Article de méthode

Coupe automatisée par vibratome de tissu pulmonaire enrobé d’agarose pour l’imagerie par fluorescence multiplex

DOI :

10.3791/65943

⸱

6 octobre 2023

 ,  , 
1Wallenberg Centre for Molecular Medicine, Lund University, 2Department of Clinical Sciences, Lund University, 3Lund Stem Cell Centre, Lund University, 4Department of Cardiothoracic Surgery and Transplantation, Skåne University Hospital

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons mis au point une technique de traitement tissulaire utilisant un vibratome et du tissu pulmonaire enrobé d’agarose pour générer des coupes pulmonaires, permettant ainsi l’acquisition d’images à haute résolution de l’architecture pulmonaire. Nous avons utilisé la coloration par immunofluorescence pour observer l’expression spatiale des protéines à l’aide de marqueurs structurels pulmonaires spécifiques.

Résumé

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En raison de sa fragilité structurelle inhérente, le poumon est considéré comme l’un des tissus les plus difficiles à traiter pour les lectures microscopiques. Pour ajouter un soutien structurel à la section, des morceaux de tissu pulmonaire sont généralement incorporés dans de la paraffine ou un composé OCT et coupés avec un microtome ou un cryostat, respectivement. Une technique plus récente, connue sous le nom de tranches de poumon coupées avec précision, ajoute un soutien structurel au tissu pulmonaire frais par infiltration d’agarose et fournit une plate-forme pour maintenir le tissu pulmonaire primaire en culture. Cependant, en raison du masquage des épitopes et de la distorsion des tissus, aucune de ces techniques ne se prête adéquatement au développement de lectures d’imagerie par la lumière avancées reproductibles qui seraient compatibles entre plusieurs anticorps et espèces.

À cette fin, nous avons développé un pipeline de traitement des tissus, qui utilise l’enrobage d’agarose du tissu pulmonaire fixe, couplé à une section automatisée du vibratome. Cela a facilité la génération de coupes pulmonaires de 200 μm à 70 μm d’épaisseur, dans les poumons de souris, de porc et d’humains, qui ne nécessitent pas de récupération d’antigène et représentent la version la moins « traitée » du tissu isolé natif. À l’aide de ces coupes, nous révélons une lecture d’imagerie multiplex capable de générer des images à haute résolution dont l’expression spatiale des protéines peut être utilisée pour quantifier et mieux comprendre les mécanismes sous-jacents aux lésions pulmonaires et à la régénération.

Introduction

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Les coupes de tissu pulmonaire ex vivo sont largement utilisées dans l’étude des maladies pulmonaires1. Les étalon-or actuels, en particulier dans les études cliniques et translationnelles sur les grands animaux, utilisent la coloration à l’hématoxyline et à l’éosine couplée à la microscopie à fond clair et à la notation basée sur l’observateur pour évaluer et classer le dysfonctionnement pulmonaire 2,3. Bien qu’il s’agisse toujours d’une technique précieuse, elle présente des limites en termes de résolution spatiale et de nombre de marqueurs pouvant être imagés simultanément. De plus, le tissu pulmonaire doit subir de nombreux lavages à base de solvant, ce qui entraîne une déshydratation, un rétrécissement et une réhydratation du tissu avant son imagerie finale4. Ce processus est non seulement long, mais il est également peu respectueux de l’environnement, masque les épitopes protéiques et peut invoquer des changements structurels tissulaires 5,6,7,8. Cependant, pour le tissu pulmonaire, l’enrobage dans la paraffine avant la coupe a été une nécessité en raison de la fragilité structurelle du poumon. En revanche, les organes solides tels que le cerveau peuvent être coupés à l’aide d’un microtome vibrant (vibratome), à la fois dans les tissus fixes et frais 9,10,11,12.

Pour permettre la coupe du vibratome dans le tissu pulmonaire, une méthode appelée tranches de poumon coupées avec précision (PCLS) a été mise au point où l’agarose à bas point de fusion est injectée dans le tissu pulmonaire frais via les voies respiratoires ou les vaisseaux sanguins et laissée se solidifier13,14. L’agarose dans les voies respiratoires fournit un support structurel suffisant pour permettre ensuite la section du vibratome 9,14. Chez les rongeurs, c’est simple à réaliser car l’agarose peut être injectée par la trachée ; Cependant, dans les tissus porcins et humains, il peut être difficile de localiser une voie respiratoire ou un vaisseau approprié dans une biopsie donnée15,16. De plus, même si une telle voie respiratoire ou un tel vaisseau est localisé, une force importante est généralement nécessaire pour injecter l’agarose, ce qui peut influencer la morphologie pulmonaire ultérieure17.

