Suivi de l’apprentissage de la motricité fine et associative chez la souris à l’aide de l’échelle Erasmus

Résumé

Cet article présente un protocole qui permet une évaluation non invasive et automatisée des performances de motricité fine, ainsi qu’un apprentissage moteur adaptatif et associatif lors de défis, à l’aide d’un dispositif appelé Erasmus Ladder. La difficulté de la tâche peut être titrée pour détecter une déficience motrice allant de degrés majeurs à subtils.

Résumé

Le comportement est façonné par les actions, et les actions nécessitent des habiletés motrices telles que la force, la coordination et l’apprentissage. Aucun des comportements essentiels au maintien de la vie ne serait possible sans la capacité de passer d’une position à une autre. Malheureusement, la motricité peut être compromise dans un large éventail de maladies. Par conséquent, l’étude des mécanismes des fonctions motrices aux niveaux cellulaire, moléculaire et des circuits, ainsi que la compréhension des symptômes, des causes et de la progression des troubles moteurs, sont cruciales pour développer des traitements efficaces. Des modèles de souris sont fréquemment utilisés à cette fin.

Cet article décrit un protocole qui permet de surveiller divers aspects de la performance motrice et de l’apprentissage chez la souris à l’aide d’un outil automatisé appelé l’échelle Erasmus. L’essai comporte deux phases : une phase initiale où les souris sont entraînées à naviguer sur une échelle horizontale construite à partir d’échelons irréguliers (« apprentissage de la motricité fine »), et une deuxième phase où un obstacle est présenté sur le chemin de l’animal en mouvement. La perturbation peut être inattendue (« apprentissage moteur contesté ») ou précédée d’une tonalité auditive (« apprentissage moteur associatif »). La tâche est facile à effectuer et est entièrement prise en charge par un logiciel automatisé.

Ce rapport montre comment les différentes lectures du test, lorsqu’elles sont analysées avec des méthodes statistiques sensibles, permettent un suivi fin de la motricité des souris à l’aide d’une petite cohorte de souris. Nous proposons que la méthode soit très sensible pour évaluer les adaptations motrices induites par des modifications environnementales ainsi que les déficits moteurs subtils à un stade précoce chez des souris mutantes dont les fonctions motrices sont compromises.

Introduction

Divers tests ont été mis au point pour évaluer les phénotypes moteurs chez la souris. Chaque test donne des informations sur un aspect spécifique du comportement moteur¹. Par exemple, le test en champ libre informe sur la locomotion générale et l’état d’anxiété ; les tests de Rotarod et de poutre de marche sur la coordination et l’équilibre ; L’analyse de l’empreinte est une question de démarche ; le tapis roulant ou la roue de course lors d’un exercice physique forcé ou volontaire ; Et la roue complexe concerne l’apprentissage de la motricité. Pour analyser les phénotypes moteurs de souris, les chercheurs doivent effectuer ces tests de manière séquentielle, ce qui implique beaucoup de temps et d’efforts et souvent plusieurs cohortes animales. S’il y a de l’information au niveau cellulaire ou des circuits, l’enquêteur opte normalement pour un test qui surveille un aspect connexe et suit à partir de là. Cependant, il n’existe pas de paradigmes qui discriminent différents aspects du comportement moteur de manière automatisée.

