Isolement en une seule étape de vésicules extracellulaires à partir d’échantillons de grand volume avec un dispositif microfluidique A4F bifurqué

Résumé

Les vésicules extracellulaires sont extrêmement prometteuses pour les applications biomédicales, mais les méthodes d’isolement actuelles prennent du temps et ne sont pas pratiques pour une utilisation clinique. Dans cette étude, nous présentons un dispositif microfluidique qui permet d’isoler directement des vésicules extracellulaires à partir de grands volumes de biofluides de manière continue avec un minimum d’étapes.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) présentent un immense potentiel pour diverses applications biomédicales, notamment le diagnostic, l’administration de médicaments et la médecine régénérative. Néanmoins, les méthodologies actuelles d’isolement des VE présentent des défis importants, tels que la complexité, la consommation de temps et le besoin d’équipements encombrants, ce qui entrave leur application clinique. Pour remédier à ces limitations, nous avons cherché à développer un système microfluidique innovant basé sur le copolymère d’oléfines cycliques hors stœchiométrie thiol-ène (COC-OSTE) pour l’isolement efficace des VE à partir d’échantillons de grand volume de manière continue. En utilisant la séparation basée sur la taille et la flottabilité, la technologie utilisée dans cette étude a permis d’obtenir une distribution granulométrique nettement plus étroite par rapport aux approches existantes à partir d’échantillons d’urine et de milieux cellulaires, permettant de cibler des fractions de taille spécifiques des VE dans les applications futures. Notre conception innovante de dispositif microfluidique COC-OSTE, utilisant une technologie de fractionnement de champ à flux asymétrique bifurquée, offre une approche simple et continue d’isolation EV pour les échantillons de grand volume. De plus, le potentiel de fabrication de masse de ce dispositif microfluidique offre évolutivité et cohérence, ce qui permet d’intégrer l’isolation des VE dans les diagnostics cliniques de routine et les processus industriels, où une cohérence et un débit élevés sont des exigences essentielles.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont des particules membranaires dérivées de cellules comprenant deux types principaux : les exosomes (30-200 nm) et les microvésicules (200-1000 nm)¹. Les exosomes se forment par bourgeonnement vers l’intérieur de la membrane endosomale dans un corps multivésiculaire (MVB), libérant des vésicules intraluminales (ILV) dans l’espace extracellulaire lors de la fusion avec la membrane plasmique¹. En revanche, les microvésicules sont générées par le bourgeonnement vers l’extérieur et la fission de la membrane cellulaire². Les VE jouent un rôle crucial dans la communication intercellulaire en transportant des protéines, des acides nucléiques, des lipides et des métabolites, reflétant l’état physiologique de la cellule, y compris la croissance, l’angiogenèse, les métastases, la prolifération et la résistance aux^{thérapies 3}. En conséquence, ils sont apparus comme des biomarqueurs prometteurs et des cibles thérapeutiques pour des maladies, y compris le cancer, soulignant leur potentiel dans les systèmes de diagnostic et d’administration de médicaments⁴.

Pour utiliser pleinement les VE dans le diagnostic et la thérapeutique des maladies, il est crucial d’isoler efficacement divers biofluides⁵. Les méthodes courantes comprennent l’ultracentrifugation (UC), la centrifugation par gradient de densité, la chromatographie d’exclusion stérique (SEC), la filtration et l’immuno-isolement⁶. La CU est une technique largement utilisée, mais elle peut produire des particules de densité similaire qui ne sont pas des VE et peuvent générer des agrégats de VE⁷. La SEC a gagné en popularité en raison de sa capacité à fournir des échantillons de plus grande pureté en excluant les particules en fonction de leur taille plutôt que de leur densité⁸. Cependant, une sélection minutieuse de la taille de pores appropriée pour la colonne SEC et l’optimisation des conditions de chromatographie sont essentielles pour minimiser le co-isolement des particules indésirables comme les chylomicrons et les lipoprotéines de basse densité⁸. Malgré leur efficacité, les deux méthodes sont longues et difficiles à automatiser, en particulier pour les échantillons de plus grand volume comme les milieux cellulaires ou l’urine, ce qui limite leur évolutivité pour les applications industrielles⁹.

Ces dernières années, le fractionnement asymétrique du champ d’écoulement (A4F) a évolué comme une technique de séparation puissante pour la séparation de particules de taille micro et nanométrique basée sur la taille et la flottabilité¹⁰. Le principe de fonctionnement d’A4F repose sur un canal microfluidique doté d’une membrane poreuse à sa base, générant une force exercée vers la membrane appelée tangentiel¹⁰. Lorsqu’il est combiné avec le mouvement brownien et l’écoulement de Poiseuille inhérents au système, le flux croisé facilite une séparation efficace des particules en raison de la variation de la position des particules dans la dynamique de l’écoulement¹¹. Malgré les avantages, cette méthode est limitée à des volumes d’échantillons de l’ordre de¹² microlitres et nécessite une étape de focalisation supplémentaire, prolongeant la durée du processus¹⁰.

Au cours de la dernière décennie, la microfluidique a pris de l’importance en tant qu’outil de séparation rapide, efficace et cliniquement fiable^{des VE 13}. Cependant, la plupart des méthodes microfluidiques conçues pour la séparation des VE sont optimisées pour les échantillons de VE de petit volume et à forte concentration ou dépendent de procédures de séparation complexes¹⁴. De plus, dans le domaine de la microfluidique, le polydiméthylsiloxane (PDMS) est reconnu comme le matériau de référence en raison de sa transparence optique, de sa biocompatibilité et de sa facilité d’utilisation¹⁵. Néanmoins, sa propension connue à absorber de petites molécules lipophiles, dont les VE, peut être problématique pour son application dans le domaine des^VE13.