Pour surmonter les défis rencontrés dans l’enrobage/sectionnement/coloration de la paraffine et le flux de travail PCLS, nous avons établi un nouveau pipeline de traitement pour les tissus pulmonaires fixes. Ce flux de travail permet l’utilisation d’un vibratome pour la section, peut produire des tranches plus fines que dans le PCLS et produit des tranches qui ne nécessitent pas de récupération d’antigène pour l’imagerie par fluorescence multiplex. Cette méthode offre un moyen de « moindre traitement » pour générer des coupes pulmonaires qui peuvent être utilisées en microscopie optique avancée. De plus, les lectures d’imagerie peuvent être utilisées pour démontrer les relations spatiales des cellules et des structures anatomiques dans le tissu pulmonaire en capturant l’architecture volumétrique du tissu 18,19,20,21. Cet article décrit le protocole permettant de générer ces coupes pulmonaires et démontre les colorations multiplex appliquées à chacun de ces tissus et comment ces données d’imagerie avancées peuvent être utilisées pour la quantification.

Protocole

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Des poumons de souris ont été donnés par des chercheurs utilisant d’autres systèmes d’organes dans le but de respecter les 3R. Toutes les procédures chez les porcs ont été effectuées conformément à la directive européenne 2010/63/UE et ont été approuvées par le Comité d’éthique de Malmö-Lund pour la recherche animale (Dnr 5.8.18-05527/2019) et menées conformément aux directives du CODEX du Conseil suédois de la recherche. L’autorisation d’utilisation d’échantillons humains a été accordée par le Comité national d’éthique suédois (Dnr 2020-07115 et Dnr 2020-01864). Voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur tous les matériaux et instruments utilisés dans ce protocole.

1. Préparation des solutions et des matériaux

  1. Fixer le tissu pulmonaire dans du paraformaldéhyde à 4 % à température ambiante pendant 48 h. Par la suite, transférez le tissu pulmonaire dans un tube conique de 50 mL rempli d’une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) contenant 0,01 % d’azoture de sodium.
  2. Préparer une solution d’agarose à 3 % (p/v) en dissolvant 1,5 g d’agarose à bas point de fusion dans 50 mL de PBS stérile. Préparez un gobelet en plastique, une pince fine et des ciseaux stériles.
  3. Faites chauffer l’agarose au micro-ondes jusqu’à ébullition, puis refroidissez-la à 42 °C au bain-marie. Conservez l’agarose sous sa forme liquide en la conservant au bain-marie jusqu’au moment de l’utiliser.
    REMARQUE : Pendant que vous chauffez l’agarose, surveillez le micro-ondes jusqu’à ce qu’il commence à bouillir afin qu’il ne déborde pas. Cela prend généralement environ 1,5 min.

2. Tissu pulmonaire incorporé dans l’agarose

  1. Prélevez la biopsie pulmonaire de l’azoture de PBS et disséquez soigneusement les lobes pulmonaires à l’aide d’une pince fine et de ciseaux stériles. Coupez le lobe pulmonaire en blocs plus petits.
    REMARQUE : Bien que la section avec la plèvre soit possible, ses faisceaux d’élastine épais peuvent empêcher la coupe avec la lame du vibratome. Ainsi, nous recommandons sa suppression si elle n’est pas nécessaire.
  2. Coupez un gobelet en plastique au milieu et ajoutez une petite quantité d’agarose au fond. Placez le couvercle d’un tube conique de 50 ml (rebord retiré) sur la surface de l’agarose et conservez la tasse à 4 °C pendant 5 min pour permettre à l’agarose de se solidifier en vue d’une utilisation ultérieure.
  3. Récupérez le gobelet en plastique du réfrigérateur à 4 °C, ajoutez environ 1 mL d’agarose liquide sur le couvercle, puis placez délicatement le bloc de tissu pulmonaire sur le couvercle. Laissez l’agarose pendant 2-3 min pour qu’elle se solidifie semi-à température ambiante. Ensuite, versez lentement l’agarose liquide sur le tissu pulmonaire jusqu’à ce qu’il soit complètement immergé.
  4. Réfrigérer à 4 °C pendant environ 15 min jusqu’à ce que l’agarose se solidifie. Ensuite, utilisez soigneusement une lame tranchante pour enlever l’excès d’agarose entourant le tissu pulmonaire, en laissant une couche uniforme d’environ 5 mm d’épaisseur autour du tissu (Figure 1).

