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Article de méthode

Procédé d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique pour la production à grande échelle de vésicules dérivées d’endosomes

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DOI :

10.3791/66021

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26 janvier 2024

 ,  , 
1Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine (HIM), Chinese Academy of Sciences, 3School of Materials Science and Engineering, Tianjin University, 4Zhejiang Cancer Hospital

Dans cet article

Résumé

Ici, nous décrivons une méthode d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique pour la production à grande échelle de nanovésicules dérivées d’endosomes en tant que nouveau type d’imitateurs d’exosomes (EM) qui partagent la même origine biologique et une structure, une morphologie et une composition protéique similaires aux vésicules extracellulaires (VE) natives.

Résumé

Les vésicules extracellulaires (VE) ont attiré une attention considérable dans la recherche physiologique et pathologique, le diagnostic des maladies et le traitement ; Cependant, leur application clinique a été limitée par l’absence d’approches de fabrication à grande échelle. Par conséquent, ce protocole fournit une méthode d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique pour la production à grande échelle de nanovésicules dérivées d’endosomes en tant que nouveau type d’imitateurs d’exosomes (EM) dérivés des endosomes, qui ont un rendement environ 100 fois supérieur à celui de la méthode d’ultracentrifugation conventionnelle. Dans cette méthode, les nanoparticules magnétiques (MNP) ont été internalisées par les cellules parentales via endocytose et ont ensuite été accumulées dans leurs endosomes. Ensuite, les endosomes chargés de MNP ont été collectés et purifiés par traitement hypotonique et séparation magnétique. Un homogénéisateur à grande vitesse a été utilisé pour décomposer les endosomes chargés de MNP en nanovésicules monodisperses. Les vésicules dérivées des endosomes qui en résultent présentent la même origine biologique et la même structure, caractérisées par l’analyse de suivi des nanoparticules, le microscope électronique à transmission et le western blot. Leur morphologie et leur composition protéique sont similaires à celles des VE natifs, ce qui indique que les ME peuvent potentiellement servir de substitut à faible coût et à haut rendement des VE natifs pour les traductions cliniques.

Introduction

Les vésicules extracellulaires (VE) sont de petites vésicules sécrétées par presque toutes les cellules d’une taille comprise entre 30 et 150 nm, contenant des substances bioactives abondantes. Selon la cellule d’origine, les VE présentent une grande hétérogénéité, possédant de multiples composants spécifiques aux cellules mères1. Les VE sont libérés dans les fluides corporels et transportés vers des sites éloignés où ils sont absorbés par les cellules cibles pour l’action2, qui peut être utilisée pour délivrer une large gamme de molécules et de médicaments bioactifs pour la réparation des tissus, le diagnostic et le traitement des tumeurs et la modulation immunitaire 3,4. Cependant, d’autres nanoparticules biologiques (p. ex., les lipoprotéines) et nanovésicules (p. ex., les VE dérivées de voies non endosomales) ayant des propriétés biophysiques similaires dans les fluides corporels affectent inévitablement l’isolement et la purification des VE. À ce jour, l’ultracentrifugation reste l’étalon-or pour l’isolation des véhicules électriques, et d’autres méthodes d’isolement, notamment la centrifugation à gradient de densité du saccharose, l’ultrafiltration, la précipitation du polyéthylène glycol, la chromatographie et l’isolement des billes immunomagnétiques, ont été développées5. Le goulot d’étranglement actuel qui limite la traduction clinique et la commercialisation des produits thérapeutiques contre les VE est le manque cruel de techniques d’isolement qui permettent un isolement hautement évolutif et reproductible des VE 6,7,8. Les techniques traditionnelles d’isolement des VE (par exemple, l’ultracentrifugation et la chromatographie d’exclusion de taille) souffrent d’un faible rendement (1 x 107-1 x 108/1 x 106 cellules), d’un cycle de production long (24-48 h), d’une mauvaise reproductibilité de la qualité du produit et nécessitent des équipements de production coûteux et énergivores qui ne peuvent pas répondre à la demande clinique actuelle de VE6.