Le copolymère d’oléfine cyclique (COC) est un matériau fréquemment utilisé en microfluidique en raison de sa biocompatibilité, de sa faible absorption des molécules et de sa résistance chimique élevée¹⁵. Cependant, la fabrication de dispositifs COC implique souvent des processus complexes ou des équipements spécialisés¹⁶. Par ailleurs, le thiol-ène hors stœchiométrie (OSTE) est une alternative prometteuse au PDMS en raison de la diminution de l’absorption des petites molécules, de la stabilité chimique supérieure, de la facilité de fabrication et du processus de fabrication évolutif^17,18. Cependant, en raison des connexions complexes aux tubes, les appareils peuvent être sujets à des fuites¹⁹.

L’objectif de cette étude était de concevoir et de fabriquer un dispositif microfluidique combinant OSTE et COC et le principe A4F bifurqué pour la séparation des VE à partir d’échantillons de grand volume tels que l’urine ou les milieux cellulaires.

Protocole

Le prélèvement d’échantillons a été approuvé par le Comité d’éthique de la vie et de la recherche en sciences médicales de l’Université lettone (décision N0-71-35/54)

NOTE : Les matériaux utilisés dans cette étude sont inclus dans le fichier de la table des matériaux .

1. Fabrication de moules imprimés en trois dimensions (3D)

1. Concevez un moule double négatif en forme de serpentin dans un logiciel de CAO avec les dimensions suivantes pour le canal supérieur : hauteur de 0,5 mm, largeur de 1 mm et longueur de 210 mm. Pour le canal inférieur, utilisez le même design avec une largeur de 1,5 mm, une hauteur de 0,6 mm et une longueur de 210 mm. Les dimensions telles que la largeur, la longueur, la hauteur et l’illustration isométrique du moule sont illustrées à la figure 1. Enregistrez la conception au format .stl.
2. Préparez le fichier dans Z-Suite ; aucun support n’a besoin d’être ajouté. Imprimez les moules à l’aide d’une imprimante 3D à écran à cristaux liquides ultraviolets (UV LCD) avec une résine noire résistante.
3. Après l’impression, retirez soigneusement les moules de la surface de l’imprimante. Laver les moules à l’isopropanol (IPA) en sonication pendant 20 min.
4. Séchez les moules avec N₂.
5. Exposer les moules à l’exposition aux inondations à l’aide d’un filtre ND33 pendant 810 s, puis les placer dans un four à 60 °C pendant 48 h.

2. Préparation des moules PDMS

1. Poids PDMS à un rapport p/p de 10:1 (pour chaque moule, utiliser 16 g de base en élastomère et 1,6 g d’agent de réticulation). Mélanger les composants dans un mélangeur centrifuge planétaire en mélangeant pendant 1 min à 500 tr/min.
2. Coulez le PDMS mélangé dans les moules imprimés en 3D et dégazez dans un dessiccateur sous vide à -800 mbar pendant 30 min ou jusqu’à ce qu’aucune bulle ne soit observée.
3. Placez délicatement une doublure en polychlorure de vinyle de 100 μm d’épaisseur sur le PDMS liquide.
   REMARQUE : Appliquez lentement la doublure d’un côté à l’autre pour éviter la formation de bulles.
4. Insérez le moule avec PDMS dans un gabarit de moulage en place et serrez le gabarit à l’aide d’une clé dynamométrique réglée à 0,3 Nm.
5. Placez le gabarit dans un four à 60 °C pendant 3 h pour durcir le PDMS.
6. Démontez le gabarit à l’aide d’une clé hexagonale et retirez le moule imprimé en 3D du gabarit.
7. Démoulez soigneusement les moules PDMS des moules maîtres imprimés en 3D, en faisant le tour des bords du moule avec un scalpel, puis en retirant le moule avec une pince à épiler.
   REMARQUE : Pour faciliter l’élimination de la moisissure, l’IPA peut être utilisé ; cependant, les moules doivent être chauffés à 60 °C pendant 10 minutes par la suite pour évaporer l’excès d’IPA.

3. Préparation du canal supérieur OSTE-COC

1. Poids OSTE à un rapport p/p de 1,09:1 (pour 5 appareils, 1,56 g de partie A et 1,44 g de partie B sont nécessaires). Mélanger les composants dans un mélangeur centrifuge planétaire : mélanger pendant 5 min à 750 tr/min, puis dégazer pendant 5 min à 750 tr/min.
2. Transférer l’OSTE mélangé dans un tube à centrifuger et dégazer à -800 mbar dans un dessiccateur sous vide pendant 30 min.
3. Nettoyez les glissières COC avec 2 x 16 connecteurs mini Luer par sonication en IPA pendant 10 min. Séchez soigneusement les lames avec N₂.
4. Placez les lames de COC propres dans l’asher plasma de manière à ce que la surface plane soit placée vers le haut, et traitez la surface avec un plasma d’oxygène 800 SCCM pendant 2 min à une puissance de 700 W avec une pression de 0,133 mbar.
5. Placez la lame COC oxydée sur le moule PDMS pour le canal supérieur afin que la surface traitée soit en contact avec la surface structurée du PDMS. Placez l’ensemble dans un gabarit de moulage en place, en serrant le gabarit avec une clé dynamométrique réglée sur 0,3 Nm.
6. Raccordez le système de pression à la conduite d’air comprimé à 6 bars. Prenez le tube de centrifugation avec OSTE dégazé et assemblez-le selon les instructions du système de pression à l’aide d’un tube en polytétrafluoréthylène (PTFE) de 0,8 mm de diamètre intérieur (DI).
7. Connectez le tube PTFE à l’entrée du moule PDMS et, en utilisant une pression de 1000 mbar maintenue par une pompe piézoélectrique située dans le système de pression, remplissez l’appareil. Placez le gabarit avec le côté verre vers le haut dans l’aligneur du masque et exposez avec une dose de 850 mJ à l’aide du filtre ND33.
8. Après l’exposition, démontez le gabarit à l’aide d’une clé hexagonale et retirez soigneusement la lame COC avec la couche OSTE structurée du moule PDMS.
9. Mettez l’OSTE structuré en contact avec une membrane de 25 mm x 75 mm avec des pores de 50 nm et une densité de pores de 11,8 % afin que les canaux soient entièrement recouverts de la membrane.
   REMARQUE : Il est particulièrement important de garder la membrane aussi droite que possible pendant le processus d’application.
10. Placez l’ensemble sur une plaque chauffante réglée à 60°C avec la membrane vers le haut, placez une lame de verre propre sur la membrane et appliquez une pression de 1,6 kPa par le haut pour assurer une liaison uniforme. Chauffer l’assemblage pendant la nuit.
    REMARQUE : Après cette étape, il est particulièrement important d’évaluer les performances de collage et la déformation du canal.

