Détection et quantification des mono-rhamnolipides et des di-rhamnolipides produits par Pseudomonas aeruginosa

Résumé

Pseudomonas aeruginosa produit les biosurfactants rhamnolipides. La chromatographie sur couche mince détecte et détermine la proportion de mono- et di-rhamnolipides produits par chaque souche. La quantification des rhamnolipides totaux consiste à évaluer les équivalents de rhamnose présents dans ces biosurfactants extraits des surnageants de culture à l’aide de la méthode de l’orcinol.

Résumé

La bactérie environnementale Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste à forte résistance aux antibiotiques qui représente un danger pour la santé. Cette bactérie produit des niveaux élevés de biosurfactants connus sous le nom de rhamnolipides (RL), qui sont des molécules ayant une valeur biotechnologique significative mais qui sont également associées à des traits de virulence. À cet égard, la détection et la quantification de l’apprentissage par renforcement peuvent être utiles tant pour les applications biotechnologiques que pour les projets de recherche biomédicale. Dans cet article, nous montrons étape par étape la technique permettant de détecter la production des deux formes de RL produites par P. aeruginosa à l’aide de la chromatographie sur couche mince (CCM) : les mono-rhamnolipides (mRL), molécules constituées d’un dimère d’acides gras (principalement C10-C10) lié à une fraction rhamnose, et les di-rhamnolipides (dRL), molécules constituées d’un dimère d’acide gras similaire lié à deux fractions de rhamnose. De plus, nous présentons une méthode pour mesurer la quantité totale de RL basée sur l’hydrolyse acide de ces biosurfactants extraits d’un surnageant de culture de P. aeruginosa et la détection ultérieure de la concentration de rhamnose qui réagit avec l’orcinol. La combinaison des deux techniques peut être utilisée pour estimer la concentration approximative de mRL et de dRL produite par une souche spécifique, comme illustré ici avec les souches types PAO1 (phylogroupe 1), PA14 (phylogroupe 2) et PA7 (phylogroupe 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie environnementale et un pathogène opportuniste très préoccupant en raison de sa production de traits associés à la virulence et de sa forte résistance aux antibiotiques ^1,2. Un métabolite secondaire caractéristique produit par cette bactérie est le biosurfactant RL, qui est produit de manière coordonnée avec plusieurs traits associés à la virulence tels que la phénazine pyocyanine, un antibiotique à activité redox et la protéase élastase³. Les propriétés tensio-actives et émulsifiantes de RL ont été exploitées dans différentes applications industrielles et sont actuellement commercialisées⁴.

La plupart des souches de P. aeruginosa, appartenant aux phylogroupes 1 et 2, produisent deux types de RL : mRL, qui consiste en un fragment de rhamnose lié à un dimère d’acide gras principalement de 10 atomes de carbone, et dRL, qui contient un fragmentaire de rhamnose supplémentaire lié au premier rhamnose⁴ (voir figure 1). Cependant, il a été rapporté que deux phylogroupes mineurs de P. aeruginosa (groupes 3 et 5) ne produisent que^{mRL 5,6}. Les deux types de RL contiennent un mélange de dimères d’acides gras, qui, comme nous l’avons mentionné, sont principalement en C10-C10, mais de plus petites proportions de molécules contenant des dimères en C12-C10, C12-C12 et C10-C12:1 sont également produites. La caractérisation des congénères RL produits par différentes souches à l’aide de la HPLC MS/MS a été rapportée ^7,8. Les méthodes décrites dans ce travail ne peuvent faire la différence entre mRL et dRL mais ne peuvent pas être utilisées pour la caractérisation des congénères RL.

P. aeruginosa et certaines espèces de Burkholderia sont des producteurs naturels de RL⁹, mais la première bactérie est le producteur le plus efficace. Cependant, la LR utilisée commercialement est actuellement produite dans les dérivés de Pseudomonas putida KT2440 exprimant les gènes de P. aeruginosa pour éviter l’utilisation de cet agent pathogène opportuniste^10,11. La détection et la quantification de la LR produite par P. aeruginosa sont d’une grande importance pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression des caractères liés à la virulence¹², dans la caractérisation des souches appartenant aux clades 3 ou 5¹³, et pour la construction de dérivés de P. aeruginosa qui surproduisent ces biosurfactants tout en ayant une virulence réduite¹⁴. La production de biosurfactants par différents micro-organismes a été détectée sur la base de certaines caractéristiques générales de ces composés, telles que la méthode de la goutte d’effondrement ou l’indice d’émulsification¹⁵, mais ces méthodes ne sont ni précises ni spécifiques¹⁶.