Cet article décrit un protocole d’utilisation de l’échelle Erasmus ^2,3, un système qui permet une évaluation complète d’une variété de caractéristiques d’apprentissage moteur chez la souris. Les principaux avantages sont la reproductibilité et la sensibilité de la méthode, ainsi que la capacité de titrer la difficulté motrice et de séparer les déficits de performance motrice des troubles de l’apprentissage moteur associatif. L’élément principal se compose d’une échelle horizontale avec une alternance d’échelons hauts (H) et bas (L) équipés de capteurs tactiles qui détectent la position de la souris sur l’échelle. L’échelle est composée de 2 x 37 échelons (L, 6 mm ; H, 12 mm) espacés de 15 mm l’un de l’autre et positionnés en alternance gauche-droite avec des intervalles de 30 mm (figure 1A). Les échelons peuvent être déplacés individuellement pour générer différents niveaux de difficulté, c’est-à-dire créer un obstacle (élever les échelons supérieurs de 18 mm). Couplée à un système d’enregistrement automatisé et associant des modifications du motif de l’échelon à des stimuli sensoriels, l’échelle Erasmus teste l’apprentissage de la motricité fine et l’adaptation des performances motrices en réponse à des défis environnementaux (apparition d’un échelon supérieur pour simuler un obstacle, un stimulus inconditionné [US]) ou association avec des stimuli sensoriels (une tonalité, un stimulus conditionné [CS]). Les tests comportent deux phases distinctes, chacune évaluant l’amélioration des performances motrices sur 4 jours, au cours desquelles les souris subissent une session de 42 essais consécutifs par jour. Dans la phase initiale, les souris sont entraînées à naviguer dans l’échelle pour évaluer l’apprentissage moteur « fin » ou « qualifié ». La deuxième phase consiste en des essais entrelacés où un obstacle sous la forme d’un échelon plus élevé est présenté sur la trajectoire de l’animal en mouvement. La perturbation peut être inattendue pour évaluer l’apprentissage moteur « défié » (essais uniquement aux États-Unis) ou annoncée par une tonalité auditive pour évaluer l’apprentissage moteur « associatif » (essais appariés).

L’échelle Erasmus a été développée relativement récemment ^2,3. Il n’a pas été largement utilisé car la mise en place et l’optimisation du protocole ont nécessité un effort ciblé et ont été spécifiquement conçus pour évaluer l’apprentissage associatif cérébelleux sans explorer en détail son potentiel à révéler d’autres déficits moteurs. À ce jour, il a été validé pour sa capacité à dévoiler des déficiences motrices subtiles liées à un dysfonctionnement cérébelleux chez la souris 3,4,5,6,7,8. Par exemple, les souris knock-out connexine36 (Cx36), où les jonctions lacunaires sont altérées dans les neurones olivaires, présentent des déficits de déclenchement dus à l’absence de couplage électrotonique, mais le phénotype moteur était difficile à identifier. Des tests à l’aide de l’échelle Erasmus ont suggéré que le rôle des neurones olivaires inférieurs dans une tâche d’apprentissage moteur cérébelleux est d’encoder un codage temporel précis des stimuli et de faciliter les réponses dépendantes de l’apprentissage à des événements inattendus ^3,4. La souris knock-out de la ribonucléoprotéine 1 messager de l’X fragile (Fmr1), un modèle du syndrome de l’X fragile (FXS), présente une déficience cognitive bien connue ainsi que des défauts plus légers dans la formation de la mémoire procédurale. Les éliminateurs Fmr1 n’ont montré aucune différence significative dans les temps de pas, les faux pas par essai ou l’amélioration des performances motrices au cours des sessions de l’échelle Erasmus, mais n’ont pas réussi à ajuster leur schéma de marche à l’obstacle apparaissant soudainement par rapport à leurs compagnons de portée de type sauvage (WT), confirmant des déficits spécifiques de la mémoire procédurale et associative ^3,5. De plus, des lignées mutantes de souris spécifiques à une cellule présentant des défauts de la fonction cérébelleuse, y compris une altération de la production de cellules de Purkinje, de potentialisation et de sortie d’interneurones de couche moléculaire ou de cellules granulaires, présentaient des problèmes de coordination motrice avec une altération de l’acquisition de schémas de pas efficaces et du nombre de pas effectués pour franchir l’échelle⁶. Les lésions cérébrales néonatales entraînent des déficits d’apprentissage cérébelleux et un dysfonctionnement des cellules de Purkinje qui pourraient également être détectés avec l’échelle Erasmus ^7,8.

