
TSO-LNA (100 μM)	0.20
Eau sans nucléase	0.66
Volume total	6.00

Tableau 2 : Mélange réactionnel de transcriptase inverse (RT).

Dénaturation de l’ARNm
Pas	Température	Durée
Dénaturation de l’ARNm	95 °C	2 min (en anglais)
	sur la glace	2 min (en anglais)
Transcription inverse
Pas	Température	Durée
Transcription inverse	42 °C	Durée : 90 min
Inactivation enzymatique	70 °C	15 min (en anglais)
	4 °C	tenir

Tableau 3 : Programme de thermocycleur pour la dénaturation de l’ARNm et la transcriptase inverse (RT).

Réactif	Volume [μL] /rxn
ADN polymérase haute-fidélité	12.50
Amorce ISPCR (10 μM)	0.15
Eau sans nucléase	2.35
Volume total	15.00

Tableau 4 : Mélange de pré-amplification.

Escalier	Température	Durée
Dénaturation initiale	98 °C	3 min (en anglais)
Dénaturation	98 °C	20 s	16 – 18 cycles
Recuit	67 °C	20 s
Extension	72 °C	6 min (en anglais seulement)
	4 °C	tenir

Tableau 5 : Programme de thermocycleurs de préamplification.

Escalier	Température	Durée
Balisage	55 °C	8 min (en anglais)
	4 °C	tenir

Tableau 6 : Programme de thermocycleurs de marquage.

Mélange de marquage
Réactif	Volume [μL] /rxn
Mélange d’étiquetage d’amplicon (ATM)	1.0
Tampon d’ADN de marquage (TD)	2.0
Volume total	3.0
Mélange de PCR d’enrichissement
Réactif	Volume [μL] /rxn
ADN polymérase haute-fidélité	7.0
Apprêt d’indexation compatible Nextera	2.0
Volume total	9.0

Tableau 7 : Mélange de marquage et mélange de PCR d’enrichissement.

Escalier	Température	Durée
Démarrage à chaud	72 °C	5 min (en anglais)
Dénaturation initiale	98 °C	30 s
Dénaturation	98 °C	10 secondes	16 cycles
Recuit	60 °C	30 s
Extension	72 °C	1 min (en anglais)
Prolongation finale	72 °C	5 min (en anglais)
	4 °C	tenir

Tableau 8 : Programme de thermocycleurs PCR d’enrichissement.

Instrument	Concentration de charge
MiSeq v2	22 h
SuivantSeq 500/550	13 h 4
NovaSeq 6000	1250 pM

Tableau 9 : Exemples de concentrations de chargement d’instruments de séquençage courants.

Discussion

La découverte et le développement de médicaments peuvent grandement bénéficier de la vision holistique des processus cellulaires que la transcriptomique de masse peut fournir. Néanmoins, cette approche est souvent limitée par le coût élevé de l’expérience avec le protocole standard de séquençage de l’ARN en vrac, ce qui interdit son application dans les milieux académiques ainsi que son potentiel d’évolutivité industrielle.

Les étapes les plus critiques du protocole sont la décongélation des cellules et les étapes initiales de la préparation de la bibliothèque. Assurer une viabilité élevée des cellules après la décongélation est essentiel pour le succès des traitements et de l’analyse transcriptomique. Les premières étapes de la récolte cellulaire et de la préparation de la banque jusqu’à la synthèse de l’ADNc sont essentielles pour préserver l’intégrité de l’ARN. À ce stade, il est crucial de maintenir le lysat cellulaire sur la glace à tout moment et de traiter les échantillons le plus rapidement possible. Si une dégradation excessive de l’ARN est observée, les surfaces et l’équipement de laboratoire doivent être nettoyés avec des produits spécifiques pour inhiber toute activité de la RNase.

Le protocole décrit ici est actuellement optimisé pour le traitement médicamenteux sur PBMC à partir de donneurs sains pendant un maximum de 24 h. Pour réaliser l’expérience avec un type de cellule différent ou pour un temps d’incubation plus long, il peut être nécessaire d’optimiser le nombre de cellules pour les conditions d’ensemencement et de culture en conséquence.