Ici, nous décrivons le protocole de détection des mRL et dRL en utilisant l’extraction liquide des RL totaux des surnageants de culture de différentes souches de type P. aeruginosa et la séparation des deux types de RL à l’aide de la TLC. Dans cette méthode, le RL extrait du surnageant de culture est séparé par sa solubilité différentielle dans les solvants utilisés pour la CCM, provoquant une migration différentielle sur la plaque de gel de silice. Ainsi, les mRL ont une migration plus rapide que les dRL, et ils peuvent être détectés comme des points séparés lorsque les plaques sont séchées et colorées avec du α-naphtol.

La méthode décrite ici pour détecter mRL et dRL par TLC est basée sur un article¹⁷ précédemment publié, qui est facile à réaliser et ne nécessite pas d’équipement coûteux. Cette méthode s’est avérée utile pour détecter le RL dans divers isolats de P. aeruginosa ¹³ à l’aide de témoins appropriés, tels qu’un mutant dérivé de P. aeruginosa incapable de produire un RL. Cependant, ce n’est pas la méthode privilégiée pour caractériser les nouveaux biosurfactants produits par des bactéries autres que Pseudomonas aeruginosa en raison de son manque de spécificité.

De plus, une méthode de quantification des équivalents de rhamnose de la LR totale extraite d’un surnageant de culture de P. aeruginosa est présentée. Cette méthode quantifie ces biosurfactants en fonction de la réaction de l’orcinol avec les sucres réducteurs, ce qui permet d’obtenir un produit qui peut être mesuré par spectrophotométrie à 421 nm, comme décrit précédemment¹⁸. Étant donné que la réaction avec l’orcinol n’est pas spécifique au rhamnose, il est important d’effectuer cette méthode avec le RL extrait du surnageant de culture qui ne contient pas de quantités significatives d’autres molécules contenant du sucre, telles que les lipopolysaccharides (LPS). Un mélange chloroforme/méthanol acidifié est utilisé ici pour l’extraction liquide du RL¹⁸, mais l’acétate d’éthyle peut également être utilisé, et l’extraction en phase solide (SPE) donne de très bons résultats¹⁹. La méthode orcinol décrite ici ne nécessite pas d’équipement sophistiqué et peut fournir des résultats fiables si elle est effectuée avec un soin particulier dans la préparation des échantillons analysés, comme nous l’avons vu. Pour assurer une bonne préparation de l’échantillon, il est important d’inclure un mutant de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapable de produire RL²⁰ et d’effectuer trois répétitions biologiques et trois répétitions techniques pour chaque détermination.

Il y a eu une controverse importante dans la littérature^16,21 concernant la détermination de la RL par la méthode de l’orcinol, certaines études suggérant que la production de RL est surestimée et que le test manque de spécificité pour le rhamnose, ce qui pourrait permettre de détecter d’autres sucres. Cependant, nous démontrons ici que les méthodes décrites peuvent être précises et spécifiques dans des conditions appropriées. De plus, à des fins de comparaison avec les procédures décrites dans cet article, nous utilisons la détection UPLC-MS/MS d’un étalon dRL et démontrons que des résultats similaires sont obtenus avec la méthode orcinol. Le protocole détaillé de quantification de l’apprentissage par renforcement à l’aide de cette méthode est inclus dans le fichier supplémentaire 1.

Ces protocoles sont illustrés à l’aide des souches types PAO1 (phylogroupe 1), PA14 (phylogroupe 2) et PA7 (phylogroupe 3). Ces souches ont été choisies parce qu’elles sont bien caractérisées et produisent différents profils RL.

