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Article de méthode

Détection et quantification des mono-rhamnolipides et des di-rhamnolipides produits par Pseudomonas aeruginosa

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DOI :

10.3791/65934

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29 mars 2024

 ,  , 
1Departamento de Biología Molecular y Biotecnología, Instituto de Investigaciones Biomédicas, Universidad Nacional Autónoma de México, 2Departamento de Infectología e Inmunología, Instituto Nacional de Perinatología

Dans cet article

Résumé

Pseudomonas aeruginosa produit les biosurfactants rhamnolipides. La chromatographie sur couche mince détecte et détermine la proportion de mono- et di-rhamnolipides produits par chaque souche. La quantification des rhamnolipides totaux consiste à évaluer les équivalents de rhamnose présents dans ces biosurfactants extraits des surnageants de culture à l’aide de la méthode de l’orcinol.

Résumé

La bactérie environnementale Pseudomonas aeruginosa est un pathogène opportuniste à forte résistance aux antibiotiques qui représente un danger pour la santé. Cette bactérie produit des niveaux élevés de biosurfactants connus sous le nom de rhamnolipides (RL), qui sont des molécules ayant une valeur biotechnologique significative mais qui sont également associées à des traits de virulence. À cet égard, la détection et la quantification de l’apprentissage par renforcement peuvent être utiles tant pour les applications biotechnologiques que pour les projets de recherche biomédicale. Dans cet article, nous montrons étape par étape la technique permettant de détecter la production des deux formes de RL produites par P. aeruginosa à l’aide de la chromatographie sur couche mince (CCM) : les mono-rhamnolipides (mRL), molécules constituées d’un dimère d’acides gras (principalement C10-C10) lié à une fraction rhamnose, et les di-rhamnolipides (dRL), molécules constituées d’un dimère d’acide gras similaire lié à deux fractions de rhamnose. De plus, nous présentons une méthode pour mesurer la quantité totale de RL basée sur l’hydrolyse acide de ces biosurfactants extraits d’un surnageant de culture de P. aeruginosa et la détection ultérieure de la concentration de rhamnose qui réagit avec l’orcinol. La combinaison des deux techniques peut être utilisée pour estimer la concentration approximative de mRL et de dRL produite par une souche spécifique, comme illustré ici avec les souches types PAO1 (phylogroupe 1), PA14 (phylogroupe 2) et PA7 (phylogroupe 3).

Introduction

Pseudomonas aeruginosa est une bactérie environnementale et un pathogène opportuniste très préoccupant en raison de sa production de traits associés à la virulence et de sa forte résistance aux antibiotiques 1,2. Un métabolite secondaire caractéristique produit par cette bactérie est le biosurfactant RL, qui est produit de manière coordonnée avec plusieurs traits associés à la virulence tels que la phénazine pyocyanine, un antibiotique à activité redox et la protéase élastase3. Les propriétés tensio-actives et émulsifiantes de RL ont été exploitées dans différentes applications industrielles et sont actuellement commercialisées4.

La plupart des souches de P. aeruginosa, appartenant aux phylogroupes 1 et 2, produisent deux types de RL : mRL, qui consiste en un fragment de rhamnose lié à un dimère d’acide gras principalement de 10 atomes de carbone, et dRL, qui contient un fragmentaire de rhamnose supplémentaire lié au premier rhamnose4 (voir figure 1). Cependant, il a été rapporté que deux phylogroupes mineurs de P. aeruginosa (groupes 3 et 5) ne produisent quemRL 5,6. Les deux types de RL contiennent un mélange de dimères d’acides gras, qui, comme nous l’avons mentionné, sont principalement en C10-C10, mais de plus petites proportions de molécules contenant des dimères en C12-C10, C12-C12 et C10-C12:1 sont également produites. La caractérisation des congénères RL produits par différentes souches à l’aide de la HPLC MS/MS a été rapportée 7,8. Les méthodes décrites dans ce travail ne peuvent faire la différence entre mRL et dRL mais ne peuvent pas être utilisées pour la caractérisation des congénères RL.

P. aeruginosa et certaines espèces de Burkholderia sont des producteurs naturels de RL9, mais la première bactérie est le producteur le plus efficace. Cependant, la LR utilisée commercialement est actuellement produite dans les dérivés de Pseudomonas putida KT2440 exprimant les gènes de P. aeruginosa pour éviter l’utilisation de cet agent pathogène opportuniste10,11. La détection et la quantification de la LR produite par P. aeruginosa sont d’une grande importance pour l’étude des mécanismes moléculaires impliqués dans l’expression des caractères liés à la virulence12, dans la caractérisation des souches appartenant aux clades 3 ou 513, et pour la construction de dérivés de P. aeruginosa qui surproduisent ces biosurfactants tout en ayant une virulence réduite14. La production de biosurfactants par différents micro-organismes a été détectée sur la base de certaines caractéristiques générales de ces composés, telles que la méthode de la goutte d’effondrement ou l’indice d’émulsification15, mais ces méthodes ne sont ni précises ni spécifiques16.

