L’article décrit les méthodes et les réactifs nécessaires pour effectuer l’hybridation de l’hybridation de l’ARN en fluorescence sur montage entier (HCR ARN, WM-FISH) afin de révéler des informations sur la résolution spatiale et cellulaire des gènes des récepteurs chimiosensoriels dans l’antenne du moustique et le palpe maxillaire.
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Article de méthode
Hybridation Réaction en chaîne ARN Fluorescence intégrale Hybridation in situ de gènes chimiosensoriels dans les appendices olfactifs des moustiques
Dans cet article
Résumé
Résumé
Les moustiques sont des vecteurs efficaces de maladies mortelles et peuvent naviguer dans leur environnement chimique à l’aide de récepteurs chimiosensoriels exprimés dans leurs appendices olfactifs. Comprendre comment les récepteurs chimiosensoriels sont organisés spatialement dans les appendices olfactifs périphériques peut offrir des informations sur la façon dont l’odeur est codée dans le système olfactif des moustiques et éclairer de nouvelles façons de lutter contre la propagation des maladies transmises par les moustiques. L’émergence de l’hybridation in situ de troisième génération (HCR ARN WM-FISH) permet une cartographie spatiale et un profilage simultané de l’expression de plusieurs gènes chimiosensoriels. Ici, nous décrivons une approche par étapes pour effectuer l’ARN HCR WM-FISH sur l’antenne du moustique anophèle et le palpe maxillaire. Nous avons étudié la sensibilité de cette technique en examinant le profil d’expression des récepteurs olfactifs ionotropiques. Nous avons demandé si la technique HCR WM-FISH décrite était adaptée aux études multiplexées en attachant des sondes d’ARN à trois fluorophores spectralement distincts. Les résultats ont fourni la preuve que l’ARN HCR WM-FISH est robuste pour détecter simultanément plusieurs gènes chimiosensoriels dans l’antenne et les appendices olfactifs des palpes maxillaires. D’autres études attestent de l’adéquation de HCR WM-FISH pour le profilage de co-expression de cibles à ARN double et triple. Cette technique, lorsqu’elle est appliquée avec des modifications, pourrait être adaptable pour localiser des gènes d’intérêt dans les tissus olfactifs d’autres espèces d’insectes ou dans d’autres appendices.
Introduction
Les moustiques vecteurs tels que Anopheles gambiae s’appuient sur un riche répertoire de gènes chimiosensoriels exprimés dans leurs appendices olfactifs périphériques pour prospérer dans un monde chimique complexe et identifier les odeurs comportementales pertinentes émanant d’hôtes humains, détecter les sources de nectar et localiser les sites de ponte1. L’antenne du moustique et le palpe maxillaire sont enrichis de gènes chimiosensoriels qui pilotent la détection des odeurs dans ces appendices olfactifs. Trois classes principales de canaux ioniques ligand-dépendants pilotent la détection des odeurs dans les appendices olfactifs des m....
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Protocole
1. Considérations et préparation du matériel
- Décidez si le montage complet ou la cryo-section du tissu sera approprié. Ce protocole est optimisé pour l’imagerie in situ de l’ARN dans l’antenne du moustique anophèle et le palpe maxillaire sans cryo-section. Si les échantillons ont une épaisseur supérieure à 5 mm, il est recommandé de procéder à une cryo-section pour permettre la pénétration de la sonde.
- Identifiez les gènes d’intérêt et copiez les séquences, y compris les introns et les exons, à partir d’une base de données appropriée. Transcrire la séquence du gène en ARN pour la synthèse.
- Déterminez s’i....
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Résultats
Détection robuste des gènes chimiosensoriels dans l’antenne de l’anophèle
Nous avons étudié la sensibilité de la méthode HCR FISH (Figure 1) pour détecter l’expression des récepteurs chimiosensoriels dans les tissus olfactifs des moustiques. Guidés par les données de transcription de l’ARN rapportées précédemment sur l’antenne femelle du moustique anophèle, nous avons généré des sondes pour cibler une variété d’IR. Les valeurs moyennes de transcrit de qu.......