Protocole

Cette procédure est schématisée dans la figure supplémentaire 1. Les réactifs et l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Détection de mRL et dRL dans les surnageants de culture de P. aeruginosa à l’aide de la CCM

1. Commencer avec le bouillon centrifugé de la souche d’intérêt P . aeruginosa , cultivé en milieu liquide pendant 24 h (pour atteindre la phase stationnaire de croissance où RL est produit). En règle générale, ces cultures contiennent 1 x 10⁹ bactéries par ml.
2. Ajustez le pH de la culture à 2 en utilisant du HCl concentré.
3. Mettre 5 mL du surnageant de culture acidifié dans un tube de polypropylène de 50 mL et ajouter 5 mL d’un mélange chloroforme/méthanol 2:1.
4. Agiter le tube par inversion trois fois, à chaque fois pendant 10 s, et laisser le tube sans inversion pendant 2 min entre chaque agitation.
5. Laissez le tube sans agitation pendant environ 3 h jusqu’à ce que les deux phases soient séparées, ou centrifugez-le pendant 10 min à 3 000 x g à 4 °C.
6. Transférez la phase organique (couche inférieure) dans un tube propre et laissez le tube dans une hotte d’extraction jusqu’à ce que la sécheresse se produise.
7. Répétez le processus à partir de l’étape 1.3, en mettant la phase organique du deuxième chloroforme : l’extraction au méthanol, dans le tube qui a été utilisé lors de la première extraction.
8. Évaporez la phase organique jusqu’à ce qu’il reste 1 mL ou 1,5 mL. Transférez ce volume dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et évaporez le solvant jusqu’à ce qu’il soit sec pendant la nuit.
9. Ajouter 50 μL de méthanol dans le tube séché pour remettre en suspension le RL.
10. Effectuer une chromatographie sur couche mince sur des plaques de gel de silice.
    REMARQUE : La taille de la plaque CCM doit être coupée en fonction du nombre d’échantillons qui seront analysés. Chaque échantillon doit être appliqué à 1,5 cm et le point d’application doit être à 1 cm du bord de la plaque (tracez une ligne horizontale avec un crayon).
11. Appliquez 5 μL de chaque échantillon à l’aide d’une micropipette de 10 μL.
12. La phase liquide TLC est constituée d’un mélange 65:15:2 de chloroforme, de méthanol et d’acide acétique. Pour préparer 35 mL de ce mélange, mélangez 26 mL de chloroforme, 6 mL de méthanol et 0,8 mL d’une solution mère à 20 % d’acide acétique. Mélangez ces solvants et placez-les dans la chambre TLC fermée pendant au moins 10 minutes avant de commencer la chromatographie, afin que l’atmosphère soit saturée de solvants volatils.
13. Placez la plaque CCM dans la chambre, en évitant tout contact avec le point où les échantillons ont été appliqués.
14. Fermez la chambre et laissez le CCM jusqu’à ce que le solvant atteigne 1 cm avant le bord de la plaque. À ce stade, retirez la plaque et laissez-la sécher (un flux d’air peut être appliqué pour accélérer le processus).
15. Préparez une solution de α-naphtol en dissolvant 5 g de ce composé dans 33 mL d’éthanol. Une fois dissous, ajoutez 127,5 mL d’éthanol, 12,6 mL d’eau et 20,5 mL_{de H2}SO₄ froid.
16. Pour détecter la présence de mRL et de dRL, vaporiser la solution de α-naphtol sur la plaque de la hotte d’extraction et placer la plaque pulvérisée dans un four à 85 °C pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que la marque rosâtre de RL soit apparente.
17. À l’aide d’une image de la CCM, calculer la proportion de mono- et di-RL présents dans chaque échantillon à l’aide d’un logiciel qui détecte la densité de chaque point.

