Réalisation d’études d’expression de transgènes à haut débit à l’aide de la manipulation automatisée de liquides pour les protoplastes de feuilles de maïs étiolées

Summary

Ce protocole décrit la création d’un schéma de transfection aléatoire à l’aide d’un manipulateur de liquide automatisé, d’un protocole d’isolement du protoplaste pour les feuilles de maïs étiolées et d’une procédure de transfection à 96 puits à l’aide d’un manipulateur de liquide.

Abstract

Le domaine de la biotechnologie végétale a connu des progrès remarquables ces dernières années, révolutionnant la capacité de manipuler et d’organiser des plantes à diverses fins. Cependant, à mesure que la recherche dans ce domaine gagne en diversité et devient de plus en plus sophistiquée, le besoin de solutions de dépistage transitoire précoces, efficaces, fiables et à haut débit pour affiner les stratégies menant à une transformation stable est plus évident. Une méthode qui a réapparu ces dernières années est l’utilisation du protoplaste végétal, pour lequel des méthodes d’isolement et de transfection sont disponibles dans de nombreuses espèces, tissus et stades de développement. Ce travail décrit un protocole automatisé simple pour la préparation aléatoire d’un plasmide dans une plaque de 96 puits, une méthode pour l’isolement du protoplaste de feuille de maïs étiolée et une procédure de transfection automatisée. L’adoption de solutions automatisées en biotechnologie végétale, illustrée par ces nouveaux protocoles de manipulation des liquides pour la transfection des protoplastes végétaux, représente une avancée significative par rapport aux méthodes manuelles. En tirant parti de l’automatisation, les chercheurs peuvent facilement surmonter les limites des méthodes traditionnelles, améliorer l’efficacité et accélérer les progrès scientifiques.

Introduction

La transfection de protoplastes végétaux, l’introduction de matériel génétique étranger dans des cellules végétales dépourvues de parois cellulaires, est une technique essentielle et, au cours du dernier demi-siècle, elle a englobé de nombreuses espèces à l’appui de la recherche en biotechnologie végétale. Cependant, l’utilisation de ces méthodes peut être douloureuse et de portée limitée, même avec des millions de protoplastes produits par isolement. Les méthodes traditionnelles de transfection de protoplastes végétaux sont souvent laborieuses, longues, sujettes à la variabilité et techniquement exigeantes, ce qui conduit à des systèmes de niche à faible reproductibilité¹. Cependant, le potentiel introduit par les solutions automatisées ces dernières années met en lumière la possibilité de donner un nouveau souffle à cette technique vieille de 60 ans ^2,3. Grâce à la possibilité d’automatiser des étapes cruciales mais répétitives telles que la préparation des matériaux, l’incubation du polyéthylène glycol (PEG) et la distribution ultérieure de réactifs par transfection, les chercheurs peuvent réduire considérablement les exigences de manipulation physique et d’autres sources potentielles d’erreur humaine⁴. De plus, le contrôle précis et l’uniformité offerts par les systèmes automatisés de manipulation des liquides garantissent des résultats de transfection cohérents et reproductibles.

Alors que l’isolement des protoplastes est un processus méticuleux qui implique le hachage, la digestion, l’incubation, la filtration et la centrifugation, la partie transfection de ces protocoles est conçue sur mesure pour les manipulateurs de liquides automatisés. La procédure pour la plupart des protocoles de transfection de protoplastes est médiée par le PEG, et le mélange du protoplaste isolé en présence de PEG et d’ADN plasmidique purifié pendant une durée spécifiée à une concentration précise (en fonction de l’espèce et du tissu) permet à ces cellules d’absorber l’ADN plasmidique⁵. Cette transfection est suivie d’une série d’étapes de lavage, qui aboutissent à une incubation d’une nuit⁶. Après la période d’incubation, si tout a été conçu et livré correctement, l’expérience aboutit à l’expression de la composante d’intérêt et/ou au potentiel d’évaluation des différentes composantes réglementaires⁷. Toutes les étapes d’aspiration, de distribution et d’agitation/mélange associées à cette procédure seraient normalement gérées par une pipette manuelle. L’exécution d’un tel protocole à la main, une réaction individuelle à la fois, est laborieuse et introduit des variations inutiles entre les échantillons tout en limitant la capacité pouvant être évaluée à un moment donné. Les protocoles automatisés de manipulation de cellules de mammifères ou d’insectes et de synthèse chimique dans l’industrie pharmaceutique sont en pratique depuis plusieurs années ^4,8,9. L’utilisation de Protoplast et les protocoles impliquant la manipulation automatisée de liquides de matières végétales sont en hausse 10,11,12,13.

L’adoption de protocoles automatisés de manipulation de liquides pour la transfection de protoplastes végétaux est très prometteuse pour les applications de recherche. Les chercheurs peuvent explorer de plus grandes bibliothèques génétiques, dépister des fonctions génétiques spécifiques à un rythme accéléré et étudier plus complètement les interactions génétiques complexes liées au stress des plantes¹⁴. L’évolutivité des approches automatisées utilisant des pods de 96 puits combinée au criblage par fluorescence permet des expériences à haut débit et permet aux scientifiques de générer rapidement des données et des informations qui peuvent alimenter les progrès de la biotechnologie végétale¹¹. Cependant, avec cette augmentation du débit, conduisant à la génération de centaines, voire de milliers de points de données, il doit y avoir un contrôle qualité supplémentaire qui tient compte de toutes les sources d’erreur susceptibles de fausser les résultats¹⁵. L’effet de bord est un élément qui a été identifié comme un facteur contributif dans de nombreuses disciplines scientifiques. Certaines stratégies d’atténuation suggéreront la meilleure plaque à utiliser ou à remplir l’espace entre les puits ou les puits les plus extérieurs avec de l’eau pour lutter contre ce phénomène^16,17. Cependant, ces stratégies ajoutent du temps, et si un jetable spécifique n’est pas disponible, la seule option est de se contenter de moins ou de reporter. Par ailleurs, l’examen des stratégies qui tiennent compte de cet effet via un schéma de blocage ne sacrifie pas le débit ou le délai d’exécution.