3. Découpe de coupes de tissu pulmonaire

  1. Pour préparer le tissu pulmonaire à la section, fixez chaque bloc de tissu sur le disque d’échantillon du vibratome à l’aide de super colle. Ensuite, remplissez le plateau tampon du vibratome avec du PBS et placez de la glace dans le bain de glace environnant. Enfin, installez soigneusement le disque d’échantillon dans le plateau tampon.
  2. Coupez le tissu pulmonaire avec le vibratome avec les réglages suivants : épaisseur : 200 μm, fréquence : 100 Hz, amplitude de la lame : 1,3 mm et vitesse d’avancement de la lame de 0,02-0,03 mm/s, qui dépend de la rigidité des tissus.
    REMARQUE : La coupe est possible jusqu’à une épaisseur de 70 μm si la vitesse de la lame est réduite à 0,01 mm/s. Certains vibratomes (par exemple, les Leica V1200) permettent d’automatiser le sectionnement en définissant une fenêtre de coupe.
  3. Pour prélever des sections, transférez délicatement la tranche de tissu en la ramassant avec une brosse du plateau de vibratome dans une plaque à 24 puits remplie d’azoture à 0,01 % dans le PBS. Enfin, conservez les tranches de poumon à 4 °C.

4. Immunomarquage de l’élastine, du CD31, du HTII-280 et de l’ASM

  1. Perméabiliser et bloquer (1 % d’albumine sérique bovine + 0,5 % de Triton + 5 % de sérum de chèvre normal) le tissu à 4 °C en agitant doucement pendant 45 min.
  2. Diluer les anticorps primaires (SMA 1 :500 ; élastine 1 :250 ; CD31 1 :250 ; HTII-280 1 :250) dans du PBS, ajouter 300 μL par puits, et incuber toute la nuit à 4 °C en agitant doucement.
  3. Sans toucher la tranche et retirer les anticorps primaires à l’aide d’une pointe de pipette, laver 3 x 20 min (400 μL) avec du PBS.
  4. Diluer les anticorps secondaires (1 :1000) dans du PBS, ajouter 300 μL par puits et incuber à 4 °C sous agitation légère pendant 90 min.
  5. Retirez les anticorps secondaires à l’aide d’une pointe de pipette, ajoutez le 4',6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (1 :1000) et la lectine de tomate-488 (1 :500) pendant une incubation de 30 minutes, et lavez pendant 3 x 10 minutes avec du PBS.
  6. Placez trois gouttes de support de montage sur la diapositive, montez une lamelle et procédez à l’imagerie.

Résultats

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Le processus de génération de tranches de tissu pulmonaire implique plusieurs étapes clés, notamment la préparation, l’enrobage et la section. La solution d’agarose (3 % (p/v) est obtenue en dissolvant 1,5 g d’agarose à bas point de fusion dans 50 mL de PBS stérile. Les consommables nécessaires comprennent un gobelet en plastique, un couvercle d’un tube conique de 50 ml (rebord retiré), une pince et des ciseaux. Le tissu pulmonaire est soigneusement réséqué en blocs plus petits à l’aide de pinces fines et de ciseaux stériles (Figure 1A,B). Ensuite, pour intégrer les blocs de tissu pulmonaire, le fond de la tasse est rempli d’une petite quantité d’agarose, un couvercle est placé à la surface de l’agarose et la tasse est stockée à 4 °C pendant 5 minutes (Figure 1C). Environ 1 mL d’agarose liquide est ajouté au couvercle et le bloc de tissu pulmonaire est placé sur le couvercle. L’agarose est laissée pendant 2 à 3 minutes pour se solidifier semi-à température ambiante (Figure 1D). Une fois qu’un bloc pulmonaire est maintenu en place par l’agarose semi-solidifiée, l’agarose liquide est ensuite versée dans la cupule jusqu’à ce que le bloc de tissu pulmonaire soit complètement immergé. Celui-ci est stocké à 4 °C pendant 15 min (Figure 1E,F). L’enrobage d’agarose à bas point de fusion fournit le soutien et la rigidité nécessaires au tissu pulmonaire, ce qui aide à maintenir son architecture d’origine pendant le processus de tranchage. Une lame tranchante est utilisée pour éliminer l’excès d’agarose entourant le tissu pulmonaire. Une couche uniforme d’environ 5 mm d’épaisseur est laissée autour du tissu (figure 1G). Le bloc de tissu pulmonaire excisé est ensuite soigneusement collé sur le porte-tissu (Figure 1H). Le plateau tampon du vibratome est rempli de PBS, la glace est placée dans le bain de glace environnant et le disque d’échantillon est installé dans le plateau tampon (Figure 1I). Les paramètres de coupe du vibratome définis sur le panneau étaient les suivants : épaisseur de la tranche : 200 μm ; fréquence : 100 Hz ; amplitude de la lame : 1,3 mm ; vitesse d’avancement de la lame : 0,02-0,03 mm/s, qui dépend de la rigidité des tissus (Figure 1J). Enfin, la coloration est réalisée sur des tranches flottantes (Figure 1K-M).

