Method Article

Procédé d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique pour la production à grande échelle de vésicules dérivées d’endosomes

DOI:

10.3791/66021

⸱

January 26th, 2024

 ,  , 
1Academy of Medical Engineering and Translational Medicine, Tianjin University, 2Hangzhou Institute of Medicine (HIM), Chinese Academy of Sciences, 3School of Materials Science and Engineering, Tianjin University, 4Zhejiang Cancer Hospital

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ici, nous décrivons une méthode d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique pour la production à grande échelle de nanovésicules dérivées d’endosomes en tant que nouveau type d’imitateurs d’exosomes (EM) qui partagent la même origine biologique et une structure, une morphologie et une composition protéique similaires aux vésicules extracellulaires (VE) natives.

Abstract

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Les vésicules extracellulaires (VE) ont attiré une attention considérable dans la recherche physiologique et pathologique, le diagnostic des maladies et le traitement ; Cependant, leur application clinique a été limitée par l’absence d’approches de fabrication à grande échelle. Par conséquent, ce protocole fournit une méthode d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique pour la production à grande échelle de nanovésicules dérivées d’endosomes en tant que nouveau type d’imitateurs d’exosomes (EM) dérivés des endosomes, qui ont un rendement environ 100 fois supérieur à celui de la méthode d’ultracentrifugation conventionnelle. Dans cette méthode, les nanoparticules magnétiques (MNP) ont été internalisées par les cellules parentales via endocytose et ont ensuite été accumulées dans leurs endosomes. Ensuite, les endosomes chargés de MNP ont été collectés et purifiés par traitement hypotonique et séparation magnétique. Un homogénéisateur à grande vitesse a été utilisé pour décomposer les endosomes chargés de MNP en nanovésicules monodisperses. Les vésicules dérivées des endosomes qui en résultent présentent la même origine biologique et la même structure, caractérisées par l’analyse de suivi des nanoparticules, le microscope électronique à transmission et le western blot. Leur morphologie et leur composition protéique sont similaires à celles des VE natifs, ce qui indique que les ME peuvent potentiellement servir de substitut à faible coût et à haut rendement des VE natifs pour les traductions cliniques.

Introduction

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Les vésicules extracellulaires (VE) sont de petites vésicules sécrétées par presque toutes les cellules d’une taille comprise entre 30 et 150 nm, contenant des substances bioactives abondantes. Selon la cellule d’origine, les VE présentent une grande hétérogénéité, possédant de multiples composants spécifiques aux cellules mères1. Les VE sont libérés dans les fluides corporels et transportés vers des sites éloignés où ils sont absorbés par les cellules cibles pour l’action2, qui peut être utilisée pour délivrer une large gamme de molécules et de médicaments bioactifs pour la réparation des tissus, le diagnostic et le traitement des tumeurs et la modulation immunitaire 3,4. Cependant, d’autres nanoparticules biologiques (p. ex., les lipoprotéines) et nanovésicules (p. ex., les VE dérivées de voies non endosomales) ayant des propriétés biophysiques similaires dans les fluides corporels affectent inévitablement l’isolement et la purification des VE. À ce jour, l’ultracentrifugation reste l’étalon-or pour l’isolation des véhicules électriques, et d’autres méthodes d’isolement, notamment la centrifugation à gradient de densité du saccharose, l’ultrafiltration, la précipitation du polyéthylène glycol, la chromatographie et l’isolement des billes immunomagnétiques, ont été développées5. Le goulot d’étranglement actuel qui limite la traduction clinique et la commercialisation des produits thérapeutiques contre les VE est le manque cruel de techniques d’isolement qui permettent un isolement hautement évolutif et reproductible des VE 6,7,8. Les techniques traditionnelles d’isolement des VE (par exemple, l’ultracentrifugation et la chromatographie d’exclusion de taille) souffrent d’un faible rendement (1 x 107-1 x 108/1 x 106 cellules), d’un cycle de production long (24-48 h), d’une mauvaise reproductibilité de la qualité du produit et nécessitent des équipements de production coûteux et énergivores qui ne peuvent pas répondre à la demande clinique actuelle de VE6.

