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Quantification du taux de colonisation par les champignons mycorhiziens arbusculaires dans l’étude des plantes exotiques envahissantes

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DOI :

10.3791/65971

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1 décembre 2023

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1State Key Laboratory for Biology of Plant Diseases and Insect Pests, Institute of Plant Protection, Chinese Academy of Agricultural Sciences

Dans cet article

Résumé

Ce protocole fournit une approche simple et facile à utiliser pour déterminer le taux de colonisation des champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) dans les racines des plantes envahissantes.

Résumé

Les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) sont des champignons du sol largement répandus dans les écosystèmes et peuvent former des associations symbiotiques (mycorhizes) avec les racines de la plupart des plantes terrestres. Les plantes fournissent des sources de carbone aux CMA par le biais d’associations mycorhiziennes, tandis que les hyphes des CMA peuvent élargir la gamme d’absorption des nutriments par les racines et favoriser l’absorption des nutriments par les plantes. Il existe de nombreuses espèces différentes de CMA, et les relations symbiotiques entre les différentes espèces de CMA et les différentes plantes varient. Les plantes envahissantes peuvent enrichir les espèces de CMA avec de meilleures capacités symbiotiques grâce aux exsudats racinaires, favorisant ainsi leur croissance et augmentant ainsi leur colonisation dans les racines des plantes envahissantes. Dans le même temps, les plantes envahissantes peuvent également perturber la relation symbiotique entre les CMA et les plantes indigènes, affectant la communauté végétale locale, ce qui est l’un des mécanismes d’une invasion végétale réussie. Le taux de colonisation des CMA dans les racines des plantes envahissantes et indigènes reflète indirectement le rôle des CMA dans le processus d’invasion des plantes envahissantes. Dans cette méthode, les racines de plantes collectées peuvent être traitées directement ou conservées dans un fixateur pour un traitement ultérieur par lots. Grâce à la décoloration, à l’acidification, à la coloration et au traitement de décoloration des racines, les hyphes, les spores et les structures arbusculaires des CMA dans le système racinaire peuvent être clairement observés. Cette méthode peut être complétée en laboratoire de base pour observer et calculer le taux de colonisation des CMA dans les systèmes racinaires des plantes envahissantes.

Introduction

Les champignons mycorhiziens sont répandus dans les écosystèmes naturels et établissent des relations symbiotiques avec les racines de la plupart des plantes, formant des mycorhizes1. Ces associations sont mutuellement bénéfiques, car les plantes fournissent des composés carbonés fixés photosynthétiquement tels que des acides gras et des sucres pour soutenir la croissance des champignons mycorhiziens, tandis que les champignons rendent la pareille en fournissant des nutriments minéraux comme le phosphore et l’azote aux plantes hôtes, favorisant ainsi la croissance des plantes2. Sur la base de leurs types mycorhiziens formés avec des racines de plantes, les champignons mycorhiziens peuvent être divisés en quatre types principaux : les champignons ectomycorhiziens (ECM), les champignons mycorhiziens éricoïdes (ERM), les champignons mycorhiziens d’orchidée (ORM) et les champignons mycorhiziens arbusculaires (AM)1. Parmi eux, les champignons mycorhiziens arbusculaires (CMA) ont la distribution la plus large et peuvent former des associations mycorhiziennes avec plus de 80 % des espèces végétales 3,4.

Les CMA jouent un rôle crucial dans l’amélioration du cycle des nutriments du sol5, l’amélioration de l’absorption des nutriments par les plantes6 et la régulation de la concurrence et de la succession des plantes. Ils jouent un rôle important dans le processus d’invasion des espèces végétales envahissantes 7,8. La FMA, classée dans l’embranchement des Mucoromycota9, comprend plus de 250 espèces10. Les relations symbiotiques spécifiques entre les différentes espèces de CMA et les différentes plantes peuvent varier. Les espèces végétales envahissantes ont le potentiel de modifier la diversité des CMA et de favoriser l’enrichissement des espèces de CMA avec de meilleures capacités symbiotiques qui contribuent à leur avantage concurrentiel pendant la croissance et la colonisation 8,11,12,13. Comprendre la dynamique des CMA et leurs interactions avec les espèces végétales envahissantes est essentiel pour comprendre les mécanismes sous-jacents aux invasions végétales et leurs impacts écologiques.