La coloration par immunofluorescence a été réalisée dans des coupes de 200 μm de chaque espèce pour l’actine du muscle lisse (SMA, une cellule musculaire lisse et un marqueur de myofibroblastes), l’élastine (protéine de la matrice extracellulaire) et la lectine de Lycopersicon Esculentum (LEA), qui se lie aux cellules épithéliales broncho-alvéolaires. Le poumon est un tissu structurellement hétérogène et, à ce titre, une distribution différentielle de l’amyotrophie spinale et de l’élastine est observée entre les structures, y compris les canaux alvéolaires, les vaisseaux sanguins, les bronchioles intrapulmonaires et les alvéoles de souris, de porcs et d’humains (Figure 2A-L). Un rendu haute résolution d’un volume de 20 μm d’une bronchiole montre comment les structures fines du poumon peuvent être examinées à un niveau semi-tridimensionnel (vidéo supplémentaire S1). À titre d’exemple quantitatif, à l’aide du traçage d’images, nous montrons comment la taille des alvéoles diffère d’un échantillon à l’autre (n = 20 alvéoles) (Figure 2L,M).

Pour montrer comment il est possible d’utiliser quantitativement ces données d’imagerie avancées, nous avons comparé les distributions de cellules de pneumocyte de type 2 (TII) dans le tissu pulmonaire humain d’un adulte et d’un nourrisson. L’anticorps anti-cellules alvéolaires de type 2 spécifique à l’homme, HTII-280, a une forte affinité pour la surface des cellules humaines de type 2 (Figure 3A-F). Ces cellules peuvent ensuite être visualisées dans l’espace tridimensionnel d’une seule alvéole à l’aide de l’imagerie volumétrique (vidéo supplémentaire S2). Pour quantifier le nombre de TII entre les échantillons d’adultes et de nourrissons, nous avons traité le nombre de HTII-280 sur 10 champs de vision aléatoires (fov). Entre ces échantillons, l’échantillon de nourrisson a donné un nombre de cellules TII significativement plus élevé (figure 3G). Cependant, l’échantillon de nourrissons présentait également une couverture d’échafaudage significativement plus élevée que celle de l’adulte, ce qui pourrait expliquer le nombre de cellules plus élevé (Figure 3H). Pour tenir compte de cela, nous avons ensuite évalué le nombre d’ICI en fonction de la couverture de l’échafaudage, en cellules par mm2 de tissu, ce qui maintenait toujours un nombre significativement plus élevé d’ICI dans l’échantillon de nourrissons (Figure 3I). Ainsi, le nombre plus élevé d’ICI dans l’échantillon de nourrissons n’est pas dû à une couverture accrue de l’échafaudage et souligne l’importance d’évaluer la distribution des cellules dans le poumon en fonction de la surface de l’échafaudage, et non de la portée globale.