4. Préparation du canal inférieur OSTE-COC et de l’assemblage du dispositif

1. Mélanger OSTE à un rapport p/p de 1,09:1 (pour 5 dispositifs, 1,56 g de partie A et 1,44 g de partie B sont nécessaires). Mélanger les composants dans un mélangeur centrifuge planétaire : mélanger pendant 5 minutes à 750 tr/min, puis dégazer pendant 5 minutes à 750 tr/min.
2. Transférer l’OSTE mélangé dans un tube de faucon et dégazer à -800 mbar dans un dessiccateur sous vide pendant 30 min.
3. Nettoyez les diapositives COC par sonication dans l’IPA pendant 10 minutes. Séchez soigneusement les lames avec N₂.
4. Placez les lames COC propres dans l’asher plasma et traitez la surface avec un plasma d’oxygène 800 SCCM pendant 2 min à une puissance de 700 W avec une pression de 0,133 mbar.
5. Placez la lame COC oxydée sur le moule PDMS pour le canal inférieur afin que la surface traitée soit en contact avec la surface structurée du PDMS. Placez l’ensemble dans un gabarit de moulage en place, en serrant le gabarit avec une clé dynamométrique réglée sur 0,3 Nm.
6. Prenez le tube de faucon avec OSTE dégazé et assemblez-le selon les instructions du système de pression à l’aide d’un tube PTFE de 0,8 mm de diamètre intérieur.
7. Connectez le tube PTFE à l’entrée du moule PDMS et en utilisant une pression de 1000 mbar remplissez l’appareil. Placez le gabarit avec le côté verre vers le haut dans l’aligneur du masque et exposez avec une dose de 1100 mJ à l’aide d’un filtre ND33.
8. Après l’exposition, démontez le gabarit à l’aide d’une clé hexagonale et retirez soigneusement la lame COC avec la couche OSTE structurée du moule PDMS.
9. Combinez la couche OSTE structurée avec l’assemblage du canal supérieur de manière à ce que la conception de la couche supérieure et de la couche inférieure soit alignée l’une avec l’autre et que la couche inférieure OSTE soit en contact avec la membrane.
10. Insérez le motif dans un gabarit de moulage sur place et, à l’aide de pinces bouledogue, appliquez une pression de 1,6 kPa sur l’appareil de manière uniforme. Placez le gabarit dans un four à 60°C pendant la nuit.
    REMARQUE : Un placement inégal des clips peut entraîner une liaison inégale.

5. Évaluation de l’appareil

1. Après le collage, évaluez visuellement les appareils avec un microscope pour détecter les défauts visuels, par exemple une déformation du canal ou un collage infructueux.
2. Testez les appareils sans défaut en faisant passer de l’eau déminéralisée filtrée de 0,02 μm à travers les canaux avec une pression de 30 mbar. Observez les fuites du canal d’écoulement et du port Luer et le débit d’eau.
   REMARQUE : Si aucune fuite ne peut être détectée et que le débit du canal est ininterrompu, les appareils sont considérés comme utilisables pour d’autres expériences.

6. Configuration de l’appareil

1. Remplissez deux seringues de 5 mL avec 2 mL de 20 nm filtré à 3 %_{H 2}O₂ et placez-les sur un pousse-seringue (utilisez les flèches de mouvement pour la distance nécessaire, insérez les seringues et fixez-les en place avec la barre supérieure).
   PRUDENCE! Soyez toujours prudent lors de la manipulation de H₂O₂. Portez une blouse de laboratoire, des gants de protection en caoutchouc et des lunettes de protection.
2. Connectez un tube PTFE de 14 cm de long et 800 μm de diamètre intérieur aux seringues à l’aide des aiguilles de seringue et aux entrées de l’appareil à l’aide de connecteurs Luer.
3. Connectez un tube de 20 cm de long et 200 μm de diamètre intérieur en polyéther éther cétone (PEEK) aux sorties.
4. Connectez l’autre extrémité du tube PEEK à un conteneur à déchets. La configuration est illustrée à la figure 3.
5. Démarrez le pousse-seringue à la vitesse d’écoulement de 500 μL/min pour chaque entrée (sur l’écran de l’instrument : Paramètres > Réglage du système > la seringue (fabricant : seringue médicale, seringue : 5 mL) > Bouton de retour > Paramètres (Sélectionner : perfusionner, Répéter : 1, Volume : 1,5 mL, Débit : 500 μL/min) > Bouton de retour > Bouton de retour ). Collectez le flux dans un conteneur à déchets.
6. Remplissez deux seringues neuves de 5 ml avec 2 ml d’éthanol filtré à 70 % à 20 nm.
7. Remplacez les seringues précédentes par les seringues remplies d’éthanol et démarrez le pousse-seringue en utilisant les mêmes paramètres que ceux décrits à l’étape 6.5.
8. Utilisez des seringues neuves de 5 ml et remplissez-les de 5 ml de solution saline tamponnée au phosphate filtrée (PBS) de 20 nm.
9. Remplacez les seringues précédentes par des seringues remplies de PBS et rincez le dispositif avec 4 ml de PBS en répétant les étapes 6.1. et 6.5.
   REMARQUE : Assurez-vous de modifier les paramètres de configuration du système sur Volume : 4 mL (sur l’écran de l’instrument : Paramètres > Paramètres > (Sélectionner : Volume : 4 mL).
10. Débranchez le tube de l’appareil et fermez chaque entrée et sortie avec des bouchons Luer.
    REMARQUE : Laissez le PBS dans l’appareil et évitez de piéger de l’air en ajoutant du PBS supplémentaire sur chaque entrée et sortie à l’aide d’une micropipette avant de fermer.
11. Laissez l’appareil toute la nuit dans un endroit sombre à température ambiante (RT).
12. Le lendemain, rincez le dispositif rempli de PBS avec 4 mL de PBS filtré à 20 nm (comme décrit à l’étape 6.8).
13. Prélever le dernier 1 mL de l’écoulement des deux sorties dans un tube de 2 mL à faible liaison protéique et stocker à 4 °C comme blanc pour les particules introduites par l’appareil.
14. Retirez les seringues remplies de PBS et remplacez-les par des seringues neuves de 5 ml remplies d’air.
15. Purgez l’appareil avec 4 ml d’air jusqu’à ce que tout le liquide soit sorti de l’appareil et de la tubulure.