Les études qualitatives des espèces de CMA impliquent généralement deux méthodes principales. L’une d’entre elles est l’identification morphologique, comme la collecte des spores de CMA dans le sol à l’aide de méthodes telles que le tamisage humide et la centrifugation du saccharose, suivie de la classification et de la quantification des spores en fonction de leur morphologie14. L’autre méthode implique des techniques moléculaires, amplifiant les régions conservées des gènes AMF et les séquençant pour l’identification15. Cependant, ces méthodes nécessitent souvent une grande expérience de l’identification morphologique ou des ressources financières plus importantes. D’autre part, les études quantitatives des taux de colonisation des CMA, bien qu’elles ne puissent pas déterminer les changements dans les espèces et la composition des CMA, fournissent tout de même une évaluation complète de la relation symbiotique entre les CMA et les plantes. De telles études sont indispensables à la fois pour la recherche fondamentale et les travaux de validation ultérieurs des expériences d’inoculation.

La colonisation des CMA joue un rôle crucial dans la détermination de la répartition des ressources entre les espèces végétales coexistantes7. Il reflète l’établissement et la force de la relation symbiotique entre les CMA et les racines des plantes hôtes. Dans le même habitat, les espèces végétales envahissantes présentent souvent des taux de colonisation plus élevés que les plantes indigènes16,17. Cette colonisation accrue de la CMA contribue à l’invasion réussie d’espèces envahissantes telles que Ambrosia artemisiifolia18, Solidago canadensis19, Sapium sebiferum20, Ageratina adenophora21, Sphagneticola trilobata22 et Flaveria bidentis7. La compréhension du taux de colonisation de la CMA dans les racines des plantes envahissantes fournit une base pour démêler les mécanismes microbiens du sol qui sous-tendent l’invasion réussie de ces espèces. L’étude du taux de colonisation des CMA dans les racines des plantes envahissantes met en lumière les implications écologiques des interactions plantes-microbes et contribue à notre compréhension des mécanismes à l’origine des invasions de plantes.

La détermination du taux de colonisation par les CMA fait appel à une technique de microscopie de coloration, qui comprend plusieurs étapes : préservation des racines, clarification, acidification, coloration, décoloration et examen microscopique (figure supplémentaire 1). Au cours des dernières décennies, les chercheurs ont exploré diverses méthodes d’observation des CMA et ont développé diverses techniques de coloration. Dans les premiers stades, la coloration au bleu de trypan était largement utilisée23,24. Cependant, cette méthode présente des limites en raison de la toxicité du bleu de trypan. La coloration à l’acide fuchsin, en revanche, est une méthode couramment utilisée qui fournit des couleurs vives et montre des résultats de coloration fiables et stables25. De plus, la solution de coloration peut être réutilisée, ce qui la rend plus rentable. Le taux de colonisation est déterminé à l’aide de la méthode de l’intersection quadrillée, qui fournit des résultats statistiques plus objectifs par rapport aux autres approches26. Cette méthode se caractérise par sa simplicité, son faible coût et ses exigences minimales en matière d’équipement, ce qui permet de la réaliser dans des environnements de laboratoire de base. Il propose une approche pratique et accessible pour évaluer le taux de colonisation des CMA et contribue à notre compréhension des associations symbiotiques entre les CMA et les racines des plantes.