Les imitateurs d’exosomes (EM), substituts synthétiques des VE natifs, ont attiré une attention importante en raison de leur structure, de leur fonction et de leur évolutivité très similaires en production. La principale source d’EM provient de l’extrusion directe de cellules parentales entières avec une section continue 9,10, démontrant des fonctions biologiques puissantes en tant que VE natives11,12. Par exemple, les EM dérivées de cellules souches mésenchymateuses du cordon ombilical humain (hUCMSCs) exercent des effets de cicatrisation similaires à ceux des VE natives et sont plus riches en protéines13. Bien que les EM dérivés de cellules entières aient la complexité biologique des VE, leur principal inconvénient est l’hétérogénéité des produits car ils sont inévitablement contaminés par divers organites cellulaires et débris cellulaires. L’analyse de la localisation des protéines a en outre révélé que les EM dérivés de l’extrusion de cellules entières contiennent de nombreuses protéines non spécifiques aux VE provenant des mitochondries et du réticulum endoplasmique13. De plus, la plupart des méthodes de fabrication des EM nécessitent encore une ultracentrifugation, un processus très long et énergivore14. Compte tenu du fait que les exosomes sont exclusivement dérivés d’endosomes cellulaires, nous avons émis l’hypothèse que les nanovésicules dérivées d’endosomes issues de la bio-ingénierie pourraient mieux récapituler l’homologie biologique entre les exosomes et les EM par rapport aux EM bien établies dérivées de la membrane cellulaire produites par la méthode d’extrusion de cellules entières14. Néanmoins, la fabrication de nanovésicules dérivées de l’endosome est difficile en raison du manque d’approches viables.

Des études cliniques ont été menées en utilisant les VE comme substitut d’une thérapie acellulaire et d’un système d’administration de médicaments à l’échelle nanométrique pour le traitement de diverses maladies. Par exemple, les VE dérivés de cellules souches mésenchymateuses de la moelle osseuse ont été utilisés pour traiter la pneumonie sévère causée par la COVID-19 et ont obtenu des résultats prometteurs. Récemment, des VE génétiquement modifiés porteurs de protéines CD24 ont également démontré de puissants avantages thérapeutiques pour le traitement des patients atteints de COVID-1915,16. Cependant, l’exigence clinique de la thérapie EV ne peut toujours pas être satisfaite avec les méthodes d’isolement traditionnelles en raison du faible rendement et du faible coût. Cette étude rend compte de la production à grande échelle de nanovésicules dérivées d’endosomes via une approche d’homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique. Il tire parti de la voie d’endocytose des MNP pour isoler les endosomes chargés de MNP par séparation magnétique, suivie d’une homogénéisation à grande vitesse pour formuler les endosomes en nanovésicules monodisperses. Étant donné que les types d’endosomes collectés par ce protocole sont divers, des recherches plus approfondies sont encore nécessaires pour établir de bonnes pratiques de fabrication (BPF) dans l’industrie. Cette nouvelle approche de préparation EM est plus efficace en termes de temps (5 min d’homogénéisation à grande vitesse) pour obtenir des nanovésicules homologues aux VE natives. Elle produit exponentiellement plus de vésicules à partir des mêmes quantités de cellules que l’ultracentrifugation, qui peut généralement être appliquée à différents types de cellules.

Protocol

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REMARQUE : Un schéma de la méthode est illustré à la figure 1.