Ici, nous décrivons le protocole de détection des mRL et dRL en utilisant l’extraction liquide des RL totaux des surnageants de culture de différentes souches de type P. aeruginosa et la séparation des deux types de RL à l’aide de la TLC. Dans cette méthode, le RL extrait du surnageant de culture est séparé par sa solubilité différentielle dans les solvants utilisés pour la CCM, provoquant une migration différentielle sur la plaque de gel de silice. Ainsi, les mRL ont une migration plus rapide que les dRL, et ils peuvent être détectés comme des points séparés lorsque les plaques sont séchées et colorées avec du α-naphtol.

La méthode décrite ici pour détecter mRL et dRL par TLC est basée sur un article17 précédemment publié, qui est facile à réaliser et ne nécessite pas d’équipement coûteux. Cette méthode s’est avérée utile pour détecter le RL dans divers isolats de P. aeruginosa 13 à l’aide de témoins appropriés, tels qu’un mutant dérivé de P. aeruginosa incapable de produire un RL. Cependant, ce n’est pas la méthode privilégiée pour caractériser les nouveaux biosurfactants produits par des bactéries autres que Pseudomonas aeruginosa en raison de son manque de spécificité.

De plus, une méthode de quantification des équivalents de rhamnose de la LR totale extraite d’un surnageant de culture de P. aeruginosa est présentée. Cette méthode quantifie ces biosurfactants en fonction de la réaction de l’orcinol avec les sucres réducteurs, ce qui permet d’obtenir un produit qui peut être mesuré par spectrophotométrie à 421 nm, comme décrit précédemment18. Étant donné que la réaction avec l’orcinol n’est pas spécifique au rhamnose, il est important d’effectuer cette méthode avec le RL extrait du surnageant de culture qui ne contient pas de quantités significatives d’autres molécules contenant du sucre, telles que les lipopolysaccharides (LPS). Un mélange chloroforme/méthanol acidifié est utilisé ici pour l’extraction liquide du RL18, mais l’acétate d’éthyle peut également être utilisé, et l’extraction en phase solide (SPE) donne de très bons résultats19. La méthode orcinol décrite ici ne nécessite pas d’équipement sophistiqué et peut fournir des résultats fiables si elle est effectuée avec un soin particulier dans la préparation des échantillons analysés, comme nous l’avons vu. Pour assurer une bonne préparation de l’échantillon, il est important d’inclure un mutant de Pseudomonas aeruginosa rhlA incapable de produire RL20 et d’effectuer trois répétitions biologiques et trois répétitions techniques pour chaque détermination.

Il y a eu une controverse importante dans la littérature16,21 concernant la détermination de la RL par la méthode de l’orcinol, certaines études suggérant que la production de RL est surestimée et que le test manque de spécificité pour le rhamnose, ce qui pourrait permettre de détecter d’autres sucres. Cependant, nous démontrons ici que les méthodes décrites peuvent être précises et spécifiques dans des conditions appropriées. De plus, à des fins de comparaison avec les procédures décrites dans cet article, nous utilisons la détection UPLC-MS/MS d’un étalon dRL et démontrons que des résultats similaires sont obtenus avec la méthode orcinol. Le protocole détaillé de quantification de l’apprentissage par renforcement à l’aide de cette méthode est inclus dans le fichier supplémentaire 1.

Ces protocoles sont illustrés à l’aide des souches types PAO1 (phylogroupe 1), PA14 (phylogroupe 2) et PA7 (phylogroupe 3). Ces souches ont été choisies parce qu’elles sont bien caractérisées et produisent différents profils RL.

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Protocole

Cette procédure est schématisée dans la figure supplémentaire 1. Les réactifs et l’équipement utilisés pour l’étude sont énumérés dans la table des matériaux.