Ce protocole de protoplaste de feuille de maïs étiolée et ses deux méthodes automatisées illustrées à la figure 1 cherchent à répondre à la variabilité inhérente aux expériences de protoplaste en automatisant plusieurs parties de la méthode canonique des protoplastes, l’allocation de matériel plasmidique au récipient utilisé pour la transfection et la transfection elle-même. Ces méthodes sont démontrées pour la plate-forme de protoplaste de feuille de maïs étiolée, car il s’agit d’une plate-forme de protoplaste bien caractérisée, simple et efficace. Toutes les étapes détaillées ici sont immédiatement accessibles aux protocoles de transfection protoplaste, qui utilisent des solutions tampons similaires ou identiques. Cependant, une attention particulière aux caractéristiques uniques des tissus et des espèces sources de protoplastes doit être prise en compte avant l’adoption de ces techniques. Ces améliorations grâce à l’automatisation simplifient la préparation du matériel pour des expériences individuelles et améliorent considérablement le débit, passant d’une transfection séquentielle une par une à 96 transfections traitées simultanément. Ce travail montrera également la justification de l’utilisation de blocs incomplets randomisés pour tenir compte du biais de position des plaques.

Protocol

1. Création de plaques de transfection

1. Création de l’agencement du deck : pour créer une méthode de randomisation des plaques d’ADN, ouvrez le logiciel de traitement des liquides. Cliquez sur le bouton Nouvelle méthode dans la barre de menu pour créer une nouvelle méthode. Ajoutez une ligne de configuration de l’instrument entre les lignes de début et de fin en appuyant sur le bouton de configuration de l’instrument sur le panneau de gauche.
   REMARQUE : Les captures d’écran pertinentes qui suivent ce protocole automatisé se trouvent dans les figures supplémentaires 1, 2 et 3.
2. Cliquez sur la ligne Instrument Setup (Configuration de l’instrument ), recherchez le matériel de laboratoire approprié dans le menu des catégories Labware et faites-le glisser sur la disposition du pont, comme illustré à la figure supplémentaire 1.
   REMARQUE : Si le matériel de laboratoire n’est pas défini au préalable, il devra être programmé dans le manipulateur de liquide conformément aux spécifications du fabricant, mais ces instructions ne relèvent pas du champ d’application de ce protocole.
3. Transfert à partir de la configuration du fichier : Appuyez sur le bouton Transférer à partir d’un fichier dans les palettes d’étapes et placez la ligne Transférer à partir d’un fichier sous la ligne de configuration de l’instrument. Assurez-vous que la sélection et le remplacement de l’embout sont comme indiqué dans la figure supplémentaire 3.
4. Vérifiez que le fichier a une ligne d’en-tête et assurez-vous que les informations de la colonne sont correctes.
5. Appuyez sur la zone Source pour l’activer et cliquez sur la plaque source dans la disposition de la carte, définissez la plaque cible et saisissez la quantité d’ADN à pipeter.
6. Appuyez sur le bouton Personnaliser pour définir en détail la technique de pipetage, comme les touches de pointe sur la paroi.
7. Spécifiez la quantité d’ADN plasmidique à transférer. Ce protocole utilise 20 μL d’ADN plasmidique de 1 μg/μL par transfection (puits).
   REMARQUE : la quantité d’ADN plasmidique qui est transférée à la plaque de transfection avant la transfection du protoplast dépendra de la plateforme de protoplast utilisée.
8. Créez un transfert à partir d’un fichier .csv document.
   1. Ce document est composé de deux colonnes. Préparez la première colonne, c’est-à-dire la colonne De, qui indique l’emplacement de l’ADN plasmidique de base dans le support de tubes, c’est-à-dire pour l’échantillon 1 ; ce serait bien A01. Comme ce transfert se produit trois fois (trois répétitions), trois rangées doivent indiquer A01 dans la colonne De.
   2. Préparez la deuxième colonne, c’est-à-dire la colonne À, utilisée pour spécifier le puits de destination de la construction plasmidique de la plaque à 96 puits. Par exemple, l’échantillon 1 (A01) pourrait être B02, D04 et H07. Enregistrez-le en tant que fichier .csv pour qu’il soit compatible avec le logiciel de traitement des liquides.
9. Avant d’exécuter le protocole, vérifiez que les positions des ponts sont chargées, que le matériel de laboratoire est correctement défini, que le document de randomisation comprend les emplacements des puits pour tout l’ADN de l’échantillon dans le rack de tubes et qu’il y a suffisamment d’échantillon plasmidique dans les tubes pour exécuter le protocole.
10. Développez le menu Propriétés du fichier de l’étape Transférer à partir d’un fichier, sélectionnez le fichier .csv créé et exécutez le protocole.
11. Couvrir les plaques de transfection d’un sceau en feuille d’aluminium lorsque le protocole a été complété avec succès. Stockez les plaques de transfection à -20 °C jusqu’au moment de l’utiliser. Le protoplaste isolé et étiolé des feuilles de maïs sera ajouté à cette plaque de transfection à l’étape 3.3.