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Figure 1 : Protocole de découpe de tranches de tissu pulmonaire. (A) Les solutions et les matériaux : une solution d’agarose à 3 % (p/v) obtenue en dissolvant 1,5 g d’agarose à bas point de fusion dans 50 mL de solution saline stérile tamponnée au phosphate ; un gobelet en plastique ; un couvercle à partir d’un tube conique de 50 mL ; des pinces et des ciseaux. (B) Les tissus pulmonaires ont été disséqués à l’aide de pinces fines et de ciseaux stériles. (C) Remplissez le fond de la tasse avec une petite quantité d’agarose et placez le couvercle sur la surface de l’agarose ; ensuite, conservez-le à 4 °C pendant 5 min. (D) Ajoutez lentement 1 à 2 mL d’agarose liquide sur le couvercle, placez soigneusement le morceau de tissu pulmonaire sur le couvercle et conservez-le à 4 °C pendant 2 min. (E,F) Versez l’agarose liquide dans la tasse jusqu’à ce que le morceau de tissu pulmonaire soit complètement immergé, conservez-le à 4 °C pendant 15 min, puis cassez doucement le gobelet en plastique. (G) À l’aide d’une lame tranchante, enlever l’excès d’agarose qui entoure le tissu pulmonaire, en laissant une couche uniforme d’environ 5 mm d’épaisseur autour du tissu. (H) Le bloc de tissu pulmonaire excisé est ensuite soigneusement collé sur le porte-tissu. (I) Remplissez le bac tampon du vibratome avec du PBS, placez de la glace dans le bain de glace environnant et installez le disque d’échantillon dans le bac tampon. (J) Régler les paramètres de coupe sur le panneau du vibratome ; épaisseur de la tranche : 200 μm, fréquence : 100 Hz, amplitude du couteau : 1,3 mm et vitesse d’avancement de la lame de 0,02 à 0,04 mm/s. (K-M) Images représentatives d’une tranche flottante encore noyée dans de l’agarose et prête pour la coloration par immunofluorescence. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Images d’immunofluorescence de la structure pulmonaire chez l’homme, le porc et la souris. (A-L) Images représentatives d’un canal alvéolaire, d’un vaisseau sanguin, d’une bronchiole et d’alvéoles dans des coupes de tissu pulmonaire de souris, de porc et d’humain, respectivement. L’amyotrophie spinale (en vert) est un marqueur des cellules musculaires lisses et est observée dans les parois vasculaires et bronchiques du tissu pulmonaire. L’élastine (en rouge) fait partie de la matrice extracellulaire des poumons. (M) Quantification de la taille alvéolaire en sélectionnant 20 positions aléatoires sur chaque tranche de tissu pulmonaire pour des échantillons humains, porcins et murins. Des histogrammes ont été utilisés pour illustrer la distribution de la taille alvéolaire au sein de chaque groupe. Barres d’échelle = 50 μm (A-F, H-L), 100 μm (G). Test de Kruskall-Wallis. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abréviations : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole ; LEA = lectine de Lycopersicon Esculentum ; SMA = actine des muscles lisses ; ms = souris ; hmn = humain. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Graphique 3. Distribution des pneumocytes de type 2 dans des échantillons humains, adultes et nourrissons. (A,B) Images représentatives de tissus pulmonaires humains adultes et nourrissons colorés pour HTII-280 (en rouge), CD31 (en vert) et LEA (en gris). (C,D) Images représentatives d’humains adultes et nourrissons montrant la distribution des pneumocytes de type 2 seuls. (E,F) Images représentatives d’un pneumocyte de type 2 à partir d’échantillons de poumons humains d’adultes et de nourrissons. (G) Quantification du nombre de pneumocytes de type 2 entre les échantillons d’adultes et de nourrissons. (H) Quantification de la couverture de la surface d’échafaudage des tissus pulmonaires (% par rapport à l’air) dans les échantillons d’adultes et de nourrissons. (I) Quantification du pneumocyte de type 2 parmm2 de tissu dans des échantillons d’adultes et de nourrissons. Barres d’échelle = 5 μm (E,F), 100 μm (A-D). n = 10 champ de vision par échantillon. Test t non apparié ou test de Mann-Whitney. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001, ****p < 0,0001. Abréviations : DAPI = 4', 6-diamidino-2-phénylindole ; LEA = lectine de Lycopersicon Esculentum ; HTII = cellules humaines de type II ; CD31 = molécule d’adhésion des cellules endothéliales plaquettaires-1/cluster de différenciation 31 ; FOV = champ de vision. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo supplémentaire S1 : Vidéo d’un volume d’imagerie de 20 μm d’une seule voie respiratoire porcine colorée à l’aide de DAPI, LEA, SMA et élastine montrant une vue haute résolution de la structure des éléments de paroi des voies respiratoires. Abréviations : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole ; LEA = lectine de Lycopersicon Esculentum ; SMA = actine musculaire lisse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Vidéo supplémentaire S2 : Vidéo d’un volume d’imagerie de 30 μm d’une seule alvéole colorée à l’aide de DAPI, LEA et HTII-280 montrant la distribution des pneumocytes de type 2 à travers la structure. Abréviations : DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole ; LEA = lectine de Lycopersicon Esculentum ; SMA = actine musculaire lisse. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans ce protocole, nous présentons une méthode améliorée basée sur le vibratome pour générer des coupes pulmonaires. Par rapport aux techniques de traitement à base de paraffine, cette méthode est plus rentable, plus rapide et meilleure pour l’environnement22. De plus, cette méthode aide à maintenir l’intégrité structurelle des coupes de tissu pulmonaire et permet une imagerie avancée par immunofluorescence sans avoir besoin de récupérer l’antigène. Cependant, au cours de nos expériences, nous avons également trouvé certaines limites à ce flux de travail. Les poumons malades peuvent interférer avec le processus de coupe en raison de la destruction des tissus causée par des changements pathologiques. Lors de l’utilisation du vibratome pour la section, les obstructions des voies respiratoires et le tissu pulmonaire fibreux sévère peuvent entraver la lame, ce qui rend le processus de découpage de ces tissus plus difficile. Cependant, cela peut être surmonté en réduisant la vitesse de la lame et en soutenant le tissu avec un pinceau fin. L’épaississement de la plèvre, qui est un résultat courant dans la pleurésie, la bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC) et la fibrose pulmonaire idiopathique (FPI)23,24,25, pose des défis similaires. Si la plèvre n’est pas intéressante pour une expérience, nous recommandons de l’enlever avant la section ou en isolant un volume pulmonaire éloigné de la plèvre. Si la plèvre est nécessaire, elle peut être tranchée en utilisant une manipulation similaire à celle ci-dessus, impliquant des vitesses de lame plus lentes et un support de tranche à partir d’une brosse fine.