Les imitateurs d’exosomes (EM), substituts synthétiques des VE natifs, ont attiré une attention importante en raison de leur structure, de leur fonction et de leur évolutivité très similaires en production. La principale source d’EM provient de l’extrusion directe de cellules parentales entières avec une section continue 9,10, démontrant des fonctions biologiques puissantes en tant que VE natives11,12. Par exemple, les EM dérivées de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (hUCMSCs) exercent des effets de cicatrisation similaires à ceux des VE natives et sont plus riches en protéines13. Bien que les EM dérivés de cellules entières aient la complexité biologique des VE, leur principal inconvénient est l’hétérogénéité des produits car ils sont inévitablement contaminés par divers organites cellulaires et débris cellulaires. L’analyse de la localisation des protéines a en outre révélé que les EM dérivés de l’extrusion de cellules entières contiennent de nombreuses protéines non spécifiques aux VE provenant des mitochondries et du réticulum endoplasmique13. De plus, la plupart des méthodes de fabrication des EM nécessitent encore une ultracentrifugation, un processus très long et énergivore14. Compte tenu du fait que les exosomes sont exclusivement dérivés d’endosomes cellulaires, nous avons émis l’hypothèse que les nanovésicules dérivées d’endosomes issues de la bio-ingénierie pourraient mieux récapituler l’homologie biologique entre les exosomes et les EM par rapport aux EM bien établies dérivées de la membrane cellulaire produites par la méthode d’extrusion de cellules entières14. Néanmoins, la fabrication de nanovésicules dérivées de l’endosome est difficile en raison du manque d’approches viables.

Des études cliniques ont été menées en utilisant les VE comme substitut d’une thérapie acellulaire et d’un système d’administration de médicaments à l’échelle nanométrique pour le traitement de diverses maladies. Par exemple, les VE dérivés de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse ont été utilisés pour traiter la pneumonie sévère causée par la COVID-19 et ont obtenu des résultats prometteurs. Récemment, des VE génétiquement modifiés porteurs de protéines CD24 ont également démontré de puissants avantages thérapeutiques pour le traitement des patients atteints de COVID-1915,16. Cependant, l’exigence clinique de la thérapie EV ne peut toujours pas être satisfaite avec les méthodes d’isolement traditionnelles en raison du faible rendement et du faible coût. Cette étude rend compte de la production à grande échelle de nanovésicules dérivées d’endosomes via une approche d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique. Il tire parti de la voie d’endocytose des MNP pour isoler les endosomes chargés de MNP par séparation magnétique, suivie d’une homogénéisation à grande vitesse pour formuler les endosomes en nanovésicules monodisperses. Étant donné que les types d’endosomes collectés par ce protocole sont divers, des recherches plus approfondies sont encore nécessaires pour établir de bonnes pratiques de fabrication (BPF) dans l’industrie. Cette nouvelle approche de préparation EM est plus efficace en termes de temps (5 min d’homogénéisation à grande vitesse) pour obtenir des nanovésicules homologues aux VE natives. Elle produit exponentiellement plus de vésicules à partir des mêmes quantités de cellules que l’ultracentrifugation, qui peut généralement être appliquée à différents types de cellules.

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Protocole

REMARQUE : Un schéma de la méthode est illustré à la figure 1.