7. Test de l’appareil avec des billes de latex standardisées

1. Préparer un échantillon de billes normalisées à l’aide de billes de polystyrène de 1,0 m et de billes de carboxylate de 0,1 m. Dans un tube de 15 mL, ajouter 500 μL d’étalons de billes de polystyrène de 1,0 μm, 1 μL d’étalons de billes de carboxylate de 0,1 μm et 9499 μL de PBS filtré à 20 nm (la concentration finale du mélange de billes de 1,0 et 0,1 μm sera de 5 × 108 billes/mL et de 3,6 × 1010 billes/mL respectivement).
2. Agitez l’échantillon de billes pendant 30 s et conservez-le à +4 °C lorsqu’il n’est pas utilisé.
3. Remplissez une nouvelle seringue de 5 mL avec 1,5 mL du mélange de billes normalisé et une autre avec 1,5 mL de PBS filtré à 20 nm.
4. Retirez les seringues précédemment attachées et fixez la seringue de mélange de billes à la première tubulure d’entrée et l’autre à la deuxième entrée.
5. Retirez le récipient à déchets et préparez au moins cinq tubes de microcentrifugation de 0,5 mL pour chaque tube de sortie.
6. Modifiez les paramètres de démarrage du système de pousse-seringue sur Volume : 1 mL ; Débit : 250 μL/min.
   REMARQUE : Selon les besoins de l’utilisateur, différentes vitesses de débit telles que 250 μL / min, 200 μL / min, 150 μL / min, 100 μL / min et 50 μL / min peuvent être réglées. Une étude préliminaire pour choisir la vitesse la plus favorable pour le résultat souhaité est recommandée.
7. Démarrez le pousse-seringue et collectez le débit sortant - 5 à 6 gouttelettes dans chaque tube de microcentrifugation.
   REMARQUE : Si le même appareil est utilisé plusieurs fois, rincez l’appareil comme décrit à l’étape 6.8 et changez tous les connecteurs, fiches et aiguilles. Lavez les connecteurs, fiches et aiguilles usagés en les laissant dans de l’éthanol filtré à 70 % à 20 nm pendant au moins 30 min. Ensuite, déplacez toutes les pièces dans un tube contenant de l’eau déminéralisée filtrée à 20 nm, secouez soigneusement le tube et transférez-les dans une boîte de Pétri contenant 20 ml d’eau déminéralisée filtrée à 20 nm. Laissez la boîte de Pétri sur le shaker pendant au moins 30 min à 100 tr/min, puis laissez sécher les choses dans une boîte de Pétri sèche (pendant au moins 12 h) avant de réutiliser.

8. Test de l’appareil avec des échantillons d’urine

1. Préparez l’appareil comme décrit aux étapes 6.1 à 6.15.
2. Prélever 100 mL d’urine matinale par donneur à l’aide de contenants stériles et les remettre au laboratoire pour traitement dans les 2 heures suivant le prélèvement.
3. Séparer chaque échantillon d’urine dans deux tubes de 50 mL et centrifuger à 2'000 x g pendant 15 min à RT.
4. Récupérez le surnageant et jetez la pastille.
5. Centrifuger le surnageant à 10'000 x g pendant 30 minutes à RT pour éliminer les grosses particules et les débris cellulaires.
6. Récupérez le surnageant et jetez la pastille.
7. Lavez l’appareil comme décrit en 6.6.
8. Remplacer les seringues de 5 mL par une seringue de 20 mL remplie de l’échantillon d’urine préparé pour l’entrée de l’échantillon et une autre seringue de 20 mL remplie de 20 mL de DEPC-PBS filtré à 20 nm pour l’entrée du tampon. Modifiez les paramètres du pousse-seringue en BDPlastipak ; Seringue : cc ; Volume : 20 mL ; Débit : 250 μL/min (débit optimal), similaire à celui décrit à l’étape 6.2. Démarrez le pousse-seringue et collectez le débit de chaque sortie dans des tubes séparés de 50 ml.
9. Concentrer chaque écoulement séparément à l’aide de tubes de concentration de coupure de 100 000 μL à 100 μL chacun à 3 000 x g à 4 °C.
10. Transférer les concentrés dans des tubes de microcentrifugation de 0,5 ml.
11. Agitez les échantillons concentrés pendant 30 secondes, puis faites tourner pendant 10 secondes.
12. Aliquote les échantillons en transférant 25 μL d’échantillon par tube, étiquetez-les et congelez-les à -80 °C pour un stockage à long terme.