2. Isolement des protoplastes de feuilles de maïs étiolées

1. Pour commencer l’isolement du protoplaste de feuille de maïs étiolée, obtenez un fond génétique compatible avec le protoplaste tel que NP222 qui a été utilisé ici¹⁸. Avant le début de l’expérience, on ne doit préparer que 3 tampons MMg, W5 et WI, à savoir les tampons MMg, W5 et WI, et les conserver à 4 °C. Préparez la solution de digestion et le PEG le jour de l’expérience pour de meilleurs résultats.
2. Stérilisez en surface 25 graines en les immergeant d’abord dans une solution d’eau de Javel commerciale à 25 % et en les secouant sur une plate-forme rotative pendant environ 15 à 20 minutes à température ambiante.
3. Après l’agitation, rincez abondamment les graines à l’aide d’eau stérile (DI). Répétez l’étape de rinçage 5 fois. Buvez les graines dans de l’eau stérile pendant la nuit à température ambiante.
4. Semez la graine sur un sol humide et autoclavé le lendemain. Ajoutez des granulés d’argile sèche pour évacuer l’excès d’humidité du sol afin d’éviter la contamination fongique.
5. Cultivez les plants de maïs dans une chambre de croissance légère de 16 h à 28 °C (humidité relative (HR) de 30 %) pendant environ 3 jours jusqu’à ce que le coléoptile soit à 1 à 2 cm au-dessus du sol, puis transférez-les dans une chambre sombre avec la même température et la même HR pendant 5 à 7 jours supplémentaires.
6. Récoltez le premier vrai tissu foliaire en le coupant juste au-dessus du premier collet.
7. Stériliser brièvement les tissus foliaires avec de l’eau de Javel commerciale à 25 % et 250 μL de solution Tween 20 % pendant 1 min. Rincez abondamment le matériau foliaire 5 fois avec de l’eau DI.
8. Séchez (doucement) le tissu foliaire du maïs avec des tissus non pelucheux et, à l’aide d’une lame tranchante, retirez ~1,5 cm de l’extrémité et de la base de chaque limbe.
9. Coupez le tissu foliaire restant en bandes transversales étroites (0,5 mm - 1 mm) et placez-les dans une boîte de Pétri de 100 x 25 mm.
10. Stérilisez par filtre 25 ml de la solution de digestion à travers un filtre à seringue de 0,22 μm directement dans la boîte de Pétri contenant le tissu tranché.
11. Le vide s’infiltre dans le tissu foliaire avec la solution de digestion en appliquant le vide pendant 30 minutes à température ambiante dans un dessiccateur sous vide à une pression d’environ -75 mbar.
    REMARQUE : La pression du vide domestique pour de nombreux laboratoires universitaires et privés devrait être suffisante pour cette étape.
12. Placer sur un agitateur à plate-forme rotative et agiter à 25 °C dans l’obscurité à 60 tr/min pendant 2,5 à 3 h. Lorsqu’il reste 10 minutes jusqu’à la fin de la période de digestion, augmentez la vitesse à 90 tr/min.
13. Versez la solution de digestion et toute matière végétale non digérée à travers un entonnoir au-dessus d’un filtre à tamis de 40 μm dans un tube de 50 ml.
14. Centrifuger la solution à l’intérieur du tube de 50 mL à 150 x g pendant 4 min pour granuler le protoplaste. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 10 à 15 mL de solution tampon MMg.
15. Répétez la centrifugation et retirez le surnageant. Remettre en suspension dans 5 à 10 mL de tampon MMg frais.
16. À l’aide d’un hémocytomètre, mesurez soigneusement la densité du protoplaste isolé. Remettre en suspension à une densité approximative de 5 x 10⁵ protoplastes par mL.
17. Laisser reposer l’isolat sur de la glace pendant ~30 minutes avant la transfection. Pendant ce temps, préparez la solution PEG. Dissoudre complètement le PEG dans une solution à l’aide d’un bain-marie à 37 °C et le laisser là jusqu’à la transfection.

3. Transfection automatisée de protoplastes

REMARQUE : Les étapes 3.6 à 3.15 sont entièrement gérées par le manipulateur de liquides automatisé, à l’exception des deux pauses de l’utilisateur aux étapes 3.10 et 3.13, qui nécessitent une centrifugation manuelle. Des captures d’écran pertinentes qui suivent ce protocole automatisé se trouvent dans le supplément, la figure supplémentaire 1, la figure supplémentaire 3, la figure supplémentaire 4 et la figure supplémentaire 5.