1. Préparation et isolement de l’EM

  1. Internalisation cellulaire des MNP
    1. Culture cellulaire
      1. Suspendre 1 × 106 cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat (BMSC), des cellules 293T ou des cellules de cancer épithélial ovarien de souris (ID8) dans un milieu complet DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 5 % de solution de pénicilline-streptomycine (P/S) dans 2 mL par plaque à six puits (voir le tableau des matériaux).
      2. Cultivez les cellules pendant une nuit à 37 °C et 5 % de CO2.
        REMARQUE : Le nombre de cellules après l’observance était d’environ 1 × 106.
    2. Endocytose des MNP
      1. Réduire le volume moyen de chaque plaque à six puits à 1 mL. Co-culture des cellules avec des nanoparticules d’oxyde de fer (IONP) modifiées à la polylysine de 10 nm (voir tableau des matériaux) à une concentration de 100 μg/1 × 106 cellules et incubation à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 pendant 12 h pour permettre aux cellules d’endocytoser complètement les IONPs.
  2. Isolement et homogénéisation des endosomes
    1. Traitement hypotonique cellulaire
      1. Digérer les cellules qui ont complètement internalisé les IONP avec 0,5 mL/puits de trypsine pendant 3 min, et terminer la digestion en ajoutant 1 mL/puits de milieu complet.
      2. Centrifuger à 1000 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans une solution saline tampon phosphate (PBS) et une centrifugeuse, à plusieurs reprises deux fois pour éliminer le milieu résiduel et les ionp non absorbés.
      3. Enfin, remettre la pastille en suspension dans 8 mL dans une solution hypotonique préparée à l’avance (71,4 mM de chlorure de potassium, 1,3 mM de citrate de sodium, pH 7,2-7,4) pendant 15 min (voir le tableau des matériaux).
    2. Libération d’organites par homogénéisation à basse vitesse
      1. Transférer la suspension cellulaire en solution hypotonique dans un tube à essai en verre et libérer les organites à l’aide d’un homogénéisateur en verre (voir tableau des matériaux) par 20 chocs à 1000 tr/min.
    3. Séparation magnétique pour obtenir des endosomes
      1. Transférez 1 mL de la solution cellulaire homogénéisée dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et placez-le dans un séparateur magnétique pendant 1 h pour séparer complètement les endosomes chargés d’IONP des autres organites (tels que le noyau et les mitochondries) et des débris cellulaires.
      2. Recueillir les pastilles brunes sur la surface de contact des tubes de microcentrifugation à côté du cadre magnétique (voir tableau des matériaux), c’est-à-dire les endosomes chargés d’IONP. Jetez le liquide dans les tubes de microcentrifugation et ajoutez 3 mL de PBS pour remettre les endosomes en suspension.
  3. Homogénéisation à grande vitesse
    1. Transférez la solution contenant les endosomes dans un tube à centrifuger de 15 mL avec un volume de liquide compris entre 3 et 10 mL.
    2. Étendez la sonde de 10 mm de l’homogénéisateur à grande vitesse (voir tableau des matériaux) jusqu’au fond du tube de centrifugation sans toucher le fond. Ajustez le bouton Vitesse sous l’écran, réglez la vitesse sur 140 x g et ajustez le bouton Heure pour régler la durée de 5 min, puis appuyez sur le bouton OK .
    3. Appuyez sur le bouton Start pour effectuer l’homogénéisation après avoir placé une glacière sous l’échantillon.
  4. Tri magnétique pour EM
    1. Transférer la solution contenant les nanovésicules obtenue par homogénéisation à grande vitesse dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL et la mettre dans un séparateur magnétique pendant 1 h.
    2. Récupérez le liquide qui contient les EM requis. Veillez à ne pas toucher la surface des tubes à côté du cadre magnétique, qui a adsorbé les IONP libres et les EM chargés d’IONP.