9. Test de l’appareil avec des milieux conditionnés

1. Préparez l’appareil comme décrit aux étapes 6.1 à 6.15.
2. Cultiver des cellules dans un environnement humidifié à 5 % de CO₂ à 37 °C jusqu’à ce que le nombre total atteigne 100 millions selon Bajo-Santos et ^coll.20 Passage des cellules dans un seul ballon de suspension T175 dans 100 mL de milieu sans sérum complété par un supplément de substitut de sérum B-27 à 2 % et culture dans un environnement humidifié à 5 % de CO₂ à 37 °C pendant 48 h supplémentaires.
3. Prélevez la suspension cellulaire et centrifugez-la à 300 x g pendant 5 min à RT pour éliminer les cellules.
4. Prélever et centrifuger à nouveau le surnageant à 3 000 x g pendant 30 min à +4 °C pour éliminer les grosses particules et les débris cellulaires.
5. Prélever le surnageant et le conserver à +4°C jusqu’à ce que la séparation puisse avoir lieu, mais pas plus de 3 h.
6. Remplacer les seringues de 5 mL par des seringues de 20 mL remplies du milieu conditionné préparé pour l’entrée de l’échantillon et remplies de 20 mL de PBS filtré à 20 nm pour l’entrée du tampon.
7. Réglez les paramètres de la station de pompage comme décrit à l’étape 7.8.
8. Démarrez le pousse-seringue et collectez le débit de chaque sortie dans un tube séparé de 50 ml.
9. Concentrer chaque flux séparément à l’aide de tubes de concentration de coupure de 100 000 poids moléculaires à 150 μL chacun à 3 000 x g à +4 °C.
10. Transférer les concentrés dans des tubes de microcentrifugation de 0,5 ml.
11. Vortex concentré échantillons pendant 30 s.
12. Faites tourner les échantillons concentrés pendant 10 s.
13. Aliquote les échantillons en transférant 25 μL d’échantillon par tube, étiquetez-les et congelez-les à -80 °C pour un stockage à long terme.

10. Isolation des VE par ultracentrifugation

1. Centrifuger 20 mL d’urine ou de milieu cellulaire conditionné à 100 000 x g pendant 70 min à +4 °C à l’aide d’une centrifugeuse à rotor à angle fixe.
2. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 20 mL de PBS filtré à 20 nm.
3. Centrifuger à nouveau, comme expliqué en 10.1.
4. Jeter le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 12 mL de PBS filtré à 20 nm.
5. Centrifuger à 100 000 x g pendant 70 min à +4 °C à l’aide d’un rotor pivotant.
6. Jetez le surnageant.
   REMARQUE : Soyez prudent lorsque vous jetez le surnageant cette fois. Il est recommandé de le faire avec une pipette.
7. Remettre la pastille en suspension dans 100 μL de PBS filtré à 20 nm.
8. Aliquote l’échantillon et passer à la séquence 12 pour la caractérisation de l’EV. Sinon, conserver à -80 °C jusqu’à nouvel ordre.

11. Isolement des VE par chromatographie d’exclusion stérique (SEC)

1. Concentrer 20 mL d’urine ou de milieu cellulaire conditionné à 500 μL à l’aide d’unités de filtration centrifuge à 100 kDa à 3 000 x g à +4 °C pendant 15 min.
2. Transférez le concentré sur la colonne SEC (plage de charge de 35 nm).
3. Versez le PBS filtré de 20 nm sur la colonne et collectez 15 fractions de 0,5 ml.
4. Analysez les fractions avec un système de diffusion dynamique de la lumière (DLS) en suivant les instructions du fabricant.
5. Regroupez les fractions sélectionnées. Choisissez des fractions avec un atténuateur inférieur à 11 et au moins 30 % du total des particules étant supérieures à 40 nm.
6. Concentrer des fractions sélectionnées à 100 μL à l’aide d’unités de filtration centrifuges à coupure de poids moléculaire (MWCO) de 3 kDa à 14 000 x g à +4 °C pendant 15 min.
7. Aliquoter l’échantillon et passer à la section 12 pour la caractérisation des VE. Sinon, conserver à -80 °C jusqu’à nouvel ordre.

12. Caractérisation des véhicules électriques

1. Prélever l’échantillon à caractériser du congélateur et le décongeler lentement (sur un bloc de glace ou à +4 °C).
2. Effectuer une analyse de suivi des nanoparticules (NTA) pour déterminer la distribution granulométrique et la quantité^{de particules 13}. Effectuer un test immuno-enzymatique à double sandwich de protéine membranaire des cellules T 4 (TIM-4) de haute affinité (dsELISA)¹⁴ pour confirmer la présence de VE dans les échantillons.

13. NTA

1. Vortex l’échantillon EV décongelé pendant 30 s et spin pendant 10 s, puis transférez 1 μL à 999 μL de PBS filtré à 20 nm dans un tube de microcentrifugation de 2 mL pour le diluer 1000 fois. Conservez 1 mL de PBS supplémentaire utilisé pour la dilution afin de vérifier qu’il ne contient pas de particules. Stockez le tout à +4 °C jusqu’à la mesure.
   REMARQUE : Filtrez PBS à travers un filtre de 0,02 nm avant utilisation.
2. Vortex l’échantillon ou l’ébauche EV pendant 30 s et insérez-le dans le module à l’aide d’une seringue. Remplissez le module avec environ 0,7 ml d’échantillon et placez-le dans l’instrument.
3. Mesurez l’échantillon à l’aide de l’analyseur de nanoparticules en suivant les instructions du fabricant.