2. Quantification de la quantité totale de RL en mesurant les équivalents de rhamnose présents dans le biosurfactant

1. Placer 1,2 mL d’une culture en phase stationnaire (cultivée pendant 24 h) dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger pendant 3 min à 3 000 x g à 4 °C. Recueillir le surnageant dans un tube propre.
2. Transvasez 333 μL dans un tube propre (effectuez cette étape en trois exemplaires) et ajoutez 1 mL d’éther.
3. Mélangez vigoureusement dans un tourbillon pendant 30 s. Répétez cette procédure avec un tube à la fois.
4. Centrifugeuse pendant 2 min à 3 000 x g à 4 °C. Récupérez la phase organique (phase supérieure), transférez-la dans un tube propre et laissez-la ouverte dans la hotte d’extraction jusqu’à ce qu’elle se sèche.
5. Répétez l’extraction avec de l’éther comme décrit à l’étape 2.2. Répétez les étapes 2.3 et 2.4.
6. Une fois complètement sec, ajoutez 1 mL d’eau dans chaque tube. Laissez les tubes pendant 12 h pour permettre au RL de s’hydrater, puis agitez vigoureusement dans le vortex.
7. Placez une fiole propre dans de la glace pendant 5 minutes (car il s’agit d’une réaction exothermique). Préparez une solution à 60 % de H₂SO₄ (à l’abri de la lumière).
8. Dans un tube propre, préparez une solution d’orcinol à 1,6 % dans de l’eau distillée. Pour préparer le réactif d’orcinol, mélanger 4,4 mL de la solution de H₂SO₄ à 60 % avec 0,6 mL de solution d’orcinol à 1,6 %.
9. Calculez le volume final du réactif d’orcinol nécessaire. Ajouter 900 μL de ce réactif à chaque échantillon et à chaque concentration de la courbe d’étalonnage, en utilisant différentes concentrations de rhamnose (généralement, 9 concentrations de rhamnose sont utilisées dans la plage de 1 μg/mL à 9 μg/mL), et une avec 100 μL d’eau, en veillant à ce que toutes soient effectuées en trois exemplaires.
10. Ajouter 100 μL de chaque échantillon RL à 900 μL de réactif d’orcinol dans un tube en verre et mélanger les deux solutions.
11. Incuber 30 min dans un bain-marie préchauffé à 80 °C.
12. Laissez les tubes refroidir à température ambiante.
13. Lire l’absorbance des échantillons et la courbe d’étalonnage à 421 nm à l’aide d’une pile à quartz.
14. Calculer la concentration de rhamnose dans chaque échantillon en interpolant l’absorbance sur la courbe d’étalonnage et en tenant compte du volume utilisé pour la détermination.
15. Pour calculer la concentration en μM, il suffit de diviser la concentration obtenue en μg/mL par 182,2 (poids moléculaire du rhamnose) et de multiplier par 1000.

Résultats

Dans le présent article, trois souches différentes de type P. aeruginosa ont été utilisées pour représenter trois phylogroupes, chacun ayant des niveaux de production de RL et des proportions variables de mRL et de dRL. Ces souches comprennent PAO1 (un isolat de plaie d’Australie, 1955²²), PA14 (un isolat de plante des États-Unis, 1977²³) et PA7 (un isolat clinique d’Argentine, 2010²⁴). En tant que témoin négatif, le mutant PAO1 rhlA a été utilisé, qui est incapable de produire de RL. Toutes les souches ont été cultivées pendant 24 h dans un milieu PPGAS, spécialement conçu pour favoriser des niveaux élevés de RL²⁵, à 37 °C. Les cultures de PPGAS ont été inoculées à une densité optique de 0,05 à 600 nm à l’aide d’une culture de nuit LB medium²⁶. En règle générale, les souches de P. aeruginosa atteignent une densité optique de 2 mesurée à 600 nm dans un milieu PPGAS après 24 h, ce qui correspond à peu près à 1 x 10⁹ bactéries par mL. Pour collecter les surnageants de culture pour la détection et la quantification de la RL, les cultures ont été centrifugées à 3 000 x g à 4 °C pendant 15 min, et la pastille cellulaire a été jetée. Les résultats obtenus à l’aide de ces deux méthodes (figure 2 et figure 3) illustrent que les types de LR produits par chaque souche et la quantité de leur production diffèrent entre les trois souches analysées. Comme le montre la figure 2, le PAO1 produit environ 30 % de mRL et 70 % de dRL, tandis que le PA14 produit un rapport égal de 50 % de mRL et 50 % de dRL, et le PA7 produit exclusivement du mRL. Ce profil de production de RL est conforme aux rapports précédents^12,14.