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Protocole

Nous avons mené des expériences en utilisant une plante envahissante F. bidentis et une plante indigène Setaria viridis. Les deux plantes ont été cultivées dans des parcelles expérimentales à la base pilote de recherche scientifique Langfang de l’Académie chinoise des sciences agricoles (CAAS), dans le Hebei, en Chine. Chaque espèce végétale a été plantée individuellement dans des parcelles séparées, chaque parcelle mesurant 2 m x 3 m avec un espace de 1 mètre entre les parcelles. Les plantes ont été laissées pousser naturellement et, après environ deux mois, des échantillons de racines ont été prélevés.

1. Préparation et conservation des racines

  1. Pour chaque parcelle, sélectionnez au hasard trois plantes ayant des conditions de croissance similaires. Ameublissez le sol autour des plantes avec une pelle et retirez doucement les plantes. Après avoir secoué le sol des racines, coupez tout le système racinaire et apportez-le au laboratoire. Rincez soigneusement les échantillons de racines collectés sous l’eau courante et mélangez les racines de trois plantes dans la même parcelle pour former une répétition.
    REMARQUE : Pour faciliter la description du processus opérationnel, ce protocole fournit des instructions pour une répétition biologique. Pour garantir la fiabilité des résultats expérimentaux, il est recommandé de prélever des échantillons d’au moins trois réplicats biologiques conformément au plan d’expérience pendant les opérations réelles.
  2. Utilisez un papier filtre pour éliminer l’excès d’humidité des racines nettoyées et laissez-les sécher à l’air.
  3. Utilisez des ciseaux pour couper les racines endommagées, coupez les racines fines intactes et conservez-les pour le stockage ou passez à l’étape suivante. Si vous passez à l’étape suivante dans les 2 jours, conservez-les au réfrigérateur à 4 °C. Pour conserver les échantillons de racines en vue d’une utilisation ultérieure, conservez-les dans une solution fixatrice, telle qu’une solution de formolo-acéto-alcool (FAA, 5 ml de formol à 38 % + 5 ml d’acide acétique + 90 ml d’alcool à 70 %).
    REMARQUE : Le fixateur de la FAA n’est PAS obligatoire. S’il n’y a qu’un petit nombre d’échantillons et qu’ils peuvent tacher et compter les racines dans un court laps de temps après la collecte, sautez l’étape de fixation de la FAA et procédez directement après avoir lavé le sol des racines. Lors de l’utilisation d’un fixateur FAA, assurez-vous que l’opération est effectuée dans un endroit bien ventilé en raison de la présence de formaldéhyde.

2. Coloration des racines

  1. Retirez les racines préservées de la solution de stockage et rincez-les. Placez les racines dans un bécher de 100 ml et ajoutez environ 50 ml de solution à 10 % de KOH (10 g de KOH + 100 ml d’eau), en vous assurant que toutes les racines sont complètement immergées dans la solution. Chauffer le bécher à 90 °C pendant 30 min.
    REMARQUE : Ajustez le temps de chauffage en fonction de la maturité des racines. Cette étape permet d’éliminer les pigments des racines, les rendant transparentes pour l’observation microscopique.
  2. Versez la solution de KOH du bécher et rincez doucement l’échantillon de racine avec de l’eau du robinet 3x-6x pour éliminer tout KOH restant. Videz l’excès d’eau.
    REMARQUE : Assurez-vous que le bécher et tous les outils utilisés sont soigneusement nettoyés des résidus de KOH, car tout reste peut entraîner une acidification incomplète à l’étape suivante, affectant ainsi l’efficacité de la coloration de l’acide fuchsin.
  3. Ajoutez une solution HCl à 2 % dans le bécher, en vous assurant que le liquide recouvre complètement les racines. Laissez les racines tremper dans la solution acide à température ambiante pendant 10 min.
  4. Jeter la solution de HCl du bécher et ajouter environ 50 ml de solution de fuchsine acide à 0,01 % (874 ml d’acide lactique, 63 ml de glycérol, 63 ml d’eau distillée, 0,1 g de fuchsine acide). Teindre les racines à 90 °C pendant 20 à 60 min. Après la coloration, la solution acide de fuchsine peut être récupérée et réutilisée pour une coloration future.
    NOTE: Le temps de coloration peut varier en fonction de l’âge et de l’état des racines, les racines plus jeunes et tendres nécessitant potentiellement une coloration nocturne à température ambiante.