Dans cette vidéo, nous présentons un guide complet étape par étape, qui détaille la configuration de la salle comportementale, le protocole de test comportemental et l’analyse des données ultérieure. Ce rapport est conçu pour être accessible et convivial et est conçu spécifiquement pour aider les nouveaux arrivants. Ce protocole donne un aperçu des différentes phases de l’entraînement moteur et des schémas moteurs attendus que les souris adoptent. Enfin, l’article propose un flux de travail systématique pour l’analyse des données à l’aide d’une puissante approche de régression non linéaire, complété par de précieuses recommandations et suggestions pour adapter et appliquer le protocole dans d’autres contextes de recherche.

Protocole

Dans la présente étude, des souris adultes (âgées de 2 à 3 mois) C57BL/6J des deux sexes ont été utilisées. Les animaux ont été logés de deux à cinq par cage avec un accès ad libitum à la nourriture et à l’eau dans une unité animale sous observation et maintenus dans un environnement à température contrôlée selon un cycle d’obscurité et de lumière de 12 h. Toutes les procédures ont été menées conformément aux réglementations européennes et espagnoles (2010/63/UE ; RD 53/2013) et ont été approuvés par le Comité d’éthique de la Generalitat Valenciana et le Comité du bien-être animal de l’Université Miguel Hernández.

1. Configuration de la salle comportementale

1. Réservez la salle de test comportemental tous les jours à la même heure et établissez la liste et l’ordre des souris à utiliser, ainsi que les dispositions pour leur hébergement.
2. Gardez les souris expérimentales à l’extérieur de la salle de test afin qu’elles n’entendent pas les sons du compresseur d’air et les tonalités de l’échelle Erasmus lorsqu’elles ne sont pas testées.
3. Vérifiez que tous les composants du système Erasmus Ladder sont en ordre et prêts à l’emploi : le routeur réseau, l’ordinateur avec le logiciel (voir tableau des matériaux), le compresseur d’air, deux boîtes de but et l’échelle avec les barreaux correctement positionnés.
4. Nettoyez abondamment les boîtes de buts, l’échelle et les échelons avec de l’eau après chaque animal et avec de l’eau et de l’éthanol à 70 % à la fin de chaque journée d’entraînement.