2. Caractérisation EM (Figure 2 et Figure 3)

  1. Analyse de la diffusion dynamique de la lumière (DLS)
    1. Injecter 1 mL d’échantillon EMs (20 μg/mL) le long de la paroi dans la cuvette et le placer dans la fente d’échantillon de l’instrument DLS (voir le tableau des matériaux).
    2. Ouvrez le logiciel DLS, sélectionnez Test de taille de particule et lancez le test.
    3. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’une trousse d’analyse des protéines BCA (voir le tableau des matériaux).
  2. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
    1. Diluer les EM avec du PBS dans une solution à 1 ×10 7-1 × 108 particules/mL et les injecter dans la chambre de l’instrument NTA (voir Tableau des matériaux) à l’aide d’une seringue de 1 mL à un débit de 500-1000 μL/min.
    2. Ouvrez les 488 canaux laser et assurez-vous que le nombre d’EM dans l’interface logicielle est compris entre 100 et 300 et en mouvement brownien.
    3. Selon le protocole du fabricant, sélectionnez la SOP appropriée (EV-488) pour vous assurer que la sensibilité de l’instrument est adaptée à la détection EM.
  3. Microscopie électronique à transmission (MET)
    1. Fixez les EM (1 mg/mL) avec un volume égal de glutaraldéhyde à 5 % pendant 30 min et quantifiez la concentration d’EM à 1 mg/mL à l’aide d’une trousse de dosage des protéines BCA.
    2. Placez une goutte de 10 μL d’EM sur le côté carbone du treillis en cuivre et retirez l’excès de liquide du côté avec du papier filtre après 10 minutes. Ajouter 10 μL de PBS et éponger immédiatement avec du papier filtre. Répétez deux fois pour éliminer l’excès de glutaraldéhyde.
    3. Déposez 5 μL d’agent de contraste à base d’acétate d’uranyle et colorez négativement pendant 1 min, puis retirez l’excédent de produit de contraste. Laver trois fois avec de l’eau déminéralisée et sécher à température ambiante (RT).
    4. Enregistrement de l’image par un MET à une tension d’accélération de 100 kV.
  4. Transfert Western
    1. Ajouter 100 μL de tampon de lyse cellulaire et 5 μL d’un cocktail d’inhibiteurs de protéase 50x aux échantillons (voir le tableau des matériaux). Mélangez délicatement à l’aide d’un pistolet à pipette et mettez sur de la glace pendant 30 min.
    2. Centrifuger la solution à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C, quantifier la concentration en protéines du surnageant à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA, et la prélever.
    3. Mélanger le surnageant de 100 μL avec 25 μL de tampon de charge protéique 5x et chauffer à 95 °C pendant 10 min.
    4. Préparez les gels selon les instructions des gels préformés. Charger 15 μg de protéines par puits et faire fonctionner par électrophorèse sur gel à 80 V. Attendre que l’échantillon passe au gel de séparation, passer à 100 V, puis transférer la protéine sur une membrane de nitrocellulose à 100 V, 60 min sous bain de glace.
    5. Détecter les marqueurs non spécifiques aux VE (Calnexin) et les biomarqueurs des VE (Annexine et CD63) par Western Blot (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les anticorps sont dilués selon les recommandations du fabricant.

3. Détection de la fonction EM in vitro

  1. Marquage EMs
    1. Mélanger 1 μL de PKH26 avec 250 μL de diluant C (1 :250) pour obtenir 2x solution de coloration (4 × 10-6 M) (voir tableau des matériaux).
    2. Mélanger 250 μL d’EM (1 mg/mL) avec 250 μL de solution colorante 2x et souffler rapidement avec un pistolet de pipetage.
    3. Incuber à RT pendant 2 à 5 minutes tout en retournant doucement le tube de centrifugation.
    4. Ajouter un volume égal de sérum ou 1% de protéines sériques bovines et incuber pendant 1 min pour terminer la digestion.
    5. Éliminer l’excès de PKH26 par ultrafiltration avec des tubes d’ultrafiltration 1000 KD à 3000 x g pendant 30 min, et répéter trois fois en ajoutant du PBS. Remettre le liquide restant en suspension à 500 μL avec du PBS et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm.
  2. Test d’absorption cellulaire
    1. Inoculation cellulaire : Semer 1 × 106 cellules dans des boîtes confocaux de 35 mm avec 1 mL de DMEM contenant 10 % de FBS et 5 % de P/S, et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant la nuit.
    2. Filtrez les EM avec des filtres stériles pour seringues de 0,22 μm afin d’éliminer toute contamination potentielle.
    3. Traiter les cellules avec des EM marqués PKH26 (109 particules/mL) pendant 8 h.
    4. Laver trois fois avec du PBS, ajouter du DAPI (10 ng/mL) et incuber pendant 10 min à RT.
    5. Acquérir les images de fluorescence en microscopie confocale à balayage laser en utilisant les canaux laser 405 nm et 561 nm (voir Tableau des matériaux).