3. Décoloration et microscopie

  1. Placez les racines colorées dans environ 50 ml de solution d’acide lactique (85 %) pour éliminer l’acide fuchsine des cellules racinaires. Le traitement de séparation entraînera la coloration rouge des tissus AMF, tandis que les cellules racinaires resteront incolores ou colorées en rouge clair. Le cylindre central peut apparaître rouge.
  2. Observez les tissus racinaires et les tissus fongiques au microscope 200x pour assurer une distinction claire avant d’arrêter la décoloration. Lorsque la structure de l’AMF et les cellules racinaires ont pu être clairement distinguées, le processus de décoloration a pu être terminé.
    REMARQUE : Ajustez le temps de décoloration en fonction de la maturité de la racine. Au cours du processus, sélectionnez quelques racines pour la préparation de la courge afin de les observer au microscope.
  3. Retirez les racines de la solution d’acide lactique et transférez-les dans environ 50 ml de solution de glycérol (99 %). La fuchsine acide dans la structure de l’AMF et les cellules racinaires ne se sépare plus et peut être utilisée pour un examen microscopique ultérieur.
  4. Placez une goutte de glycérol sur une lame de verre. Pour chaque répétition, sélectionnez au hasard 30 à 50 racines, coupez des segments de racine de 1 cm de long dans chaque racine. Disposez-les sur des lames de verre avec du glycérol, parallèlement au côté court de la lame, et placez-les parallèlement l’une à l’autre (Figure supplémentaire 1). Placez 10 sections racines sur chaque lame, ce qui donne 3 à 5 répétitions pour chaque répétition.
    REMARQUE : Cette étape décrit le nombre de segments racines utilisés pour l’observation, en se référant au nombre de répétitions techniques pour chaque répétition. Le nombre de segments racinaires observés pour chaque échantillon doit être raisonnablement disposé en fonction de l’espèce végétale et de la morphologie des racines. Pour les racines fines, l’observation de 30 à 50 segments racinaires, chacun de 1 cm de long, par échantillon est suffisante. Cependant, pour les racines plus grosses, comme celles du maïs, il est nécessaire d’augmenter le nombre d’observations de manière appropriée. Pour garantir la fiabilité des résultats statistiques, chaque traitement doit comporter au moins 3 réplicats biologiques, et chaque réplication biologique doit être opérée selon la méthode susmentionnée.
  5. Couvrir avec une lamelle. Après avoir placé la lamelle, évitez de déplacer horizontalement les échantillons pour éviter tout frottement ou déformation des racines. Cela garantit que l’état normal de la morphologie des hyphes peut être observé sans interférence, ce qui maintient la précision des calculs du taux de colonisation.
  6. À l’aide d’un microscope 200x, utilisez la méthode de comptage croisé pour déterminer le taux de colonisation en vous référant au schéma (figure supplémentaire 2).
    1. Installez un micromètre avec réticule dans l’oculaire du microscope. Déplacez le champ de vision à une extrémité de la racine et alignez l’un des réticules parallèlement à la racine. Observez si l’autre ligne croise les hyphes, les arbuscules ou les vésicules.
    2. Déplacez le champ de vision le long de la direction de la racine vers l’autre extrémité, en vous déplaçant à chaque fois de la même distance en fonction des coordonnées de la platine du microscope. Enregistrez les intersections dans chaque champ de vision à l’aide d’une approche binaire (0 ou 1). Si l’autre réticule croise des hyphes, des arbuscules ou des vésicules AMF, il est enregistré comme 1 dans la cellule correspondante de la table. Sinon, il est enregistré comme 0. S’il n’y a pas d’intersection avec l’une des structures AMF, il est enregistré comme 1 dans la zone négative. Observer 10 champs de vision pour chaque segment racinaire, pour un total de 100 observations obtenues par lame, ce qui donne 300 à 500 observations par échantillon de plante.