14. dsELISA pour les marqueurs EV

1. Préparez une solution de 1 μg/mL de protéine TIM4-Fc. Enduire les puits d’une plaque ELISA de 96 puits en transférant 100 μL de solution dans chaque puits nécessaire et incuber pendant la nuit à +4 °C en agitant à 200 tr/min.
2. Le lendemain, préparez la solution de lavage (1x TBS + 0,05% Tween20 + 2 mM CaCl₂).
3. Jeter tout le liquide dans chaque puits. Bien laver chaque puits en ajoutant 200 μL de solution de lavage, en agitant à 200 tr/min pendant 5 minutes à RT et en jetant. Répétez cette étape deux fois.
4. Préparez une solution bloquante (1x TBS + 0,05% Tween20 + 1% d’albumine sérique bovine. Ajouter 200 μL de solution de blocage dans chaque puits et incuber à RT pendant 1 h en agitant à 200 tr/min.
5. Lavez chaque puits comme décrit à l’étape 14.3.
6. Préparer 220 μL de chaque dilution de l’échantillon dans un tampon de lavage (la concentration optimale de VE est de 2,7 × 10^{5 VE} /μL). Ajouter 100 μL de l’échantillon dilué par puits et effectuer deux répétitions. Incuber à RT pendant 90 min en secouant à 200 tr/min.
7. Lavez chaque puits comme décrit à l’étape 14.3.
8. Ajouter 100 μL d’anticorps correspondants dans chaque puits. Utiliser les marqueurs de VE appropriés pour confirmer les VE et les contaminants⁴. Incuber à RT pendant 2 h en secouant à 200 tr/min. REMARQUE : Si des anticorps secondaires sont utilisés, répétez les étapes 14.7-14.8. Cependant, réduisez la période d’incubation des anticorps secondaires à 1 h.
9. Lavez chaque puits comme décrit à l’étape 14.3.
10. Ajouter 100 μL de substrat de peroxydase de raifort dans chaque puits, mélanger la plaque pendant 1 min et incuber à RT pendant 30 min.
11. Ajouter 1 M H₂SO₄ dans chaque puits pour arrêter la réaction.
12. À l’aide d’un lecteur de microplaques, mesurez l’absorbance à 450 nm.

Résultats

Nous avons fabriqué un dispositif microfluidique à l’aide d’un moule double négatif imprimé en 3D (Figure 1) par lithographie douce (Figure 2A) pour une séparation à haut débit des VE basée sur le principe A4F bifurqué (Figure 2B,C). L’installation nécessite une pompe et une station de circulation, comme on peut le voir sur la figure 3, pour isoler les véhicules électriques de manière automatisée. Tout d’abord, pour évaluer la preuve de concept des dispositifs, un mélange de billes de polystyrène de 100 nm et 1000 nm de diamètre a été préparé pour représenter les vésicules et les débris cellulaires fins, respectivement¹⁰. Des expériences ont été menées avec des débits variables pour le mélange de billes, avec et sans écoulement bifurqué, afin d’étudier l’effet de la vitesse linéaire sur l’efficacité de la séparation. Dans toutes les expériences, la récupération des petites billes est restée constante et supérieure à 90 %¹⁰, montrant le potentiel du dispositif pour récupérer les VE.

Ensuite, nous avons évalué et comparé le potentiel du dispositif COC-OSTE pour isoler les VE de grands volumes (>1 mL) de biofluides complexes avec un prétraitement minimal. Ainsi, l’urine de 10 donneurs sains (figure 4) et les milieux cellulaires de deux lignées cellulaires prostatiques différentes (figure 5) ont été utilisés comme modèle pour isoler simultanément les VE en suivant trois procédures différentes : l’ultracentrifugation (UC), la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) et le dispositif OSTE-COC basé sur la microfluidique A4F. Après isolement, le nombre total de particules et leur distribution granulométrique ont été évalués à l’aide d’une analyse de suivi des nanoparticules (NTA). En moyenne, le dispositif OSTE-COC a montré une meilleure récupération des particules totales des biofluides par rapport à la CU, mais la signification statistique n’a été obtenue qu’en combinant le nombre de particules des deux ports (Figure 4A). Afin de comparer les performances de l’appareil avec d’autres systèmes, la prise R & L doit être prise en considération. Comme le montre la figure 4, les performances des sorties L et R sur la récupération des VE surpassent celles de l’UC et de la SEC. Séparément, le port L a été conçu pour capturer la petite fraction EV, tandis que le port R a été conçu pour collecter la plus grande fraction EV avec d’autres molécules de taille similaire. Il est intéressant de noter que la récupération à l’aide du R-PORT du dispositif OSTE-COC était légèrement supérieure à celle de la SEC et de la CU seules (Figure 4A). L’expression de CD63 a montré un schéma similaire (Figure 4C). Ce résultat indique que le dispositif OSTE-COC était plus efficace dans la récupération totale des VE. Une distribution granulométrique équivalente a été trouvée entre les différentes méthodologies, sauf pour la CU, qui montre une distribution granulométrique plus grande (figure 4B).

Des résultats comparables ont été observés dans des cultures de milieux cellulaires. Dans les deux scénarios, la récupération totale des particules à partir des deux ports du dispositif a montré des performances supérieures à celles des méthodologies SEC ou UC (comme illustré dans la figure 5A, B). Notamment, les VE dérivées des cellules PC3 ont démontré une distribution de taille distincte, avec une plus grande homogénéité dans la distribution L-PORT par rapport à d’autres groupes expérimentaux (Figure 5C,D). De plus, l’analyse de l’expression de CD63 a confirmé les taux de récupération plus élevés des VE obtenus à l’aide du dispositif COC-OSTE (comme illustré dans la figure 5E,F). Un résumé comparant les caractéristiques d’isolement des différentes méthodologies examinées dans cette étude se trouve au tableau 1.