1. Préparez l’aménagement du plateau de l’appareil de traitement des liquides pour la transfection conformément à la méthode de transfection des protoplastes décrite dans les étapes suivantes. Assemblez les matériaux suivants : Plaque de destination (dans ce cas, il s’agirait d’une plaque noire de 96 puits avec une microplaque inférieure transparente pour la mesure de la fluorescence), une boîte d’embouts d’automatisation à large alésage de 25 à 250 μL pour l’étape d’aspiration PEG, cinq boîtes d’embouts d’automatisation de pipette de 25 à 250 μL pour les étapes de manipulation de liquide restantes, trois auges en plastique comme réservoirs de réactifs, une plaque vide de 96 puits pour la collecte des déchets, les solutions de lavage tampon de transfection restantes, W5 et WI.
2. Immédiatement avant le début de la procédure de transfection, stérilisez la solution de PEG à travers une unité de filtre sous vide stérile jetable de 0,22 μm dans un tube frais de 50 ml.
3. À partir du protoplaste remis en suspension dans le tampon MMg, ajoutez 100 μL (environ 50 000 protoplastes) dans chaque puits de la plaque de transfection prépréparée et décongelée. Pour ce faire, versez la solution tampon contenant du protoplaste dans une auge stérile de 10 ml et utilisez une pipette multicanaux. Continuez à agiter doucement l’auge pour éviter que le protoplaste ne se dépose de la solution pendant cette étape de transfert manuel.
4. Versez la solution de PEG dans l’auge appropriée et déposez la plaque de transfection, contenant maintenant du protoplaste et de l’ADN plasmidique contenant de la plaque de transfection, préparée à l’aide de l’étape 1, à l’endroit spécifié selon la disposition du pont.
5. Pour créer une méthode de transfection protoplaste, ouvrez le logiciel de traitement des liquides et effectuez les étapes décrites ci-dessous.
   1. Déplacement du matériel de laboratoire entre les plateaux : remplacez la boîte d’embouts vide sur le plateau de chargement des embouts par une nouvelle à l’aide de la commande Déplacer le matériel de laboratoire. Sélectionnez les platines De et À dans la vue Configuration .
   2. Pour des volumes supérieurs à 200 μL : Ne pas remplacer les pointes entre les transferts. Chargez les pointes pour la première étape de transfert et déchargez après la dernière étape de transfert, ce qui nécessite que les options de chargement/déchargement soient correctement spécifiées pour chaque étape de transfert, comme dans la figure supplémentaire 3.
6. Création de l’agencement de la plate-forme : à l’instar de la méthode de création de plaques de transfection, pour créer une méthode de transfection automatisée de l’ADN, ouvrez le logiciel de traitement des liquides. Cliquez sur le bouton Nouvelle méthode dans la barre de menu pour créer une nouvelle méthode. Ajoutez une ligne de configuration de l’instrument entre les lignes de début et de fin en appuyant sur le bouton de configuration de l’instrument sur le panneau de gauche. Créez un plan de pont conformément à la disposition de pont illustrée à la figure supplémentaire 1.
7. Mélange cellule/ADN : ajoutez une étape pour mélanger le protoplaste et l’ADN avant l’ajout de PEG à l’aide du bouton d’action de l’appareil et de la configuration de l’appareil (positionneur automatisé de matériel de laboratoire ou ALP), de la vitesse d’agitation (1500 tr/min) et du temps d’agitation (10 s).
8. Ajout et mélange de PEG : Pour initier la transfection, ajoutez une étape de transfert pour ajouter 110 μL de PEG à partir du réservoir de PEG à l’aide d’une pipette à 96 pods. Assurez-vous que les positions correctes de la source et de la destination sont programmées en fonction de la disposition de la platine spécifiée. Programmez l’étape de transfert pour aspirer le PEG à 1 mm du fond du réservoir et déposer le PEG à 3 mm de la base de la plaque de 96 puits contenant le mélange protoplaste/ADN. Ajoutez une autre étape d’agitation après l’ajout de PEG en copiant et collant les étapes précédemment programmées.
9. Incubation PEG : Ajoutez une étape de pause en sélectionnant le bouton Pause , sélectionnez l’agitateur et entrez le temps d’incubation prédéterminé, qui commence à partir de l’ajout de PEG.
   REMARQUE : La minuterie de la pause se poursuivra à moins qu’il n’y ait des interruptions ou des perturbations de la barrière immatérielle qui entraîneraient un message d’erreur. Assurez-vous que si une manipulation du jeu est nécessaire, ces messages sont effacés avant de s’éloigner.
10. Ajout/mélange de tampon W5 : Ajouter trois lignes de transfert de 200 μL pour transférer un total de 600 μL de tampon W5 sur la plaque de transfection pour éteindre la réaction d’incubation PEG. Suivre l’ajout du tampon W5 en secouant et en faisant une pause utilisateur pour permettre la centrifugation de la plaque de transfection.
11. Pause utilisateur 1 : Centrifuger la plaque de transfection de protoplaste à 100 x g pendant 4 min. Remettez la plaque de transfection, maintenant avec du protoplaste granulé, dans la position de pont appropriée. Ajoutez une pause utilisateur en cliquant sur le bouton Pause , sauf maintenant avec l’option Mettre en pause l’ensemble du système et afficher le message sélectionnée.
    REMARQUE : La fenêtre contextuelle du message de pause doit être effacée avant que le manipulateur de liquides puisse continuer avec le reste du protocole.
12. Élimination du surnageant : Ajouter deux lignes de Transfer pour éliminer 400 μL de surnageant et transférer sur la plaque de déchets. Pour éviter l’aspiration cellulaire lors de l’élimination du surnageant, réglez la distance par rapport au bas à 6 mm.
13. Ajout/mélange WI Ajouter 3 lignes de Transfer pour transférer 580 μL de tampon WI sur la plaque de transfection. Ajoutez une autre étape d’agitation après l’ajout de WI en copiant et collant les étapes précédemment programmées. Passez à la prochaine pause utilisateur.
14. Pause utilisateur 2 : Centrifuger la plaque de transfection de protoplast à 100 x g pendant 4 min. Remettez la plaque de transfection, maintenant avec du protoplaste granulé, dans la position de pont appropriée.
15. Élimination du surnageant : Ajouter quatre lignes de transfert pour éliminer 680 μL de surnageant et transférer sur la plaque de déchets. Pour éviter l’aspiration cellulaire lors de l’élimination du surnageant, réglez la distance par rapport au bas à 6 mm.
16. Transfert de protoplastes sur microplaque : Le transfert final de ce protocole est composé de deux étapes de transfert de 150 μL. Avant chaque étape individuelle, aspirez à plusieurs reprises les protoplastes à 50 μL/s à 2 mm du bas de la plaque de transfection et distribuez à 3 mm. Ensuite, à l’aide des mêmes pointes de pipette, transférez dans la microplaque de destination.
    REMARQUE : L’aspiration et la distribution du volume tampon au-dessus de la pastille avant le transfert sur la microplaque perturberont tous les protoplastes restants dans la partie inférieure de la plaque de transfection pour s’assurer qu’il n’y a pas de perte d’échantillon. Étant donné que la randomisation a été effectuée lors de la création de la plaque de transfection, le protocole automatisé est terminé.
17. Incuber la microplaque à température ambiante dans l’obscurité pendant 24 à 48 h avant la première mesure de fluorescence.