1. Préparation et isolement de l’EM

  1. Internalisation cellulaire des MNP
    1. Culture cellulaire
      1. Suspendre 1 × 106 cellules souches mésenchymateuses de moelle osseuse de rat (BMSC), des cellules 293T ou des cellules de cancer épithélial ovarien de souris (ID8) dans un milieu complet DMEM avec 10 % de sérum de veau fœtal (FBS) et 5 % de solution de pénicilline-streptomycine (P/S) dans 2 mL par plaque à six puits (voir le tableau des matériaux).
      2. Cultivez les cellules pendant une nuit à 37 °C et 5 % de CO2.
        REMARQUE : Le nombre de cellules après l’observance était d’environ 1 × 106.
    2. Endocytose des MNP
      1. Réduire le volume moyen de chaque plaque à six puits à 1 mL. Co-culture des cellules avec des nanoparticules d’oxyde de fer (IONP) modifiées à la polylysine de 10 nm (voir tableau des matériaux) à une concentration de 100 μg/1 × 106 cellules et incubation à 37 °C dans une atmosphère contenant 5 % de CO2 pendant 12 h pour permettre aux cellules d’endocytoser complètement les IONPs.
  2. Isolement et homogénéisation des endosomes
    1. Traitement hypotonique cellulaire
      1. Digérer les cellules qui ont complètement internalisé les IONP avec 0,5 mL/puits de trypsine pendant 3 min, et terminer la digestion en ajoutant 1 mL/puits de milieu complet.
      2. Centrifuger à 1000 x g pendant 5 min et jeter le surnageant. Remettre les cellules en suspension dans une solution saline tampon phosphate (PBS) et une centrifugeuse, à plusieurs reprises deux fois pour éliminer le milieu résiduel et les ionp non absorbés.
      3. Enfin, remettre la pastille en suspension dans 8 mL dans une solution hypotonique préparée à l’avance (71,4 mM de chlorure de potassium, 1,3 mM de citrate de sodium, pH 7,2-7,4) pendant 15 min (voir le tableau des matériaux).
    2. Libération d’organites par homogénéisation à basse vitesse
      1. Transférer la suspension cellulaire en solution hypotonique dans un tube à essai en verre et libérer les organites à l’aide d’un homogénéisateur en verre (voir tableau des matériaux) par 20 chocs à 1000 tr/min.
    3. Séparation magnétique pour obtenir des endosomes
      1. Transférez 1 mL de la solution cellulaire homogénéisée dans un tube de microcentrifugation de 1,5 mL et placez-le dans un séparateur magnétique pendant 1 h pour séparer complètement les endosomes chargés d’IONP des autres organites (tels que le noyau et les mitochondries) et des débris cellulaires.
      2. Recueillir les pastilles brunes sur la surface de contact des tubes de microcentrifugation à côté du cadre magnétique (voir tableau des matériaux), c’est-à-dire les endosomes chargés d’IONP. Jetez le liquide dans les tubes de microcentrifugation et ajoutez 3 mL de PBS pour remettre les endosomes en suspension.
  3. Homogénéisation à grande vitesse
    1. Transférez la solution contenant les endosomes dans un tube à centrifuger de 15 mL avec un volume de liquide compris entre 3 et 10 mL.
    2. Étendez la sonde de 10 mm de l’homogénéisateur à grande vitesse (voir tableau des matériaux) jusqu’au fond du tube de centrifugation sans toucher le fond. Ajustez le bouton Vitesse sous l’écran, réglez la vitesse sur 140 x g et ajustez le bouton Heure pour régler la durée de 5 min, puis appuyez sur le bouton OK .
    3. Appuyez sur le bouton Start pour effectuer l’homogénéisation après avoir placé une glacière sous l’échantillon.
  4. Tri magnétique pour EM
    1. Transférer la solution contenant les nanovésicules obtenue par homogénéisation à grande vitesse dans le tube de microcentrifugation de 1,5 mL et la mettre dans un séparateur magnétique pendant 1 h.
    2. Récupérez le liquide qui contient les EM requis. Veillez à ne pas toucher la surface des tubes à côté du cadre magnétique, qui a adsorbé les IONP libres et les EM chargés d’IONP.