Figure 1 : Dimensions du moule double négatif en forme de serpentin 3DP et vue isométrique. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Dispositif microfluidique COC-OSTE. (A) Schéma des différentes étapes principales de la fabrication du dispositif OSTE-COC. (B) Principe de fonctionnement de l’appareil. (C) Image de l’appareil fini. Barre d’échelle : 15 mm. Cette figure a été modifiée avec la permission de Priedols et ^al.10 et de Bajo-Santos et ^al.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Configuration expérimentale de l’appareil. Le pousse-seringue est à gauche, le dispositif OSTE-COC est au milieu et la station de récupération est à droite. Cette figure a été modifiée avec la permission de Priedols et ^al.10 et de Bajo-Santos et ^al.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Distribution granulométrique des VE urinaires et récupération des particules chez 10 donneurs à l’aide de l’ultracentrifugation (CU), de la chromatographie d’exclusion stérique (SEC) et du dispositif COC-OSTE. (A) Quantité de particules récupérées à partir de chaque méthode d’isolement par analyse de suivi des nanoparticules (NTA). Les données sont représentées par une moyenne +/- écart-type. Signification statistique indiquée par * (p<0,05). (B) Les boîtes à moustaches montrent la distribution granulométrique moyenne parmi tous les échantillons d’urine évalués par la NTA, les moustaches indiquant les valeurs minimales et maximales. Les valeurs p ont été dérivées des comparaisons avec la colite ulcéreuse, **** indiquant une signification statistique élevée (p<0,0001). (C) La médiane et la plage de la quantité moyenne de CD63, évaluées à l’aide d’un test immuno-enzymatique à double sandwich (dsELISA), pour chaque méthode d’isolement, ont été calculées pour tous les échantillons. Port L : Port gauche ; Port R : Port droit. Cette figure a été modifiée avec la permission de Bajo-Santos et ^al.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Caractérisation des VE isolés des cellules PC3 et LNCaP à l’aide de différentes méthodes. (A) Quantité de particules récupérées dans un milieu PC3 à l’aide de l’analyse de suivi des nanoparticules (NTA) représentée par l’écart-type moyen+/- . (B) Quantité de particules récupérées à partir de milieux cellulaires LNCaP à l’aide de NTA représentée par une moyenne +/- écart-type. (C) La distribution granulométrique médiane des VE des cultures PC3, ainsi que la portée, ont été déterminées par NTA. (D) Distribution de la taille médiane des VE isolés à partir de cultures LNCaP avec portée. (E) Médiane et plage d’expression de CD63 pour chaque méthode d’isolement pour les VE dérivées de lignées cellulaires PC3, à l’aide d’un test immuno-enzymatique à double sandwich (dsELISA). (F) Médiane et plage d’expression de CD63 EV dérivée de LNCaP par dsELISA pour chaque méthode d’isolement. UC : Ultracentrifugation ; SEC : Chromatographie d’exclusion stérique ; Port L : Port gauche ; Port R : Port droit. Cette figure a été modifiée avec la permission de Bajo-Santos et ^al.20. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

	UC	SECONDE	COC-OSTE
Temps de traitement/échantillon	++/+++	+++	+
Débit	++	+	+++
Coût/échantillon	+	+++	++
Pureté	+	+++	++
Automatisation	++	+	+++
Rendement des véhicules électriques	++	++	+++
Sélection de la taille	+	++	++

Tableau 1. Comparaison des caractéristiques d’isolement des VE avec les trois méthodes UC SEC et le dispositif COC-OSTE. UC : Ultracentrifugation ; SEC : Chromatographie d’exclusion stérique. COC-OSTE : copolymère d’oléfine cyclique hors stœchiométrie thiol-ène. + : faible ; ++ : moyen ; +++ : élevé. * Selon l’appareil.

Discussion

Le dispositif microfluidique présenté offre une méthode prometteuse pour l’isolement et l’extraction des VE à partir de fluides biologiques, remédiant à certaines des limites critiques des méthodes de référence existantes telles que UC et SEC¹². L’UC et le SEC sont connus pour être à forte intensité de main-d’œuvre, de temps et de faible rendement, ce qui les rend moins adaptés aux applications à haut débit où de grandes quantités de VE sont nécessaires^21,22. En revanche, le dispositif microfluidique décrit peut traiter en continu un volume substantiel allant jusqu’à 20 ml de fluide biologique avec une intervention minimale de l’utilisateur, ce qui en fait un changement potentiel pour les environnements industriels ou cliniques. L’un des principaux avantages de ce dispositif microfluidique est sa capacité à standardiser l’isolation des VE et à améliorer la reproductibilité par rapport aux méthodes traditionnelles qui impliquent des étapes manuelles. En réduisant la variabilité de la fabrication des dispositifs d’isolation des VE grâce à la fabrication de masse, les performances du dispositif peuvent être mieux contrôlées et cohérentes, ce qui est vital pour des applications telles que les thérapies et les diagnostics basés sur les VE. En outre, la compatibilité du dispositif avec la fabrication en grand volume via le moulage par injection par réaction de substrats appropriés améliore encore son potentiel d’évolutivité et d’adoption plus large.

Pour assurer la reproductibilité et des performances constantes, un protocole étendu et bien défini est nécessaire, à la fois pour produire la puce et pour son utilisation dans les expériences. La puce est conçue dans une optique d’industrialisation. Cependant, lors de la fabrication du dispositif en laboratoire, il faut veiller à éviter la formation de bulles, à assurer une liaison précise et robuste et à effectuer des tests approfondis à des vitesses d’écoulement plus élevées que celles attendues dans les expériences réelles. Cette précaution est particulièrement importante pour les dispositifs COC-OSTE, car ils peuvent être sujets à des fuites en raison d’un collage infructueux, en particulier à des débits plus élevés. De plus, comme l’OSTE est un matériau photosensible, la fabrication de l’appareil doit être effectuée en lumière jaune pour éviter une exposition inutile aux UV. Comme cette technologie en est encore à ses débuts, les chercheurs devraient expérimenter différentes vitesses d’écoulement pour identifier le réglage optimal pour leur application spécifique, car les protocoles standardisés pour cette nouvelle méthode n’ont pas encore été établis et la viscosité du liquide peut clairement affecter l’efficacité de l’isolation des VE sur la base de nos résultats. En suivant ces directives et en relevant les défis de la normalisation, le potentiel de ce dispositif microfluidique pour l’isolation des véhicules électriques peut être pleinement réalisé dans divers domaines de recherche et applications.