La figure 3A illustre la quantité d’équivalents de rhamnose présents dans la LR produite par chacun de ces trois types de souches. D’après les quantités de rhamnose détectées, il est évident que la souche PA14 produit la plus grande quantité de RL, tandis que la souche PA7 produit la quantité la plus faible. Cependant, ces résultats ne peuvent pas à eux seuls être utilisés pour estimer la concentration en μM de RL produite par chaque souche. De plus, la méthode de l’orcinol à elle seule ne peut pas fournir une concentration approximative de RL, car elle repose sur la caractérisation des proportions de mRL et de dRL produites par chaque souche d’intérêt. Par conséquent, pour obtenir une estimation de la concentration en μM de RL, il faut tenir compte de la proportion de chaque type de RL déterminée dans la CCM, et inclure une courbe standard avec différentes concentrations de rhamnose (figure 3B).

La méthode de l’orcinol peut en effet être utilisée pour quantifier la concentration de RL lorsqu’un seul type de ce biosurfactant est produit. Dans de tels cas, la concentration en μM du rhamnose détecté correspond directement à la concentration en μM du mRL. Pour les dRL, puisque deux rhamnoses sont produites par l’hydrolyse de chaque molécule de dRL, la concentration en μM de rhamnose détectée dans les RL doit être divisée par 2 pour obtenir leur concentration en μM (voir Figure 4).

Cependant, la majorité des souches de P. aeruginosa produisent les deux types de LR à des proportions variables (comme le montre la figure 2), ce qui permet de ne déterminer qu’une concentration approximative du RL total. En tenant compte de cela, nous avons estimé la production de RL par chaque souche comme suit : Pour la souche PA7, puisqu’elle ne produit que des mRL, le rhamnose faisant partie de RL (44,6 μg/mL + 4,5 μg/mL) correspond directement à la concentration de μM (244,78), représentant la concentration de ce biosurfactant dans le surnageant de culture, car chaque molécule de RL contient une fraction rhamnose. Cependant, pour la souche PAO1, bien que la concentration de rhamnose détectée soit de 111,55 μg/mL + 11,41 μg/mL, seulement 30 % correspond à mRL. Par conséquent, 70 % des molécules RL contiennent deux rhamnoses par molécule. Pour estimer la concentration de RL, la concentration de rhamnose μM (612,24) a été divisée par 5, en considérant que 1/5 correspond à la concentration μM de mRL (122,49) et 2/5 (244,89) à dRL. Ainsi, la concentration approximative en μM de RL produite par cette souche est de 367,39.

Pour la souche PA14, la concentration de rhamnose détectée était de 194,39 μg/mL + 11,5 μg/mL, qui a été convertie en concentration de μM (1 066,9) et divisée par 3. Le résultat représente la concentration de chaque type de RL, en considérant que chaque type a été produit à 50% et que dRL contient 2 rhamnoses par molécule. Ainsi, cette souche produit 355,63 μM de mRL et la même concentration de dRL, ce qui donne une concentration approximative de 711,27 μM, soit près de deux fois plus que la souche PAO1 et près de trois fois la concentration produite par la souche PA7.

Figure 1 : Composition chimique des principaux congénères des monorhamnolipides et des di-rhamnolipides. (A) Mono-rhamnolipides. (B) Di-rhamnolipides. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Détection de mono-rhamnolipides et de di-rhamnolipides par chromatographie sur couche mince. (A) Image d’une plaque CCM montrant les étalons RL, et le RL produit par les souches PAO1, PA14, PA7 et le mutant ΔrhlA dérivé de PAO1. (B) Estimation de la proportion de chaque type de RL (mRL et dRL) dans chacun des échantillons testés en (A), à l’aide du logiciel ImageJ. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Quantification de la concentration en RL à l’aide de la méthode de l’orcinol. (A) Concentration en rhamnose (μg/mL) contenue dans le RL extrait des surnageants de culture des souches PAO1 (barre noire), PA14 (barre gris clair) et PA7 (barre gris foncé). Les barres indiquent l’écart-type. (B) La courbe d’étalonnage du rhamnose pour l’expérience illustrée en (A). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Validation de la méthode de l’orcinol par rapport à l’UPLC-MS/MS pour la quantification du dRL. (A) L’étalon dRL a été quantifié à l’aide de l’UPLC-MS/MS. (B) La méthode de l’orcinol comparée à la concentration de rhamnose exprimée en mM. (C) La même concentration en mM de dRL que le rhamnose donne environ deux fois l’absorbance à 421 nm, comme prévu. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Représentation schématique du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Fichier supplémentaire 1 : Protocole détaillé pour quantifier dRL par UPLC-MS/MS. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