Bien que les tranches de poumon découpées avec précision puissent préserver l’architecture tridimensionnelle et l’environnement natif du poumon26, il est important de noter que la génération de PCLS est un processus complexe et chronophage. Le succès de la génération de coupes de tissu pulmonaire dépend en grande partie de l’efficacité de l’obturation à l’agarose, qui, à son tour, est influencée par la présence d’une plèvre intacte et de sites d’injection viables dans le tissu obtenu. Ceci est facile à réaliser chez les rongeurs car l’agarose peut facilement être introduite par la trachée dans les poumons intacts27,28,29. Cependant, dans la recherche sur les grands animaux, les biopsies prélevées au cours d’une expérience proviennent généralement de segments pulmonaires distaux, qui n’ont pas de voies respiratoires suffisamment grandes pour canuler30,31. Ainsi, au lieu d’injecter de l’agarose dans les bronches ou les vaisseaux sanguins, nous adoptons cette méthode où le tissu pulmonaire, quelle que soit l’espèce d’origine ou le volume de l’échantillon, est incorporé dans de l’agarose à bas point de fusion pour générer des tranches de tissu pulmonaire. Cette approche est techniquement plus simple et vise à minimiser autant que possible les dommages tissulaires. Sur la base de notre expérience, cette méthode a démontré une plus grande efficacité et une plus grande facilité dans la génération de coupes de tissu pulmonaire. Il préserve efficacement la morphologie des alvéoles et est particulièrement adapté à la coupe du tissu pulmonaire, permettant la génération d’une imagerie par fluorescence multiplex haute résolution reproductible.

Dans cette étude, nous démontrons en outre deux quantifications basées sur des échantillons pour les données d’imagerie générées. Le premier a utilisé le traçage d’images pour évaluer les différences de taille alvéolaire entre les échantillons d’espèces. Sans surprise, les alvéoles de souris étaient les plus petites, tandis que les alvéoles de porc et humaines étaient de taille similaire, ce qui met en évidence les porcs comme un modèle translationnel intéressant pour la recherche pulmonaire.

Pour la deuxième quantification, nous avons comparé la distribution de l’HTII entre un échantillon de poumons d’adultes et de nourrissons. Les pneumocytes de type 2 jouent un rôle essentiel dans la structure de l’épithélium pulmonaire distal. Cette capacité unique des TIIs contribue à la réparation et à la régénération de l’épithélium alvéolaire32. Dans le poumon humain adulte sain, les TII représentent environ 15 % de la population cellulaire totale, tandis que leur couverture de la surface alvéolaire est estimée à environ 5 %33. HTII-280 est un marqueur pulmonaire spécifique largement reconnu pour l’étude du développement et de la réponse des cellules épithéliales alvéolaires aux lésions, et il est spécifiquement localisé dans les membranes plasmiques apicales des TII. Dans l’expérience, des tissus adultes ont été prélevés sur un patient donneur décédé des suites d’une hémorragie intracérébrale et d’une lésion pulmonaire concomitante, tandis que l’échantillon du nourrisson provenait d’une mortalité liée à l’asphyxie. Nos résultats indiquent que l’expression de HTII-280 était significativement plus faible dans l’échantillon de poumons adultes que dans l’échantillon de nourrissons. Il est intéressant de noter que, bien que le HTII-280 soit exprimé dans la majorité des HTII, son expression peut également être influencée par la qualité des tissus, et il est considérablement réduit dans les tissus pulmonaires humains lésés34. Les tissus pulmonaires âgés présentent une diminution significative du nombre et de l’activité sécrétoire des AIT par rapport aux tissus jeunes, et les personnes âgées présentent une prolifération, une sécrétion et une activité anti-apoptotique considérablement plus faibles des ITS par rapport à ces tissus jeunes35. Dans le même ordre d’idées, l’identification et la détection d’une protéine de surface cellulaire spécifique aux ICI humains pourraient aider à évaluer la gravité des lésions pulmonaires et à évaluer les approches thérapeutiques visant à améliorer la réparation pulmonaire36,37. Ainsi, en utilisant ce pipeline, il serait d’un grand intérêt de mener des études sur l’IIT alvéolaire dans de plus grandes cohortes humaines de santé et de maladie.

En conclusion, ce protocole présente une approche plus rapide et plus facile pour couper le tissu pulmonaire. Cette méthode fournit des instructions détaillées pour la préparation, la coupe et la coloration du tissu pulmonaire, assurant la préservation de la structure intacte du tissu pulmonaire. Il optimise le modèle pour l’étude de l’architecture pulmonaire saine et malade, ce qui permet d’améliorer l’efficacité expérimentale. Dans l’ensemble, cette étude présente une approche prometteuse pour étudier la biologie spatiale complexe dans la physiopathologie des tissus pulmonaires à travers les espèces, ce qui peut aider à mieux comprendre les mécanismes moléculaires en jeu dans la maladie et la réparation.