La méthode d’isolation des VE à l’aide du dispositif microfluidique permet une modification et un dépannage approfondis pour optimiser les performances. Pour améliorer la séparation des particules, les chercheurs peuvent explorer des canaux plus longs, différentes porosités et densités de pores membranaires, et des dimensions modifiées. S’il y a beaucoup de grosses particules dans la sortie des petites particules, il peut être bénéfique de tester une vitesse d’entrée du tampon plus élevée, tandis que s’il y a beaucoup de petites particules dans la sortie des grosses particules, il est recommandé d’expérimenter avec un canal plus long ou une membrane avec des pores plus larges. La prise en charge de l’absorption des particules peut impliquer d’ajuster les vitesses d’écoulement, les modifications de surface et la composition OSTE ou de modifier le temps d’exposition aux UV. Pour les appareils souffrant d’instabilité et de fuite, la diminution des vitesses d’écoulement et la garantie d’un collage correct sont des étapes cruciales. Pour minimiser les dommages causés par les VE, les chercheurs peuvent réduire les vitesses d’écoulement, laver plus soigneusement avec du PBS après la stérilisation du dispositif et envisager d’utiliser des pores de membrane plus petits ou des techniques et matériaux de conception de moules alternatifs. Grâce à ces ajustements, le dispositif microfluidique peut être affiné, libérant ainsi son potentiel pour diverses applications dans la recherche sur les véhicules électriques et les domaines connexes. De plus, pour optimiser les performances de l’appareil, la caractérisation des échantillons en amont, y compris les mesures de densité et de viscosité, pourrait être intégrée pour ajuster les paramètres d’écoulement. En outre, une attention particulière doit être accordée à la nature de l’échantillon, compte tenu de la non-stérilité établie des biofluides²³. Par conséquent, la stérilisation des échantillons avant leur administration dans des applications cliniques doit être dûment envisagée.

Malgré ces défis, le dispositif microfluidique recèle un immense potentiel dans divers domaines de recherche. Sa capacité à isoler en continu les VE à partir de grands volumes d’échantillons très hétérogènes ouvre la porte à l’automatisation, facilitant les applications à haut débit et permettant une analyse plus approfondie des VE provenant de diverses sources. L’intégration de ce module microfluidique dans différents dispositifs, tels que des cartouches de bioréacteur à cellules creuses ou des cytomètres en flux à haute résolution, pourrait rendre les applications de VE plus conviviales pour l’industrie et stimuler l’innovation dans des domaines tels que l’administration de médicaments, le diagnostic et les cosmétiques⁴. Dans l’ensemble, ce dispositif microfluidique représente une avancée significative dans le domaine de la recherche sur les VE, offrant une méthode efficace et standardisée pour l’isolation des VE avec des applications prometteuses dans un large éventail de contextes de recherche et industriels.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
0,1 et micro ; m carboxylate FluoSpheres	Invitrogen	#F8803	Concentration de la matière : 3,6 x 1013 billes/mL (en fonction du LOT)
0,5 mL de tubes à microcentrifuger	Starstedt	72.704
1 mL Seringue à cône Luer à usage unique sans aiguille	RAYS	TUB1ML
1.0 µ ; m polystyrène FluoSpheres	Invitrogen	#F13083	Concentration de la matière : 1 x 1010 billes/mL (selon LOT)
10 mL Pipettes sérologiques	Sarstedt	86.1254.001
15 mL (100k) Filtres centrifuges Amicon Ultra	Merck Millipore	UFC910024
2,0 mL Tubes Protein LoBind	Eppendorf	30108132
seringues de 20 mL	BD PlastikPak
250 et micro ; m ID polyéther éther cétone tube	Darwin Microfluidics	CIL-1581
3 kDa MWCO unités de filtre centrifuge	Merck Millipore,UFC200324
5 mL Seringue médicale sans aiguille	Anhui Hongyu Wuzhou Medical	159646
50 mL tubes coniques	Sarstedt	62.547.254
70 Ti rotor d’ultracentrifugeuse à angle fixe	Beckman Coulter
800 et micro ; m ID tube en polytétrafluoroéthylène	Darwin Microfluidics	LVF-KTU-15
Microplaque à 96 puits, f-bottom, liaison moyenne	Greiner Bio-One	655001	Plaque ELISA
B-27 Supplement (50x), sans sérum	Thermo Fisher Scientific	17504044
Albumine sérique bovine	SigmaAldrich	A7906-100G
COC Plate-forme	de lames de microscopie TopasMicrofluidic Chipshop	10000002
COC Topas plate-forme de lames de microscopie 2 x 16 Mini Luer  ;	Microfluidic Chipshop	10000387
Régulateur de pression Elveflow OB1	Elvesys Group
Connecteurs Luer	Darwin Microfluidics	; CS-10000095
Aligneur de masque Suss MA/BA6	SUSS MicroTec Group
Mixer Thinky ARE-250	Thinky Corporation
NanoSight NS300	Malvern Panalytical	NS300	analyseur de nanoparticules  ;
Microscope optique Nikon Eclipse LV150N	Nikon Metrology NV
OSTE 322 Crystal Clear	Mercene Labs
PBS TABLETS.Ca/Mg gratuit. Bioréactifs Fisher. 100 g	Fisher Scientific	BP2944-100
Membrane PC (diamètre des pores de 50 nm, densité de 11,8 %)	it4ip S.A., Louvain-La Neuve, Belgique
Boîtes de Pétri, stériles	Sarstedt	82.1472.001
Plasma Asher GIGAbatch 360 M	PVA TePla America, LLC
qEVoriginal/Colonne 35 nm	Izon	SP5	SEC
QSIL 216 Kit d’élastomère de silicone	PP& S
Résine Tough Noir	Zortrax
SW40 Ti rotor d’ultracentrifugeuse pivotant	Beckman Coulter	331301
Pompe à seringue	DK Infusetek	ISPLab002
T175 suspension	Sarstedt	83.3912.502
TIM4-Fc	protéine Adipogen LifeSciences	AG-40B-0180B-3010
TMB (3,3',5,5'-tétraméthylbenzidine)	SigmaAldrich	T0440-100ML	Substrat de peroxydase de raifort
Tween20	SigmaAldrich	P1379-100ML
Ultracentrifugeuse Optima L100XP	Beckman Coulter
Unité de nettoyage à ultrasons P 60 H	Elma Schmidbauer GmbH
Spectrophotomètre	universel à microplaquesBio-Tek instruments	71777-1
Gobelet de collecte d’urine, 150mL, stérile	APTACA	2120_SG
Whatman Anotop 25 Seringue	Filtre SigmaAldrich	68092002
Zetasizer Nano ZS	Malvern Système de	diffusion dynamique de la lumière (DLS) préanalytique
Zortrax Inkspire	Zortrax