2. Caractérisation EM (Figure 2 et Figure 3)

  1. Analyse de la diffusion dynamique de la lumière (DLS)
    1. Injecter 1 mL d’échantillon EMs (20 μg/mL) le long de la paroi dans la cuvette et le placer dans la fente d’échantillon de l’instrument DLS (voir le tableau des matériaux).
    2. Ouvrez le logiciel DLS, sélectionnez Test de taille de particule et lancez le test.
    3. Mesurez la concentration en protéines à l’aide d’une trousse d’analyse des protéines BCA (voir le tableau des matériaux).
  2. Analyse de suivi des nanoparticules (NTA)
    1. Diluer les EM avec du PBS dans une solution à 1 ×10 7-1 × 108 particules/mL et les injecter dans la chambre de l’instrument NTA (voir Tableau des matériaux) à l’aide d’une seringue de 1 mL à un débit de 500-1000 μL/min.
    2. Ouvrez les 488 canaux laser et assurez-vous que le nombre d’EM dans l’interface logicielle est compris entre 100 et 300 et en mouvement brownien.
    3. Selon le protocole du fabricant, sélectionnez la SOP appropriée (EV-488) pour vous assurer que la sensibilité de l’instrument est adaptée à la détection EM.
  3. Microscopie électronique à transmission (MET)
    1. Fixez les EM (1 mg/mL) avec un volume égal de glutaraldéhyde à 5 % pendant 30 min et quantifiez la concentration d’EM à 1 mg/mL à l’aide d’une trousse de dosage des protéines BCA.
    2. Placez une goutte de 10 μL d’EM sur le côté carbone du treillis en cuivre et retirez l’excès de liquide du côté avec du papier filtre après 10 minutes. Ajouter 10 μL de PBS et éponger immédiatement avec du papier filtre. Répétez deux fois pour éliminer l’excès de glutaraldéhyde.
    3. Déposez 5 μL d’agent de contraste à base d’acétate d’uranyle et colorez négativement pendant 1 min, puis retirez l’excédent de produit de contraste. Laver trois fois avec de l’eau déminéralisée et sécher à température ambiante (RT).
    4. Enregistrement de l’image par un MET à une tension d’accélération de 100 kV.
  4. Transfert Western
    1. Ajouter 100 μL de tampon de lyse cellulaire et 5 μL d’un cocktail d’inhibiteurs de protéase 50x aux échantillons (voir le tableau des matériaux). Mélangez délicatement à l’aide d’un pistolet à pipette et mettez sur de la glace pendant 30 min.
    2. Centrifuger la solution à 1000 x g pendant 10 min à 4 °C, quantifier la concentration en protéines du surnageant à l’aide d’un kit de dosage des protéines BCA, et la prélever.
    3. Mélanger le surnageant de 100 μL avec 25 μL de tampon de charge protéique 5x et chauffer à 95 °C pendant 10 min.
    4. Préparez les gels selon les instructions des gels préformés. Charger 15 μg de protéines par puits et faire fonctionner par électrophorèse sur gel à 80 V. Attendre que l’échantillon passe au gel de séparation, passer à 100 V, puis transférer la protéine sur une membrane de nitrocellulose à 100 V, 60 min sous bain de glace.
    5. Détecter les marqueurs non spécifiques aux VE (Calnexin) et les biomarqueurs des VE (Annexine et CD63) par Western Blot (voir le tableau des matériaux).
      REMARQUE : Les anticorps sont dilués selon les recommandations du fabricant.

3. Détection de la fonction EM in vitro

  1. Marquage EMs
    1. Mélanger 1 μL de PKH26 avec 250 μL de diluant C (1 :250) pour obtenir 2x solution de coloration (4 × 10-6 M) (voir tableau des matériaux).
    2. Mélanger 250 μL d’EM (1 mg/mL) avec 250 μL de solution colorante 2x et souffler rapidement avec un pistolet de pipetage.
    3. Incuber à RT pendant 2 à 5 minutes tout en retournant doucement le tube de centrifugation.
    4. Ajouter un volume égal de sérum ou 1% de protéines sériques bovines et incuber pendant 1 min pour terminer la digestion.
    5. Éliminer l’excès de PKH26 par ultrafiltration avec des tubes d’ultrafiltration 1000 KD à 3000 x g pendant 30 min, et répéter trois fois en ajoutant du PBS. Remettre le liquide restant en suspension à 500 μL avec du PBS et filtrer à travers un filtre de 0,22 μm.
  2. Test d’absorption cellulaire
    1. Inoculation cellulaire : Semer 1 × 106 cellules dans des boîtes confocaux de 35 mm avec 1 mL de DMEM contenant 10 % de FBS et 5 % de P/S, et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant la nuit.
    2. Filtrez les EM avec des filtres stériles pour seringues de 0,22 μm afin d’éliminer toute contamination potentielle.
    3. Traiter les cellules avec des EM marqués PKH26 (109 particules/mL) pendant 8 h.
    4. Laver trois fois avec du PBS, ajouter du DAPI (10 ng/mL) et incuber pendant 10 min à RT.
    5. Acquérir les images de fluorescence en microscopie confocale à balayage laser en utilisant les canaux laser 405 nm et 561 nm (voir Tableau des matériaux).