2. Protocole de test comportemental

1. Créez une expérience et entrez le protocole dans le logiciel (figure supplémentaire S1).
   1. Mettez le logiciel sous tension.
   2. Pour créer une expérience, choisissez Fichier | Nouvelle expérience | Nouveau ou configuré | Protocole d’expérimentation.
      REMARQUE : Le protocole par défaut, utilisé dans cette étude, est nommé EMC et a été conçu au Centre médical universitaire Erasmus de Rotterdam.
   3. Donnez un nom à l’expérience et cliquez sur OK.
   4. Vérifiez que le protocole EMC par défaut sélectionné se compose de 4 jours de sessions non perturbées (42 essais non perturbés par jour) et de 4 jours de sessions de provocation (42 essais mixtes quotidiens : non perturbés, CS uniquement (tonalité), US uniquement (obstacle), appariés (obstacle annoncé par la tonalité) (voir Figure 1B). Dans le panneau latéral droit, vérifiez également le signal lumineux (durée maximale de 3 s), le signal aérien (durée maximale de 45 s) et le vent arrière (Oui dans tous les types d’essai), utilisés pour encourager la souris à traverser l’échelle, et la tonalité (250 ms, Oui uniquement dans les essais CS uniquement et appariés).
   5. Pour créer un autre protocole, choisissez Configurer | Protocole d’expérience | Nouveau | À partir de zéro ou copier à partir du protocole EMC et le modifier simplement, en éditant les lignes du tableau relatives au nombre de sessions (jours d’expérience) et au nombre et au type d’essais par jour.
      REMARQUE : Le temps de repos, le type et l’activation des repères, la durée, l’intensité et l’intervalle peuvent également être adaptés en fonction des questions expérimentales.
   6. Pour ouvrir la liste des sessions et nommer les sujets, choisissez Configuration | Liste des sessions.
   7. Cliquez sur Ajouter des sujets et des variables.
   8. Entrez chaque identifiant de souris, date de naissance, sexe, génotype et catégories pertinentes, en suivant la liste ordonnée des souris.
2. Démarrez la session (figure supplémentaire S2).
   1. Avant de commencer, vérifiez que le logiciel est ouvert, puis allumez l’échelle.
   2. Vérifiez que le compresseur d’air est connecté et allumé.
   3. Pour ouvrir la fenêtre Acquisition, ouvrez l’expérience créée.
   4. Choisissez l’acquisition | Ouvrir l’acquisition.
   5. Placez la souris avec l’identifiant indiqué par le logiciel dans la case de départ de l’objectif (côté droit de l’échelle).
   6. Sélectionnez l’identifiant de la souris à acquérir lors de la première session.
   7. Cliquez sur Démarrer l’acquisition.
   8. Appuyez 3 fois sur le bouton rouge du menu de l’échelle . Vérifiez que la session démarre et contrôle et enregistre automatiquement les mouvements de la souris jusqu’à la fin de la dernière période d’essai de la session.
3. Mettez fin à la session.
   1. Vérifiez qu’à la fin de la 42^e essai, l’écran affiche les messages Envoi de données et Acquis.
   2. Remettez la souris dans la cage d’accueil.
   3. Nettoyez l’échelle et les boîtes de but.
   4. Placez la souris suivante et répétez à partir de l’étape 2.2.6.
4. Effectuez le type de session sélectionné tous les jours jusqu’à la fin du protocole. Répétez les étapes 2.2 et 2.3 tous les jours selon le protocole sélectionné.
5. Exportez les données (figure supplémentaire S2).
   1. Pour visualiser les données enregistrées, choisissez dans le menu Analyse , Statistiques d’essai, Statistiques de session et Statistiques et graphiques de groupe.
      REMARQUE : Les données peuvent être téléchargées sous forme de feuille de calcul avec les données des essais individuels et les moyennes des mêmes types d’essais au cours d’une session. Les sessions peuvent également être filtrées en fonction des variables choisies pour une analyse spécifique.
   2. Cliquez sur le bouton Exporter dans le coin supérieur droit, en choisissant le format de fichier (feuille de calcul) et l’emplacement du dossier.
   3. Cliquez avec le bouton droit de la souris sur les graphiques générés automatiquement et sélectionnez Enregistrer dans un fichier au format *.jpg.

3. Analyse des données

REMARQUE : Une liste de paramètres est automatiquement mesurée par l’échelle Erasmus sur la base de l’enregistrement instantané des activités des capteurs tactiles. Pour l’analyse, les paramètres de sortie sélectionnés par l’utilisateur sont organisés et traités dans les feuilles de calcul. En plus des graphiques générés par logiciel, les utilisateurs peuvent générer des graphiques à l’aide du logiciel graphique de leur choix pour visualiser les changements spécifiques de différents paramètres au cours des sessions.