4. Calcul du taux de colonisation

  1. D’après le nombre enregistré d’intersections avec des hyphes (H), des arbuscules (A) et des vésicules (V) et non mycorhiziennes (N) dans les 10 racines de chaque lame (comme le montre le tableau 1), calculez les taux de colonisation comme suit :

    Taux de colonisation des hyphes = (AH / AT) × 100 %
    Taux de colonisation arbusculaire = (AA / AT) × 100 %
    Taux de colonisation vésiculaire = (AV / AT) × 100 %
    Taux de colonisation total = [(AT - AN) / AT] × 100 %

    Où:
    AH : Nombre d’intersections avec des hyphes
    AA : Nombre d’intersections avec arbuscules
    AV : Nombre d’intersections avec vésicules
    AT : Nombre total d’intersections
    AN : Nombre d’intersections avec des racines non mycorhiziennes

    Ces calculs fournissent les taux de colonisation pour chaque structure (hyphes, arbuscules et vésicules) et le taux de colonisation global, qui est la somme des taux de colonisation pour toutes les structures.
TraitementGlisserNombre d’intersections
NégatifHyphesArbusculesVésiculesTotal
Echantillon 1Diapositive 1AN1AH1AA 1AV1AT1
Diapo 2AN2AH2AA 2AV2AT2
Diapo 3AN3AH3AA 3AV3AT3
TotalANAHAAAVL

Tableau 1 : Tableau statistique des taux de colonisation des champignons mycorhiziens arbusculaires. Abréviations : AH = Nombre d’intersections avec des hyphes ; AA = Nombre d’intersections avec arbuscules ; AV = Nombre d’intersections avec vésicules ; AT = Nombre total d’intersections ; AN = Nombre d’intersections avec des racines non mycorhiziennes.

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Résultats

Les résultats de coloration des racines des plantes envahissantes à l’aide de cette méthode sont illustrés à la figure 1. Les structures (hyphes, arbuscules, spores et vésicules) de l’AMF sont colorées en rouge, les cellules du cortex racinaire sont colorées en rouge clair après décoloration et le cylindre central est coloré en rouge. Ce résultat de coloration est suffisant pour distinguer les structures fongiques car les CMA existent principalement dans le cortex de la plante. À partir du r...

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Discussion

Les interactions entre les plantes envahissantes et les CMA sont complexes et diverses. L’étude de ces interactions est cruciale pour comprendre le succès des plantes envahissantes et leurs effets écologiques. Ils peuvent influencer la capacité envahissante des plantes, la structure et la fonction des écosystèmes du sol et la compétitivité des plantes indigènes. Le taux de colonisation sert d’indicateur important pour étudier la relation entre les plantes envahissantes et les CMA. Il fou...

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Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été financé par le National Key R&D Program of China (2021YFD1400100, 2021YFC2600400 et 2022YFC2601100), et par la National Science Foundation of China (42207162).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
70 % d’alcoolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdR433197
solution d’acide acétiqueShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA116166
Acide fuchsinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdA104917
solution de formaldéhyde, FormalinShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdF111941
GlycérolShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdG116203
Acide chlorhydrique, HClShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdH399657
Acide lactiqueShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdL432769
Microscope manuel BX43Olympus (China) co., Ltd
Potassium hydroxyde, KOHShanghai Aladdin Biochemical Technology Co., LtdP112284

Références

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Mots-clés

Colonisation mycorrhizienneTaux de colonisation racinaireSymbiose racinaire des plantesColoration des FAMAbsorption des nutriments par la planteD coloration des racinesChampignons du solAssociations symbiotiques
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