Results

Pour obtenir des données d’observation soutenant que les effets de bord peuvent affecter les mesures de réponse ; Une étude pilote a été menée pour confirmer ces soupçons. Pour cette étude, les méthodes ci-dessus ont été appliquées à trois plaques répétées de 96 puits avec un seul niveau de traitement ; tous les protoplastes ont été transfectés à l’aide de pSYN11250¹⁹, un plasmide qui exprime constitutivement ZsGreen, dans le but de montrer qu’il existe des différences systématiques de niveau de réponse pour les unités sur le bord de la plaque par rapport à la deuxième rangée, et les régions centrales de la plaque. Les 36 puits sur le bord extérieur de la plaque sont définis comme le bloc 1, les 28 puits de la deuxième rangée à partir du bord comme le bloc 2, et les 32 puits centraux comme le bloc 3 - voir la figure 2A panneau en bas à droite. Cette disposition peut accueillir 28 niveaux de traitement en tant que plan de bloc complet randomisé (RCBD) ou 32 niveaux de traitement en tant que plan de bloc incomplet randomisé (RIBD). Dans la figure 2A, pour chaque répétition (rep), les points de données brutes de chaque puits ont été normalisés par la moyenne de cette plaque respective. Dans les trois réplications de l’expérience, les réponses sur le bord de la plaque sont, en moyenne, 1 à 1,5 fois plus grandes que le minimum. La figure 2B illustre les moyennes des blocs en pourcentage de la moyenne globale de la plaque pour chaque répétition. Le tableau 2 présente des tables d’ANOVA à sens unique obtenues à partir de l’ajustement d’un modèle linéaire avec un bloc comme effet fixe. Pour des raisons liées à la randomisation restreinte impliquée dans les plans de sondage, l’inférence fondée sur des tests d’hypothèse pour le facteur de blocage est considérée comme approximative au mieux et invalide au pire. Cependant, l’ajustement d’un modèle avec un facteur de blocage fixe est utile pour évaluer si un schéma de blocage est bénéfique. Mn_Sq (bloc) représente l’écart quadratique moyen des moyennes du bloc par rapport à la moyenne globale. Mn_Sq (Erreur) représente l’écart quadratique moyen des observations individuelles par rapport à leurs moyennes de groupe respectives, dans ce cas, la moyenne globale puisqu’il n’y a pas de facteur de traitement dans le modèle. Lorsque Mn Sq (bloc) est plus grand que Mn Sq (erreur), c’est-à-dire que le rapport F est supérieur à un, la taille de l’erreur quadratique moyenne a été effectivement réduite par rapport à un plan complètement randomisé (CRD), augmentant ainsi la puissance statistique pour comparer les traitements d’intérêt et diminuant la largeur des intervalles de confiance estimant les contrastes de traitement. La figure 2B montre des rapports F qui dépassent de loin un, et la réponse mesurée a tendance à diminuer à mesure qu’elle se déplace vers le centre sur les trois plaques répétées. Dans les trois répétitions, des intervalles de confiance à 95 % sont observés au niveau 0,05 pour au moins un bloc qui ne couvre pas la moyenne sur plaque observée. On peut donc conclure que le système de blocage augmente considérablement la précision de ces estimations. Au-delà de la précision moindre, le fait de ne pas tenir compte de la variabilité des nuisances spatiales peut conduire à des résultats parasites en raison de la possibilité de confondre les effets du traitement avec l’effet de bord.

Bien qu’il existe une longue histoire de protocoles d’isolement et de transfection de protoplastes de maïs étiolés remontant au début des années 1990, ce protocole introduit quelques modifications supplémentaires à la procédure traditionnelle pour faciliter une meilleure identification reproductible et en vrac des protoplastes aux fins de la transfection de protoplastes à haut débit²⁰. Les étapes de stérilisation de la surface des graines et des tissus foliaires avant la digestion réduisent la contamination fongique sans nécessiter de milieu aseptique. L’utilisation de la terre aidera également à réduire les coûts par rapport à l’utilisation de milieux de culture spécialisés ou à l’achat de contenants jetables stériles à usage unique. Le protocole peut être mis à l’échelle à de nombreuses étapes pour s’adapter à différents niveaux de débit. Environ 2 g de tissu foliaire donnent entre 5 x 10⁶ et 10 x 10⁶ protoplastes. Étant donné que 5 x 10⁶ protoplastes sont nécessaires par transfection de plaque à 96 puits, le protocole d’isolation, tel qu’il est écrit, peut accueillir 2 exécutions du protocole de transfection. Ce protocole utilise également MMg comme solution de lavage au lieu de la solution canonique W5. Ceci a été dérivé à l’origine des publications sur le protoplast racine d’Arabidopsis comme moyen de réduire le nombre de solutions tampons utilisées pour une étape donnée de la procédure de transfection du protoplaste²¹. Cependant, il a également été utilisé pour le protoplaste des feuilles de maïs étiolées en 2022-22. Une amélioration supplémentaire de l’isolation et de la transfection de tout protocole de protoplaste serait la simplification et la réduction des solutions tampons. Dans l’état actuel des choses, ce protocole bascule entre le tampon de digestion canonique, le tampon W5, le tampon MMg et le tampon WI. La simplification des solutions serait très bénéfique pour améliorer la reproductibilité des expériences de protoplastes et réduire la variabilité d’une personne à l’autre ou d’un lot à l’autre entre les expériences. Il est à noter que la dernière nouveauté du protocole est l’absence de suppression complète des solutions tampons après transfection PEG. La raison pour laquelle l’automatisation est possible est que le protoplaste, le maïs étiolé montré ici et d’autres que nous avons testés, c’est qu’ils semblent tolérer la dilution comme moyen d’éteindre la réaction plutôt que l’élimination complète des différentes solutions tampons¹¹. La production de rapporteur, comme l’indique notre contrôle de transfection GFP utilisé ici, indique que le protoplaste peut tolérer jusqu’à 5 % de PEG sans impact négatif sur l’intensité de la fluorescence (Figure supplémentaire 6). Cette valeur est plus du double de ce que serait la concentration anticipée de PEG à l’achèvement du protocole décrit ici.