1. Détection de mRL et dRL dans les surnageants de culture de P. aeruginosa à l’aide de la CCM

  1. Commencer avec le bouillon centrifugé de la souche d’intérêt P . aeruginosa , cultivé en milieu liquide pendant 24 h (pour atteindre la phase stationnaire de croissance où RL est produit). En règle générale, ces cultures contiennent 1 x 109 bactéries par ml.
  2. Ajustez le pH de la culture à 2 en utilisant du HCl concentré.
  3. Mettre 5 mL du surnageant de culture acidifié dans un tube de polypropylène de 50 mL et ajouter 5 mL d’un mélange chloroforme/méthanol 2:1.
  4. Agiter le tube par inversion trois fois, à chaque fois pendant 10 s, et laisser le tube sans inversion pendant 2 min entre chaque agitation.
  5. Laissez le tube sans agitation pendant environ 3 h jusqu’à ce que les deux phases soient séparées, ou centrifugez-le pendant 10 min à 3 000 x g à 4 °C.
  6. Transférez la phase organique (couche inférieure) dans un tube propre et laissez le tube dans une hotte d’extraction jusqu’à ce que la sécheresse se produise.
  7. Répétez le processus à partir de l’étape 1.3, en mettant la phase organique du deuxième chloroforme : l’extraction au méthanol, dans le tube qui a été utilisé lors de la première extraction.
  8. Évaporez la phase organique jusqu’à ce qu’il reste 1 mL ou 1,5 mL. Transférez ce volume dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et évaporez le solvant jusqu’à ce qu’il soit sec pendant la nuit.
  9. Ajouter 50 μL de méthanol dans le tube séché pour remettre en suspension le RL.
  10. Effectuer une chromatographie sur couche mince sur des plaques de gel de silice.
    REMARQUE : La taille de la plaque CCM doit être coupée en fonction du nombre d’échantillons qui seront analysés. Chaque échantillon doit être appliqué à 1,5 cm et le point d’application doit être à 1 cm du bord de la plaque (tracez une ligne horizontale avec un crayon).
  11. Appliquez 5 μL de chaque échantillon à l’aide d’une micropipette de 10 μL.
  12. La phase liquide TLC est constituée d’un mélange 65:15:2 de chloroforme, de méthanol et d’acide acétique. Pour préparer 35 mL de ce mélange, mélangez 26 mL de chloroforme, 6 mL de méthanol et 0,8 mL d’une solution mère à 20 % d’acide acétique. Mélangez ces solvants et placez-les dans la chambre TLC fermée pendant au moins 10 minutes avant de commencer la chromatographie, afin que l’atmosphère soit saturée de solvants volatils.
  13. Placez la plaque CCM dans la chambre, en évitant tout contact avec le point où les échantillons ont été appliqués.
  14. Fermez la chambre et laissez le CCM jusqu’à ce que le solvant atteigne 1 cm avant le bord de la plaque. À ce stade, retirez la plaque et laissez-la sécher (un flux d’air peut être appliqué pour accélérer le processus).
  15. Préparez une solution de α-naphtol en dissolvant 5 g de ce composé dans 33 mL d’éthanol. Une fois dissous, ajoutez 127,5 mL d’éthanol, 12,6 mL d’eau et 20,5 mLde H2SO4 froid.
  16. Pour détecter la présence de mRL et de dRL, vaporiser la solution de α-naphtol sur la plaque de la hotte d’extraction et placer la plaque pulvérisée dans un four à 85 °C pendant plusieurs minutes jusqu’à ce que la marque rosâtre de RL soit apparente.
  17. À l’aide d’une image de la CCM, calculer la proportion de mono- et di-RL présents dans chaque échantillon à l’aide d’un logiciel qui détecte la densité de chaque point.