Déclarations de divulgation

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Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

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Les auteurs remercient chaleureusement la Wallenberg Molecular Medicine Foundation et le Stem Cell Center de l’Université de Lund, ainsi que le Lund University Bioimaging Centre (LBIC) pour l’accès au Nikon A1RHD.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
24 inserts de culture tissulaireSARSTEDT83.3932.300
4 % paraformaldéhydeSOLVECO6095714
4', 6-diamidino-2-phénylindole (DAPI)Thermo Fisher scientificD1306
50 mL Falcon tube  ; SARSTEDT2045221
Cluster de différenciation 31 (CD31)Abcamab28364
Microscope confocal  ;NikonA1R HD25
ElastinAbcamab23747
Epredia X1000 CoverslipThermo Fisher scientific10318963
Epredia SuperFrost Plus Lames d’adhérenceThermo Fisher scientific10149870
ForcepsAESCULAPFB395R
Chèvre anti-souris 647  ;Invitrogen  ;A21235
Chèvre anti-lapin 568Invitrogen  ;A11011
Cellules humaines de type IITerrace BiotechTB-27AHT2-280  ;
Invitrogen Fluoromount-G Medium de montageThermo Fisher scientificE41473
Basse température de gélification AgaroseSigma-Aldrich1003467046
Lycopersicon Esculentum lectinThermo Fisher scientific2531965
Solution saline tamponnée au phosphate (PBS)Thermo Fisher scientific50-100-8798
Gobelet en plastiquekontorsgiganten885221
CiseauxSTILLE101-8380-18
Muscle lisse actineAbcamab5694
Azoture de sodiumSigma-AldrichK54329188239
Super colleLOCTITE2721643
Microtome vibrantLeicaVT1200S