1. Choisissez des paramètres spécifiques pour analyser la motivation de base ou les états d’anxiété, les réponses sensorielles, les performances motrices et l’apprentissage de la motricité fine au cours des 4 premiers jours.
   1. Sélectionnez et tracez les paramètres de contrôle, y compris le temps de repos dans la zone de but et le temps de sortie de la boîte de but après la période de repos en réponse aux signaux de lumière et d’air (Figure 2A).
      REMARQUE : Les temps de repos ou de réponse aux signaux sont relativement constants chez les souris WT. D’autres paramètres tels que la fréquence des sorties sont fondamentalement négligeables chez les souris WT - les animaux quittent rarement la boîte de repos sans les signaux ou reviennent une fois dans l’échelle, ce qui entraîne des fréquences de sortie égales à 1 par essai. Si un animal sort avant que les signaux ne soient appliqués, un flux d’air est activé, forçant la souris à revenir à la boîte de but ; Ceci n’est pas considéré comme une version d’essai par le logiciel.
   2. Sélectionnez et tracez le temps passé sur l’échelle après les repères, mesuré comme le temps passé à traverser l’échelle une fois que la souris a quitté la boîte de but (Figure 2B).
      REMARQUE : Une régression non linéaire de puissance est une méthode robuste d’évaluation de l’apprentissage. Les coefficients de Pearson ou de Spearman (R) permettront de déterminer si l’ajustement des données est bon (valeurs R proches de un lorsque les animaux apprennent/s’améliorent au fil des sessions ; Les valeurs R proches de 0 impliquent que les données sont constantes et que les souris n’apprennent pas).
   3. Sélectionnez et tracez les paramètres du modèle de pas à pas , tels que le pourcentage d’essais avec des faux pas en tant que paramètre d’apprentissage sensible (Figure 2C).
      1. Définissez un pas correct comme un pas d’un échelon haut à un autre échelon haut (H-H), quelle que soit la longueur du pas. Considérez les types de pas qui impliquent un échelon inférieur comme des faux pas.
      2. Divisez les pas corrects et les faux pas en pas courts et longs, en pas en arrière et en sauts en fonction de la longueur et de la directionnalité du pas entre les échelons enfoncés (voir Figure 1A).
2. Sélectionner et tracer des paramètres spécifiques pour évaluer l’apprentissage moteur (essais aux États-Unis uniquement) et l’apprentissage associatif (essais par paires) au cours des 4 derniers jours.
   1. Sélectionnez et tracez l’heure sur l’échelle après les repères (Figure 3).
   2. Sélectionnez et tracez le pourcentage d’essais comportant des faux pas (Figure 4A).
   3. Sélectionnez et tracez les temps de pas avant et après la perturbation, définis comme une différence de précision ms entre l’activation de l’échelon juste avant (étape de contrôle) et après l’obstacle (étape adaptée) du même côté de l’échelle (Figure 4B).
      REMARQUE : Une analyse des temps de pas avant et après la perturbation doit être effectuée pour comparer les données à l’intérieur de chaque type de session. Le paramètre mesure la capacité des souris à prédire et à surmonter les obstacles lors de l’apprentissage associatif.
3. Analysez les données à l’aide d’un logiciel statistique dédié (par exemple, SigmaPlot). Effectuez une analyse de régression non linéaire des données collectées à partir du même type d’essai à travers les sessions pour décrire le processus d’apprentissage plus efficacement et utilisez l’ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles (RM) pour comparer les types d’essais.

Résultats

Le dispositif Erasmus Ladder, la configuration et le protocole appliqué sont présentés à la figure 1. Le protocole se compose de quatre séances non perturbées et de quatre séances de provocation (42 essais chacune). Chaque essai est une course sur l’échelle entre les boîtes de but de départ et d’arrivée. Au début de la session, une souris est placée dans l’une des cases de départ. Après un temps réglé de 15 ± 5 s (état « repos »), la lumière s’allume (repère 1, pour un maximum de 3 s). Un si...

Discussion

L’échelle Erasmus présente des avantages majeurs pour l’évaluation du phénotype moteur au-delà des approches actuelles. Les tests sont faciles à réaliser, automatisés, reproductibles et permettent aux chercheurs d’évaluer divers aspects du comportement moteur séparément à l’aide d’une seule cohorte de souris. Dans la présente étude, la reproductibilité a permis de générer des données robustes avec un petit nombre de souris WT tirant parti des caractéristiques du dispositif, de la conception expérimentale et des méthodes ...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
souris C57BL/6J (Mus musculus)	Charles Rivers
Erasmus Ladder device	Noldus, Wageningen, Netherlands
Ladder 2.0 software	Noldus, Wageningen, Netherlands
Excel software	Microsoft  ;
Logiciel Sigmaplot	Systat Software, Inc.