La méthode la plus précise pour détecter et quantifier la LR est la HPLC couplée à la spectrométrie de masse (MS)^7,8,27 ; Cependant, cela nécessite de l’équipement spécialisé et coûteux qui n’est peut-être pas accessible à de nombreux chercheurs. Les méthodes décrites ici peuvent être couramment mises en œuvre avec du matériel et de l’équipement de laboratoire de base pour détecter et estimer les concentrations de RL, mais elles présentent certaines limites, notamment leur imprécision dans la détermination des mélanges de mRL et de dRL. De plus, la préparation de l’échantillon utilisé pour la quantification de l’apprentissage par renforcement doit être effectuée avec soin. Les cultures utilisées pour la détection et la quantification de la RL ne doivent pas être en phase stationnaire tardive, car les cellules pourraient être agrégées ou lysées, ce qui entraînerait des suspensions cellulaires non homogènes qui pourraient entraîner une variabilité dans les résultats obtenus. De plus, les débris cellulaires peuvent interférer avec la méthode de l’orcinol.

Des résultats précis peuvent être obtenus lorsque le protocole décrit est exécuté avec des contrôles appropriés, tels qu’une souche de Pseudomonas aeruginosa incapable de produire du RL (comme le mutant PAO1 ΔrhlA ²⁰ utilisé dans ce travail, Figure 2). Ces résultats sont utiles pour caractériser différents isolats de P. aeruginosa ^12,13, modifier génétiquement des souches pour augmenter la production de RL¹⁴, ou étudier la génétique moléculaire de la production de RL par divers isolats de P. aeruginosa ¹².

Ainsi, les méthodes décrites ici peuvent être utilisées pour caractériser les souches de Pseudomonas aeruginosa pour leur production de facteurs de virulence et évaluer leur potentiel biotechnologique, en particulier dans les premiers stades de l’investigation. Il est important de noter que ces méthodes ne sont pas conçues comme des substituts à des techniques telles que la HPLC/MS, mais plutôt comme des techniques accessibles pour la caractérisation initiale des souches et la manipulation génétique des souches de P. aeruginosa .

De plus, si la recherche se concentre sur la production de RL à des fins biomédicales, il est crucial de reconnaître que la production de RL n’est qu’un des nombreux facteurs produits par Pseudomonas aeruginosa. De plus, le type de LR produit ou la quantité de celle-ci produite n’est pas strictement corrélé à la virulence d’une souche particulière, car la virulence est influencée par de multiples facteurs²⁸.

En ce qui concerne la reproductibilité des méthodes décrites ici, une attention particulière doit être portée lors de l’obtention des phases organiques à la fois dans la détection du RL par CCM (étape 1.6) et la mesure du RL à l’aide de la méthode orcinol (étape 2.4). Même une petite quantité de l’autre phase prélevée lors de l’extraction peut entraîner des variations considérables dans les résultats obtenus. L’extraction de la RL à partir du surnageant de culture est une étape critique pour obtenir des résultats fiables et reproductibles avec la méthode de l’orcinol. Il est crucial que lors de la collecte de la phase organique, l’interphase et la phase liquide soient exclues. Si une phase éther n’est pas complètement séchée dans les 3 heures, elle contient probablement de l’eau, ce qui nécessite une nouvelle extraction.