2. Quantification de la quantité totale de RL en mesurant les équivalents de rhamnose présents dans le biosurfactant

  1. Placer 1,2 mL d’une culture en phase stationnaire (cultivée pendant 24 h) dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et centrifuger pendant 3 min à 3 000 x g à 4 °C. Recueillir le surnageant dans un tube propre.
  2. Transvasez 333 μL dans un tube propre (effectuez cette étape en trois exemplaires) et ajoutez 1 mL d’éther.
  3. Mélangez vigoureusement dans un tourbillon pendant 30 s. Répétez cette procédure avec un tube à la fois.
  4. Centrifugeuse pendant 2 min à 3 000 x g à 4 °C. Récupérez la phase organique (phase supérieure), transférez-la dans un tube propre et laissez-la ouverte dans la hotte d’extraction jusqu’à ce qu’elle se sèche.
  5. Répétez l’extraction avec de l’éther comme décrit à l’étape 2.2. Répétez les étapes 2.3 et 2.4.
  6. Une fois complètement sec, ajoutez 1 mL d’eau dans chaque tube. Laissez les tubes pendant 12 h pour permettre au RL de s’hydrater, puis agitez vigoureusement dans le vortex.
  7. Placez une fiole propre dans de la glace pendant 5 minutes (car il s’agit d’une réaction exothermique). Préparez une solution à 60 % de H2SO4 (à l’abri de la lumière).
  8. Dans un tube propre, préparez une solution d’orcinol à 1,6 % dans de l’eau distillée. Pour préparer le réactif d’orcinol, mélanger 4,4 mL de la solution de H2SO4 à 60 % avec 0,6 mL de solution d’orcinol à 1,6 %.
  9. Calculez le volume final du réactif d’orcinol nécessaire. Ajouter 900 μL de ce réactif à chaque échantillon et à chaque concentration de la courbe d’étalonnage, en utilisant différentes concentrations de rhamnose (généralement, 9 concentrations de rhamnose sont utilisées dans la plage de 1 μg/mL à 9 μg/mL), et une avec 100 μL d’eau, en veillant à ce que toutes soient effectuées en trois exemplaires.
  10. Ajouter 100 μL de chaque échantillon RL à 900 μL de réactif d’orcinol dans un tube en verre et mélanger les deux solutions.
  11. Incuber 30 min dans un bain-marie préchauffé à 80 °C.
  12. Laissez les tubes refroidir à température ambiante.
  13. Lire l’absorbance des échantillons et la courbe d’étalonnage à 421 nm à l’aide d’une pile à quartz.
  14. Calculer la concentration de rhamnose dans chaque échantillon en interpolant l’absorbance sur la courbe d’étalonnage et en tenant compte du volume utilisé pour la détermination.
  15. Pour calculer la concentration en μM, il suffit de diviser la concentration obtenue en μg/mL par 182,2 (poids moléculaire du rhamnose) et de multiplier par 1000.

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Résultats

Dans le présent article, trois souches différentes de type P. aeruginosa ont été utilisées pour représenter trois phylogroupes, chacun ayant des niveaux de production de RL et des proportions variables de mRL et de dRL. Ces souches comprennent PAO1 (un isolat de plaie d’Australie, 195522), PA14 (un isolat de plante des États-Unis, 197723) et PA7 (un isolat clinique d’Argentine, 201024). En tant que témoin négatif, le mutant PAO1 rhlA a été u...

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Discussion

La méthode la plus précise pour détecter et quantifier la LR est la HPLC couplée à la spectrométrie de masse (MS)7,8,27 ; Cependant, cela nécessite de l’équipement spécialisé et coûteux qui n’est peut-être pas accessible à de nombreux chercheurs. Les méthodes décrites ici peuvent être couramment mises en œuvre avec du matériel et de l’équipement de laboratoire de base pour détecter et estimer les concentrations de RL, mais elles...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Le laboratoire de GSCh est soutenu en partie par des subventions IN201222 du Programa de Apoyo a Proyectos de Investigación e Innovación Tecnológica (PAPIIT), Dirección General de Asuntos del Personal Académico -UNAM.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1-NAPHTOLSIGMA-ALDRICH70442
ACIDE ACÉTIQUEJ.T. BAKER9508-02
CENTRIFUGEUSEPour centrifuger des tubes 1,5 mL et 50 mL
CHLOROFORMEJ.T. BAKER9180-02
FOUR
ETHERJ.T. BAKER9244-02
PIPETTE EN VERRESIGMA-ALDRICH
ACIDE CHLORHYDRIQUEJ.T. BAKER5622-02
LB
L-RHAMNOSE MONOHYDRATÉSIGMA-ALDRICHR-3875
MÉTHANOLJ.T. BAKER9049-02
ORCINOL MONOHYDRATESIGMA-ALDRICHO1875
BouillonTris HCL (0,12 M), chlorure de potassium ( 0,02 M) chlorure d’ammonium (0,02 M),  ; Peptone (1 %), pH 7,4  ;   ; Auto-clavés. Ajouter  ; Glucose (5 %) et sulfate de magnésium (0,0016M)
CELLULE DE QUARTZ (CUVETTE)SIGMA-ALDRICHZ276669
RECTANGULAIRE TLC EN DÉVELOPPEMENTBASSIN FISHER SCIENTIFIQUE
RHAMNOLIPIDES  ;SIGMA-ALDRICHR-90
SPECTROPHOTOMÈTREVIS
PULVÉRISATEURSIGMA-ALDRICHZ529710-1EA
ACIDE SULFURIQUEJ.T. BAKER9681-02
TES TUBES 5mLCORNING352002
TLC SILICA GEL 60 F254MERCK1.05554.0001
BAIN-MARIE> 80 ° ; L
DE SÉCHAGE CLS706510 PPGAS K4161801020

Références

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