Figure 1 : Schéma illustratif de la procédure d’isolement et de transfection des protoplastes. Les étapes où l’automatisation a été introduite sont indiquées par des lignes rouges pointillées et les cases bleues qui les accompagnent. Les nombres entourés d’un cercle rouge correspondent aux trois méthodes décrites. Créé avec BioRender.com. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Effet de bord et impact de l’atténuation des dispositions répétées. (A) Cartes topographiques montrant le changement de pli de l’intensité de fluorescence pour des plaques à 96 puits transfectées avec pSYN11250 par rapport à la moyenne de la plaque pour 3 expériences répétées indépendantes (Rep). La moyenne de ces expériences est également indiquée avec le schéma de blocage, indiqué par les différentes lignes pointillées de couleur posées sur le dessus. (B) Graphiques à bandes montrant les moyennes des blocs en pourcentage de la moyenne globale des plaques pour les plaques répétées 1, 2 et 3, de gauche à droite. Les cercles semi-transparents représentent les points de données bruts après division par la moyenne de la plaque. Les barres d’erreur sont des intervalles de confiance à 95 % au niveau 0,05, le tiret central indiquant la moyenne. Les couleurs brune, dorée et grise indiquent respectivement le bord, la deuxième rangée et la partie intérieure de l’assiette. La ligne rouge pointillée à 100 % représente la moyenne globale de la plaque. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Tampon	Réactif
Digestion	1,5 % Cellulose Rs
	0,3 % de macroenzyme
	0,6 M de mannitol
	10 mM MES (ph 5,7)
	1 mM CaCl2
	0,1 % (p/v) BSA
	0,5 nM β-Mercaptoéthanol ou 0,5 mM DTT
Mmg	0,6 M de mannitol
	15 mM MgCl2
	4 mM MES, pH 5,7
W5	154 mM de NaCl
	125 mM CaCl2
	5 mM de KCl
	2 mM MES, pH 5,7
WI	0,6 M de mannitol
	4 mM MES, pH 5,7
	4 mM de KCl
CHEVILLE	30 % PEG (p/v)
	0,6 M de mannitol
	100 mM CaCl2

Tableau 1 : Solutions tampons pour l’isolement et la transfection du protoplaste de maïs étiolé.

Reps	Source	Df	Somme Sq	Mn Sq	Valeur F	Pr (>F)
Réplique 1	Bloquer	2	0.26	0.13	10.64	<0,001
	Résiduel	93	1.135	0.012
Réplique 2	Bloquer	2	0.507	0.25	21.41	<0,001
	Résiduel	93	1.102	0.012
Réplique 3	Bloquer	2	0.179	0.09	4.48	0.014
	Résiduel	93	1.861	0.02

Tableau 2 : Tableau de l’ANOVA à un facteur pour les trois répétitions de l’expérience de transfection pSYN11250 à 96 puits. Pour chaque plaque répliquée : la colonne Source désigne la source de variation, Df désigne les degrés de liberté, Sum Sq désigne la somme des carrés, Mn Sq désigne les carrés moyens (Sum Sq/Df), la valeur F désigne le rapport entre Mn_Sq (bloc) et Mn_Sq (erreur) et Pr(>F) désigne la valeur p du test F global.