L’utilisation de la méthode orcinol pour la quantification de l’apprentissage par renforcement a été débattue, avec des arguments contre son exactitude et sa spécificité. Il a été affirmé que les RL sont souvent surestimés, et la méthode n’est pas spécifique car l’orcinol peut réagir avec différents sucres, pas seulement le rhamnose. Les données actuelles démontrent que si les RL sont efficacement extraits du surnageant de culture, cette technique est spécifique, comme le montre l’absence de réaction lorsque le mutant rhlA est utilisé comme témoin négatif. Cependant, afin de fournir des preuves supplémentaires de la précision de la méthode en matière de détection, indépendamment de la procédure d’extraction, nous avons détecté un étalon dRL par UPLC-MS/MS comme décrit précédemment²⁷, et comparé les résultats obtenus avec la méthode orcinol¹⁸ (Fichier supplémentaire 1, Figure 4A). Nous avons trouvé, comme indiqué¹⁸, une très bonne corrélation entre la concentration de RL mesurée à l’aide de cette méthode, où chaque concentration μM de dRL détectée correspond à environ deux fois l’absorbance à 421 nm que la même concentration de rhamnose μM (Figure 4B,C). Cette expérience de contrôle démontre clairement la précision de cette méthode pour la quantification de l’apprentissage par restriction.

Cependant, en raison de la difficulté de mesurer la concentration des mélanges de mRL et de dRL avec la méthode de l’orcinol, la plupart des publications rapportent les résultats sous forme d’équivalents de rhamnose dans le RL. Cette valeur n’a peut-être pas de corrélation directe avec la concentration réelle de RL, comme l’illustrent les exemples présentés ici, mais elle constitue néanmoins un moyen utile de comparer les quantités de RL dans différentes conditions, en particulier lors de l’utilisation de la même souche de P. aeruginosa .

Une méthode alternative de quantification des mRL et dRL a été rapportée, qui est basée sur la solubilisation du colorant hydrophobe Victoria Pure Blue BO, couramment utilisé dans les stylos à bille²⁹. Cette méthode est rapide et peu coûteuse. Cependant, ce protocole a été mis au point pour quantifier la production hétérologue de RL par P. putida et n’est pas réalisable pour une utilisation avec RL produite par P. aeruginosa, car l’expression de la toxine bleue pyocyanine interfère avec cette méthode.

En résumé, les méthodes décrites ici offrent une alternative viable pour la détection et la quantification de la LR produite par P. aeruginosa qui ne nécessite pas d’équipement sophistiqué et coûteux. Ils fournissent une approche pratique aux chercheurs pour évaluer la production de RL dans une variété de contextes expérimentaux.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
1-NAPHTOL	SIGMA-ALDRICH	70442
ACIDE ACÉTIQUE	J.T. BAKER	9508-02
CENTRIFUGEUSE			Pour centrifuger des tubes 1,5 mL et 50 mL
CHLOROFORME	J.T. BAKER	9180-02
FOUR
ETHER	J.T. BAKER	9244-02
PIPETTE EN VERRE	SIGMA-ALDRICH
ACIDE CHLORHYDRIQUE	J.T. BAKER	5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATÉ	SIGMA-ALDRICH	R-3875
MÉTHANOL	J.T. BAKER	9049-02
ORCINOL MONOHYDRATE	SIGMA-ALDRICH	O1875
Bouillon			Tris HCL (0,12 M), chlorure de potassium ( 0,02 M) chlorure d’ammonium (0,02 M),  ; Peptone (1 %), pH 7,4  ;   ; Auto-clavés. Ajouter  ; Glucose (5 %) et sulfate de magnésium (0,0016M)
CELLULE DE QUARTZ (CUVETTE)	SIGMA-ALDRICH	Z276669
RECTANGULAIRE TLC EN DÉVELOPPEMENT	BASSIN FISHER SCIENTIFIQUE
RHAMNOLIPIDES  ;	SIGMA-ALDRICH	R-90
SPECTROPHOTOMÈTRE			VIS
PULVÉRISATEUR	SIGMA-ALDRICH	Z529710-1EA
ACIDE SULFURIQUE	J.T. BAKER	9681-02
TES TUBES 5mL	CORNING	352002
TLC SILICA GEL 60 F254	MERCK	1.05554.0001
BAIN-MARIE			> 80 ° ; L