Avec ce protocole, nous fournissons un flux de travail pour l’analyse transcriptomique lors d’un traitement médicamenteux sur PBMC en utilisant un équipement de laboratoire standard et sans avoir besoin de kits commerciaux. Avec cette approche et en évitant l’étape de purification de l’ARN, nous avons considérablement réduit les coûts permettant l’analyse parallèle d’un grand nombre de composés.

Parce que ce protocole est basé sur un test in vitro, sa principale limite est qu’il ne peut pas évaluer un traitement métabolique des médicaments qui pourrait conduire à une bioactivité différente. De plus, le nombre de transcrits capturés et la profondeur de séquençage seront inférieurs à ceux des méthodes transcriptomiques complètes en vrac standard, ce qui empêchera l’utilisation de ces données pour des applications nécessitant un contenu d’information plus élevé, telles que l’épissage différentiel ou la quantification de polymorphismes mononucléotidiques.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
50 mL tube conique	fisher scientific	10203001
Adhésif PCR Plaque Seals	Thermo Fisher Scientific	AB0558
Amplicon Tagment Mix (ATM)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Kit de préparation (96 échantillons)
Perles AMPure XP	Beckman Coulter	A 63881
Betaine  ;	Sigma-Aldrich	61962
Plaques 96 puits de qualité culture cellulaire	Thermo Fisher Scientific	260860
Pompe à vide pour culture cellulaire (VACUSAFE)	Integra Bioscience	158300
Mélange de désoxynucléotides triphosphates (dNTP) 10 mM chacun	Fermentas	R0192
DMSO	Sigma-Aldrich	276855
DTT (100 mM)	Invitrogen	18064-014
EDTA	Sigma-Aldrich	798681	pour cellules adhérentes
Éthanol	Sigma-Aldrich	51976
Sérum fœtal bovin	Thermo Fisher Scientific	26140079
Embouts filtrants (10 µ ; L)	Gilson  ;
Embouts filtrants (100 & micro ; L)	Gilson  ;
Embouts filtrants (20 & micro ; L)	Gilson  ;
Embouts filtrants (200 & micro ; L)	Gilson  ;
Chlorhydrate de guanidine	Sigma-Aldrich	G3272
Amorce ISPCR (10 µ ; M)	Biomers.net GmbH	SP10006	5&prime ;-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG T-3&prime ;
KAPA HiFi HotStart ReadyMix (2X)	KAPA Biosystems	KK2601
Chlorure de magnésium (MgCl2)  ;	Sigma-Aldrich	M8266
Support magnétique 96	Ambion	AM10027
Neutraliser le Tampon de Marquage (NT)  ;	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 échantillons), alternativement 0,2 % SDS
Amorce d’indexation compatible Nextera	Illumina
Eau sans nucléase	Invitrogen	10977049
PBS	Thermo Fisher Scientific	AM9624
PCR Plaques à 96 puits	Thermo Fisher Scientific	AB0600
Scelleuse de plaques PCR	Thermo Fisher Scientific	HSF0031
Pénicilline / Streptomycine  ;	Thermo Fisher Scientific	15070063
fluorimètre Qubit 4	Invitrogen	15723679
Inhibiteur de la RNase recombinante (40 U/ul)	TAKARA	2313A
RPMI-1640	Gibco	61870036	Si vous ne travaillez pas avec des PBMC, adaptez-vous au type de cellule.
SMART dT30VN	amorce Sigma-Aldrich		5' Bio-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACT30VN-3
Équipement de laboratoire standard		divers divers	p. ex. centrifugeuse, machine à glace, seau à glace, eau distillée, bain-marie
SuperScript II Transcriptase inverse (SSRT II)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
SuperScript II Tampon de transcriptase inverse (SSRT II) (5x)	Thermo Fisher Scientific	18064-014
Tampon d’ADN de marquage (TD)	Illumina	FC-131-1096	Nextera XT DNA Library Prep Kit (96 échantillons)
Système TapeStation 4200	Agilent	G2991BA
Thermocycleur (S1000)	Bio-Rad	1852148
TSO-LNA (100 uM)	Eurogentec		5' Biotine AAGCAGTGGTATCAACGCAGAG TACAT(G)(G){G
Vortex-Genie 2 Mélangeur	Sigma-Aldrich	Z258415