Figure supplémentaire 1 : Captures d’écran du tableau de bord du logiciel. Catégories de sélection relatives à la création d’une nouvelle méthode ainsi que les dispositions de jeu pour les protocoles de randomisation et de transfection. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Étapes clés de la configuration du protocole de création de plaque de transfection. Captures d’écran prises lors de la création du protocole de création de plaque de transfection. Le numéro et le titre de chaque panneau correspondent aux étapes du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 3 : Captures d’écran pour la manipulation du matériel de laboratoire et le chargement des pointes pour la création du protocole de transfection. Il s’agit d’étapes qui se produisent de nombreuses fois tout au long du protocole, de sorte que, pour éviter toute mention répétée, des étapes représentatives sont présentées ici. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 4 : Mélange cellule-ADN via la pause utilisateur 1. Captures d’écran prises lors de la création du protocole de transfection. Le numéro et le titre de chaque panneau correspondent aux étapes du corps du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 5 : Élimination du surnageant après la pause utilisateur 1 par transfert des échantillons sur une microplaque. Captures d’écran prises lors de la création du protocole de transfection. Le numéro et le titre de chaque panneau correspondent aux étapes du corps du protocole. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 6 : protoplaste de feuille de maïs étiolée transfectée ZsGreen traitée avec différentes concentrations de PEG dans le cours temporel tampon WI. Diagramme à barres montrant l’intensité relative de fluorescence du protoplaste après un traitement PEG à 24, 48 et 72 h avec mesure par un lecteur de microplaques. Barre d’erreur = SD, n = 4. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Ce manuscrit décrit un protocole permettant d’automatiser la création de plaques de transfection et l’isolement des protoplastes de feuilles de maïs étiolées avec une transfection automatisée. Pour mener à bien la partie du protocole consacrée à la création de plaques de transfection, il faut un robot automatisé de manipulation de liquides équipé d’une nacelle à 8 canaux. Pour le protocole de transfection, une nacelle de 96 puits est recommandée pour une transfection complète et uniforme de plaque de 96 puits. La méthode de transfection peut être réalisée à l’aide d’un pod à 8 canaux, mais une attention particulière doit être accordée au temps nécessaire aux étapes d’aspiration et de distribution, ainsi qu’au temps qui peut être attribué au changement des pointes entre les colonnes. Les différences dans la durée d’incubation du PEG sont bien documentées pour avoir un impact significatif sur l’efficacité et l’expression de la transfection, et par conséquent, une attention particulière à ces facteurs contributifs doit être prise en compte pour éviter les disparités dans la manipulation des échantillons¹³. Avant de commencer le protocole de traitement des liquides, il est important de considérer les étapes du protocole et de déterminer si certaines activités peuvent être réalisées simultanément. Ce protocole utilise un dispositif qui charge les pointes sur la nacelle de 96 puits à partir d’une position sur le pont. Le manipulateur de liquides pour ce protocole comprend une fonction où le robot échange des boîtes de pointes pendant les périodes d’incubation ou pendant les étapes de pause de l’utilisateur pour éviter d’ajouter du temps supplémentaire au protocole. Lorsque vous prenez la décision d’acheter un manipulateur de liquides, pensez à la fonctionnalité et aux commodités potentielles qui vous font gagner du temps.

Bien que ce protocole ait été développé pour utiliser les appareils Beckman Coulter NXp et Biomek FX, ce protocole peut être adapté à tout appareil de manipulation de liquides comparable. Tous les manipulateurs de liquides disposent d’un moyen d’indiquer comment transférer des volumes d’un endroit à un autre et en quelle quantité. Pour ce protocole, ces périphériques utilisaient une commande de ligne Transférer à partir d’un fichier. Si le matériel de laboratoire est correctement défini, un utilisateur peut effectuer un transfert depuis ou vers n’importe quel récipient. Dans des circonstances exceptionnelles, par exemple si les racks de tubes ou les adaptateurs ne sont pas disponibles dans le commerce, l’impression 3D de tels connecteurs peut être utilisée. Pour les protocoles de transfection de protoplastes typiques, 20 μg d’ADN à une concentration de transfection de 1 μg/μL constituent un volume standard de matériau pour de nombreuses plateformes de protoplastes¹³_. Lors de la création de la plaque de transfection, par mesure de précaution supplémentaire, utilisez des pointes filtrantes de 0,2 à 20 μL pour minimiser tout risque de contamination dû au plasmide aérosolisé pendant le transfert. La suppression de la composante humaine de la préparation réduit les variations dans le temps et améliore la reproductibilité de ces expériences à haut débit. De plus, les assiettes peuvent être préparées bien à l’avance. Cette préparation atténuera le stress du scientifique de la transfection le jour de l’expérience. Cependant, il est important d’éviter de stocker ces plaques d’ADN plasmidique à 4 °C pendant de longues périodes, car les échantillons peuvent s’évaporer. Les échantillons doivent être conservés dans un congélateur à -20 °C et peuvent ensuite être décongelés dans le réfrigérateur à 4 °C avant la transfection. Une fois que ce protocole de création de plaque de transfection est programmé, il devrait être facilement reproductible en fournissant un nouveau transfert à partir d’un fichier .csv et en occupant les mêmes emplacements de pont pour les échantillons, le matériel de laboratoire et les réactifs.

Pour la procédure de transfection automatisée (étape 3), un surplus de solution de PEG est préparé pour assurer une aspiration égale du liquide visqueux de l’auge, généralement un excès de 40 mL pour tenir compte du volume mort. L’utilisation de la quantité exacte requise pour la transfection peut entraîner l’aspiration d’air dans les pipettes et l’aspiration de volumes inégaux de PEG à travers la tête à 96 canaux. Bien que cette solution puisse également être préparée à l’avance, il est recommandé de l’être le jour de la transfection. La stérilisation de la solution PEG peut être effectuée à l’aide d’un filtre à seringue, mais en raison de la viscosité, elle peut être difficile. L’utilisation d’une unité de filtre à vide est plus rapide et peut atténuer toute frustration ou douleur associée à cette activité. Comme pour la solution PEG, un excès des autres solutions tampons de transfection (W5, WI) est également prévu pour assurer un pipetage uniforme sur la tête à 96 canaux. Les solutions tampons (W5 et WI) peuvent être préparées à l’avance en vrac pour être utilisées lors de futures séries de manipulation de liquides. Bien que les réactifs ne soient pas coûteux, il y a une bonne quantité de sacrifice de solution tampon. Avec l’augmentation du nombre de passages par jour, il peut être préférable d’utiliser des alternatives au réservoir qui réduiraient l’excès jeté à la fin du passage. Au cours de l’exécution du protocole de traitement des liquides, W5 et WI peuvent être ajoutés à leurs auges respectives avant le démarrage du protocole, pendant l’incubation de 15 minutes ou pendant les étapes de pause de l’utilisateur dans le protocole. Soyez prudent lorsque vous ajoutez des tampons pendant la période d’incubation en raison des caractéristiques de sécurité comme une barrière lumineuse. Assurez-vous d’effacer tous les messages d’avertissement du logiciel pour éviter toute interruption involontaire du protocole.