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Résultats

Le déroulement de la préparation EM par homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique est illustré à la figure 1. Les cellules internalisent des ionp modifiés par la polylysine de 10 nm, qui sont spécifiquement accumulés dans les endosomes par endocytose (Figure 3A). Après avoir été traités avec un tampon hypotonique et homogénéisés, les endosomes chargés d’IONP sont libérés des cellules et ensuite collectés par séparation magnétique. Les e...

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Discussion

En tant que substitut de la thérapie acellulaire et d’un système d’administration de médicaments à l’échelle nanométrique, les VE n’ont pas encore répondu à leurs attentes cliniques, et l’un des principaux obstacles est le manque de méthodes de production et de purification évolutives et reproductibles6. Par conséquent, divers types d’EM ont été développés en tant qu’analogues de VE avec une complexité biologique similaire14. À ce jour, l’exemple EM le plus couramment utili...

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Déclarations de divulgation

D.W. et P.G. sont les co-inventeurs d’une demande de brevet déposée par l’Institut de médecine fondamentale et de cancérologie (IBMC) de l’Académie chinoise des sciences. L’autre auteur ne déclare aucun conflit d’intérêts.

Remerciements

Les auteurs reconnaissent l’utilisation d’instruments à l’installation centrale d’instrumentation partagée de l’Institut de médecine fondamentale et de cancérologie (IBMC) de l’Académie chinoise des sciences. Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC ; 82172598), la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang, en Chine (LZ22H310001), le projet de formation des talents en santé 551 de la Commission de la santé de la province du Zhejiang, en Chine, le projet de recherche sur le développement agricole et social du Bureau municipal des sciences et de la technologie de Hangzhou (2022ZDSJ0474) et la subvention de recherche interdisciplinaire de Qiantang.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Anticorps anti-annexineABclonalA11235Western blot
Kit de dosage BCABeyotimeP0012Dosage de la concentration en protéines
CalnexinGeneTexHL1598Western blot
CD63 anticorpsABclonalA19023Western blot
Tampon de lyse cellulaire pour Western et IPBeyotimeP0013Western
CentrifugeuseBeckmanAllegra X-30RCentrifugeuse cellulaire
CO2ThermoCell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopieNIKONA1 HD25Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)GIBCOC11995500BTCulture cellulaire
Diffusion dynamique de la lumière (DLS)MalvernZetasizer Nano ZS ZEN3600 Analyse dediamètre
Homogénéisateur de verre électriqueSCIENTZ(Ningbo, Chine)DY89-IIHomogénéisation à basse vitesse
Système FBS appauvri en exosomesBioscienceEXO-FBS-50A-1Culture cellulaire
Homogénéisateur à grande vitesseSCIENTZ(Ningbo, Chine)XHF-DYHomogénéisation à grande vitesse
GrillemagnétiqueTuohe Electromechanical Technology (Shanghai, Chine)NASéparation magnétique
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit pour le marquage général de la membrane cellulaireSigma-AldrichPKH26GL-1KTLe kit contient un linker cellulaire PKH26 dans de l’éthanol et du diluant C
Nanoparticules d’oxyde de fer (IONPs) modifiées par la polylysineTechnologieZhongke Leiming (Pékin, Chine)Mag1100-10Culture cellulaire
Potassium chlorureAladdin7447-40-7Traitement hypotonique cellulaire
Cocktail inhibiteur de protéaseBeyotimeP1030Inhibiteur de la protéinase
Citrate de sodiumAladdin7447-40-7Traitement hypotonique cellulaire
Microscopie électronique à transmission (TEM)JEOLJEM-2100plusMorphologie image
UltracentrifugeuseBeckmanOptima XPN-100Centrifugeuse à exosomes
ZetaView Analyseurs de suivi de nanoparticulesParticle MetrixPMX120Analyse de suivi de nanoparticules
buvard

Références

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