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Discussion
La troisième génération de réaction en chaîne d’hybridation (HCR) est remarquable par sa sensibilité et sa robustesse pour visualiser plusieurs cibles d’ARN8. HCR WM-FISH a été utilisé avec succès sur les embryons de drosophile, de poulet, de souris et de poisson-zèbre ainsi que sur les larves de nématodes et de poissons-zèbres 10,16,17. Les antennes de moustiques et les palpes maxillaires sont g.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Nous remercions Margo Herre et le laboratoire de Leslie Vosshall d’avoir partagé leur protocole d’hybridation in-situ pour les appendices olfactifs d’Aedes aegypti . Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health à C.J.P. (NIAID R01Al137078), une bourse HHMI Hanna Gray à J.I.R, une bourse Johns Hopkins Postdoctoral Accelerator à J.I.R, et une bourse postdoctorale de l’Institut de recherche sur le paludisme Johns Hopkins à J.I.R. Nous remercions l’Institut de recherche sur le paludisme Johns Hopkins et Bloomberg Philanthropies pour leur soutien.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Tampon d’amplification | Molecular Instruments | Molecular Instruments, Inc. | Hybridation in situ + immunofluorescence | 50 mL |
| de chlorure de calcium (CaCl2) 1M ; | Sigma-Aldrich ; | 21115-100ML | |
| Chitinase | Sigma-Aldrich | C6137-50UN | |
| Chymotrypsine | Sigma-Aldrich | CHY5S-10VL ; | |
| Diméthylsulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | 472301 | |
| Eppendorf | tube VWR | 20901-551 | 1,5 mL |
| Pince | Dumont | 11251 | Numéro 5 |
| Pointe de chargement | de gel Costar | 4853 | 1-200 µ ; Pointe L |
| Épingles à cheveux ; | Instruments moléculaires | Molecular Instruments, Inc. | Hybridation in situ + immunofluorescence | h1 et h2 initiateurs splits |
| HEPES (1M) | Sigma-Aldrich | H0887 | |
| Sonde IR25a | Molecular Instruments Sobe | Set ID : PRK149 ; | AGAP010272 |
| Sonde IR41t.1 | Molecular Instruments | ; ID du jeu de sondes : PRK978 | AGAP004432 |
| Sonde IR64a | Molecular Instruments ID | du kit de sondes : PRK700 ; | AGAP004923 |
| Sonde IR75d | Molecular Instruments Kit | sondes ID : PRK976 | AGAP004969 |
| Sonde IR76b | Molecular Instruments ID | : PRI998 | Sonde AGAP011968 |
| IR7t | Molecular Instruments Sobe | Set ID : PRL355 | Sonde |
| AGAP002763 IR8a | Molecular Instruments | : PRK150 | AGAP010411 |
| LoBind Tubes | VWR | 80077-236 | 0,5 mL DN/ARN LoBind |
| Tubes Chlorure de magnessium (MgCl2) | 1M Thermo Fisher | AM9530G | |
| Methanol | Fisher ; | A412-500 | |
| Eau sans nucléases | Thermo Fisher | 43-879-36 | |
| Nutator | Denville Scientific | Model 135 | 3-D Mini |
| rocker Orco Probe | Molecular Instruments Set | sondes ID PRD954 | AGAP002560 |
| Paraformaldéhyde (20 %) | )Services de microscopie électronique ; | 15713-S | |
| Solution saline tamponnée au phosphate (10X PBS) | Thermo Fisher | AM9625 | |
| Tampon d’hybridation de sonde | Molecular Instruments | https://www.molecularinstruments.com/ | 50 mL |
| Tampon de lavage de sonde | Molecular Instruments Molecular Instruments | , Inc. | Hybridation in situ + immunofluorescence | 100 mL |
| Proteinase-K | Thermo Fisher | AM2548 | |
| Citrate salin-sodique (SSC) 20x ; | Thermo Fisher | 15-557-044 | |
| SlowFade Diamond | Thermo Fisher ; | S36972 | solution de montage |
| Chlorure de sodium (NaCl) 5M | Invitrogen | AM9760G | |
| Triton X-100 ; (10 %) | Sigma-Aldrich ; | 93443 | |
| Tween-20 (10 % ) | Teknova | T0027 | |
| Verre de montre | Carolina | 742300 | ; 1 5/8" carré ; transparent |
Références
- Konopka, J. K., et al. Olfaction in Anopheles mosquitoes. Chem Senses. 46, (2021).
- Raji, J. I., Potter, C. J. Chemosensory ionotropic receptors in human host-seeking mosquitoes. Curr Opin Insect Sci. 54, 100967(2022).
- Young, A. P., Jackson, D. J., Wyeth, R. C.
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Réimpressions et autorisations