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Morin, J. P., et al. Precision cut lung slices as an efficient tool for in vitro lung physio-pharmacotoxicology studies. Xenobiotica. 43 (1), 63-72 (2013).
  2. Kawasaki, H., et al. The NanoSuit method: a novel histological approach for examining paraffin sections in a nondestructive manner by correlative light and electron microscopy. Laboratory Investigation. 100 (1), 161-173 (2020).
  3. Silva, I., et al. A Semi-quantitative scoring system for green histopathological evaluation of large animal models of acute lung injury. BIO-PROTOCOL. 12 (16), e4493(2022).
  4. Kim, J. H., et al. Optimizing tissue-clearing conditions based on analysis of the critical factors affecting tissue-clearing procedures. Scientific Reports. 8 (1), 12815(2018).
  5. Jain, D., et al. Immunocytochemistry for predictive biomarker testing in lung cancer cytology. Cancer Cytopathology. 127 (5), 325-339 (2019).
  6. Alturkistani, H. A., Tashkandi, F. M., Mohammedsaleh, Z. M. Histological stains: a literature review and case study. Global Journal of Health Science. 8 (3), 72-79 (2015).
  7. Morrison, L. E., Lefever, M. R., Lewis, H. N., Kapadia, M. J., Bauer, D. R. Conventional histological and cytological staining with simultaneous immunohistochemistry enabled by invisible chromogens. Laboratory Investigation. 102 (5), 545-553 (2022).
  8. Dineshshankar, J., et al. Kerosene as an alternative to xylene in histopathological tissue processing and staining: An experimental study. Journal of Pharmacy and Bioallied Sciences. 11 (6), 376(2019).
  9. Abdelaal, H. M., et al. Comparison of vibratome and compresstome sectioning of fresh primate lymphoid and genital tissues for in situ MHC-tetramer and immunofluorescence staining. Biological Procedures Online. 17 (1), 2(2015).
  10. Siwczak, F., Hiller, C., Pfannkuche, H., Schneider, M. R. Culture of vibrating microtome tissue slices as a 3D model in biomedical research. Journal of Biological Engineering. 17 (1), 36(2023).
  11. Bèchet, N. B., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Glymphatic pathways in the gyrencephalic brain. Journal of Cerebral Blood Flow & Metabolism. 41 (9), 2264-2279 (2021).
  12. Bèchet, N. B., Kylkilahti, T. M., Mattsson, B., Petrasova, M., Shanbhag, N. C., Lundgaard, I. Light sheet fluorescence microscopy of optically cleared brains for studying the glymphatic system. Journal of Cerebral Blood Flow and Metabolism. 40 (10), 1975-1986 (2020).
  13. Bai, Y., Ai, X. Utilizing the precision-cut lung slice to study the contractile regulation of airway and intrapulmonary arterial smooth muscle. Journal of Visualized Experiments. (183), (2022).
  14. Gerckens, M., et al. Generation of human 3D lung tissue cultures (3D-LTCs) for disease modeling. Journal of Visualized Experiments. (144), (2019).
  15. Sanderson, M. J. Exploring lung physiology in health and disease with lung slices. Pulmonary Pharmacology & Therapeutics. 24 (5), 452-465 (2011).
  16. Lam, M., Lamanna, E., Organ, L., Donovan, C., Bourke, J. E. Perspectives on precision cut lung slices—powerful tools for investigation of mechanisms and therapeutic targets in lung diseases. Frontiers in Pharmacology. 14, 1162889(2023).
  17. Liu, G., et al. Use of precision cut lung slices as a translational model for the study of lung biology. Respiratory Research. 20 (1), 162(2019).
  18. Cooper, P. R., et al. Formoterol and salmeterol induce a similar degree of β 2- adrenoceptor tolerance in human small airways but via different mechanisms. British Journal of Pharmacology. 163 (3), 521-532 (2011).
  19. Ochoa, L. F., et al. Imaging of murine whole lung fibrosis by large scale 3D microscopy aided by tissue optical clearing. Scientific Reports. 8 (1), 13348(2018).
  20. Tehrani, K. F., Park, J., Chaney, E. J., Tu, H., Boppart, S. A. Nonlinear imaging histopathology: a pipeline to correlate gold-standard hematoxylin and eosin staining with modern nonlinear microscopy. IEEE Journal of Selected Topics in Quantum Electronics. 29 (4), (2023).
  21. Branchfield, K., et al. A three-dimensional study of alveologenesis in mouse lung. Developmental Biology. 409 (2), 429-441 (2016).
  22. Li, Y., et al. Precision vibratome for high-speed ultrathin biotissue cutting and organ-wide imaging. iScience. 24 (9), 103016(2021).
  23. Qian, G., et al. DOCK2 promotes pleural fibrosis by modulating mesothelial to mesenchymal transition. American Journal of Respiratory Cell and Molecular Biology. 66 (2), 171-182 (2022).
  24. Cagle, P. T., Allen, T. C. Pathology of the pleura: What the pulmonologists need to know. Respirology. 16 (3), 430-438 (2011).
  25. Jantz, M. A., Antony, V. B. Pleural fibrosis. Clinics in Chest Medicine. 27 (2), 181-191 (2006).
  26. Viana, F., O’Kane, C. M., Schroeder, G. N. Precision-cut lung slices: A powerful ex vivo model to investigate respiratory infectious diseases. Molecular Microbiology. 117 (3), 578-588 (2022).
  27. Paddenberg, R., Mermer, P., Goldenberg, A., Kummer, W. Videomorphometric analysis of hypoxic pulmonary vasoconstriction of intra-pulmonary arteries using murine precision cut lung slices. Journal of Visualized Experiments. (83), e50970(2014).
  28. Lyons-Cohen, M. R., Thomas, S. Y., Cook, D. N., Nakano, H. Precision-cut mouse lung slices to visualize live pulmonary dendritic cells. Journal of Visualized Experiments. (122), e55465(2017).
  29. Klouda, T., Kim, H., Kim, J., Visner, G., Yuan, K. Precision cut lung slices as an efficient tool for ex vivo pulmonary vessel structure and contractility studies. Journal of Visualized Experiments. (171), e62392(2021).
  30. Ghaidan, H., et al. Reduction of primary graft dysfunction using cytokine adsorption during organ preservation and after lung transplantation. Nature Communications. 13 (1), 1-15 (2022).
  31. Guenthart, B. A., et al. Regeneration of severely damaged lungs using an interventional cross-circulation platform. Nature Communications. 10 (1), 1985(1985).
  32. Ruaro, B., et al. The history and mystery of alveolar epithelial type II cells: focus on their physiologic and pathologic role in lung. International Journal of Molecular Sciences. 22 (5), 2566(2021).
  33. Crapo, J. D., Barry, B. E., Gehr, P., Bachofen, M., Weibel, E. R. Cell number and cell characteristics of the normal human lung. The American Review of Respiratory Disease. 126 (2), 332-337 (1982).
  34. Evans, K. V., Lee, J. -H. Alveolar wars: The rise of in vitro models to understand human lung alveolar maintenance, regeneration, and disease. Stem Cells Translational Medicine. 9 (8), 867-881 (2020).
  35. Chen, J. -X., et al. Sirtuin 3 ameliorates lung senescence and improves type II alveolar epithelial cell function by enhancing the FoxO3a-dependent antioxidant defense mechanism. Stem Cells and Development. 30 (17), 843-855 (2021).
  36. Zacharias, W. J., et al. Regeneration of the lung alveolus by an evolutionarily conserved epithelial progenitor. Nature. 555 (7695), 251-255 (2018).
  37. Gonzalez, R. F., Allen, L., Gonzales, L., Ballard, P. L., Dobbs, L. G. HTII-280, a biomarker specific to the apical plasma membrane of human lung alveolar type II cells. Journal of Histochemistry & Cytochemistry. 58 (10), 891-901 (2010).

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Mots-clés

Enrobage dans l agarosecoupes de tissu pulmonairemarquage par immunofluorescenceexpression prot ique spatialemicroscopie feuille de lumi remod le de transplantation pulmonairer cup ration d antig nepneumocytes de type II

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