Ce protocole représente une amélioration fiable, reproductible et largement applicable par rapport aux protocoles automatisés précédemment documentés pour la manipulation du protoplast^12,13. Cette méthode est adaptable au répertoire apparemment infini des protocoles protoplastes, car beaucoup dépendent de la même série d’étapes de manipulation de tampon. L’atténuation de l’effet de bord par le RICBD lors de la création automatisée de la plaque de transfection réduit simultanément la quantité d’effort et la variabilité tout en appliquant une correction statistiquement significative de l’effet de bord. Une transfection de protoplast sur 96 puits élimine la possibilité de toute variation associée au moment de l’incubation du PEG, en conduisant la réaction dans les 96 puits simultanément. Bien que le protocole ait été conçu pour réaliser l’automatisation complète des étapes de transfection, les pauses de l’utilisateur nécessiteront une intervention physique de la part du scientifique de la transfection. Ces dernières années, de nombreuses avancées ont été réalisées dans le domaine des centrifugeuses tolérantes aux déséquilibres et compatibles avec l’automatisation. Avec cet équipement, il serait possible d’automatiser l’ensemble de la méthode sans l’implication de l’utilisateur. Alternativement, d’autres protocoles ont évité la centrifugation en permettant au protoplaste de se déposer au fond du puits après la transfection^12,13. Cependant, cela ajoutera du temps supplémentaire à la procédure de transfection et un excès de temps d’incubation dans le tampon W5 avant l’incubation d’une nuit dans le WI.

À de nombreux endroits de la méthode de transfection, elle décrit la manipulation de volumes supérieurs à 200 μL où la manipulation de liquides doit être effectuée à l’aide de transferts multiples. Selon l’âge et le modèle du manipulateur de liquides, cette étape peut et doit être effectuée en un seul volume. Pour les manipulateurs de liquides plus anciens, tels que le modèle décrit ici, le maximum qui peut être aspiré à l’aide d’une tête à 96 puits est de 200 μL. Une amélioration évidente de l’efficacité et de la précision de la méthode serait de réduire le nombre de transferts afin de minimiser tout risque potentiel de déversement, d’égouttement ou de contamination. D’autres considérations pour l’amélioration des protocoles de manipulation des liquides sont décrites dans les examens de ces technologies et de leur utilisation dans le domaine de la biotechnologie²³.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
(2)&bêta ;-mercaptoéthanol  ;	Sigma	M6250
Acide 2-(N-Morpholino)éthanesulfonique (MES) monohydraté	Sigma	69892
Tubes à centrifuger 50mL avec capuchon plat	stérile Fisher	22-010-064
96 Well Optical Btm Plt PolymerBase Noir avec couvercle Culture cellulaire Stérile PS .4mL Well	Fisher	12-566-70
Axygen Biomek FX/NX Robotic Tips, non stérile, Wide Bore	Fisher	14-222-096
Axygen Robotic Tips Filtre 30uL, stérile, en rack	Fisher	14-222-103
Bel-Art SP Scienceware Lab Companion Dessiccateurs sous vide de style rond	Fisher	08-648-10
Bemis 2 PO. x 250 pieds Rouleau de laboratoire Parafilm  ;	Fisher	13-374-16
Biomek FXP	Beckman Coulter	902508
Chlorure de calcium dihydraté	Sigma	C5080
Chemglass Life Sciences Hémocytomètre jetable  ;	Fisher	50-131-1352
Clorox Agent de Javel germicide, concentré	Fisher	NC1871274
Corning Ruban d’étanchéité en aluminium pour microplaques  ;	Fisher	07-200-684
Blocs d’analyse Corning à 96 puits, 2 ml, étalon à 96 puits	Fisher	07-200-701
DL-Dithiothreitol (DTT)	Sigma	10197777001
D-Mannitol  ;	Sigma	M9546
Fisherbrand Seringue en plastique 60 ml	Fisher	14-955-461
Fisherbrand Passoire à cellules stériles 40um	Fisher	22-363-547
Fisherbrand Boîtes de Pétri avec couvercle transparent, empilables, 100 mm x 25 mm, Caisse de 325	Fisher	FB0875711
Chlorure de magnésium hexahydraté	Sigma	M2670
Millex Unité de filtration à seringue Stérile 33mm PES .22um	Fisher	SLGPR33RS
Millex Unité de filtration à seringue Stérile 33mm PVDF.45um	Fisher	SLHAR33SS
MillliporeSigma Steriflip Unités de filtration stériles à usage unique 50mL PES	Fisher	SCGP00525
Poly(éthylène glycol) 4000  ;	Sigma	81240
Redi-Earth Plug & Mélange de semis  ;	Wyatt Quarles	GP92747
Regular Duty Single Edge Razor Lames dos acier .009RD	Fisher	12-640
Research Products International Corp Cellulase RS	Fisher	50-213-232
Research Products International Corp Macerozyme R-10	Fisher	50-213-444
Chlorure de sodium	Sigma	S7653
Insert de plateau - 36 cellules - 6x6 imbriqué  ;	Hummert	11635000
Tween-20  ;	Sigma	P1379
VACUUBRAND ME1 Pompe à vide, 100-120V, 50/60 Hz, prise US	VWR	97058-164