Results

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Le déroulement de la préparation EM par homogénéisation à grande vitesse assistée par séparation magnétique est illustré à la figure 1. Les cellules internalisent des ionp modifiés par la polylysine de 10 nm, qui sont spécifiquement accumulés dans les endosomes par endocytose (Figure 3A). Après avoir été traités avec un tampon hypotonique et homogénéisés, les endosomes chargés d’IONP sont libérés des cellules et ensuite collectés par séparation magnétique. Les endosomes isolés sont ensuite reconstitués en nanovésicules monodisperses, également appelées EM, par homogénéisation à grande vitesse. Nous avons exploré plusieurs paramètres clés (p. ex., la vitesse et le temps d’homogénéisation) afin d’identifier des conditions de préparation EM optimisées (Figure 2). Enfin, une vitesse d’homogénéisation de 140 x g pendant 5 min a été choisie comme condition optimisée en tenant compte de la taille des particules et du rendement des EM produits. Les IONP libres et les EM chargés d’IONP sont finalement éliminés de la solution finale du produit par une deuxième série de séparation magnétique pour obtenir des EM sans IONP. La méthode produit des nanovésicules très uniformes et monodispersées à partir d’endosomes de cellules parentales, partageant la même origine biologique que les VE natifs.

Pour comparer les VE obtenus par ultracentrifugation avec les EM générés par cette méthode, BMSC et 293T ont été préparés pour les VE et les EM. Le diamètre et la morphologie des EM ont été analysés par NTA et TEM. La morphologie des BMSC-EMs présente la caractéristique d’une structure typique en forme de vésicule en forme de bol et est délimitée par une bicouche lipidique (Figure 3A). Tel qu’analysé par la NTA, les BMSC-EM et les 293T-EM ont un diamètre hydrodynamique similaire à celui des VE natifs (BMSC-EV et 293T-EV) (Figure 3B). Les rendements BMSC-EMs d’homogénéisation à grande vitesse étaient de 8,16 × 10 8-1,42 × 109/1 × 10 6 cellules, et le rendement des VE natifs préparés par ultracentrifugation n’était que de 7,2 × 10 7-1,12 × 108/1 × 106cellules. De même, les rendements des 293T-EM d’homogénéisation à grande vitesse étaient de 3,71 × 10 8-7,58 × 108/1 × 10 6 cellules, ce qui est jusqu’à environ 100 fois supérieur à celui des 293T-EV natifs préparés par la méthode conventionnelle de l’ultracentrifugeuse (≈5,5 × 106/1 × 106 cellules) (Figure 4A).

De plus, les résultats du western blot ont montré que les BMSC-EM contiennent les mêmes biomarqueurs protéiques que les VE (CD63 et annexine). Les EM et les VE sont négatifs pour l’expression de Calnexin, ce qui suggère que les EM produits par cette méthode n’avaient presque aucune contamination de la membrane plasmique (Figure 3C). Il n’y a pas de différence significative dans la concentration de protéines entre EM et EV, les BMSC-EM et les BMSC-EV présentaient des concentrations de protéines totales similaires, 11,15 μg/1 × 10 9 particules et 14,71 μg/1 × 109 particules via le kit de dosage des protéines BCA. De plus, les 293T-EM et 293T-EV présentaient des concentrations de protéines totales d’environ 31,8 μg/1 × 10 9 particules et de 9,95 μg/1 × 109 particules, respectivement (figure 4B). Ces résultats indiquent que les EM ont une composition protéique similaire à celle des VE natifs. Pour détecter si les EM peuvent être endocytosés, les EM et les VE marqués PKH26 ont été co-incubés avec BMSC et ID8 à une concentration de 1 × 109 particules/mL pendant 8 h, et les cellules ont été observées par microscopie confocale à fluorescence pour confirmer que les EM pouvaient être facilement absorbés par les cellules pour agir ainsi que les VE (Figure 5).

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Figure 1 : Schéma de principe de la méthode d’homogénéisation à grande vitesse assistée par magnétisme. Étape 1 : Les cellules internalisent les IONP dans les endosomes par endocytose. Étape 2 : Prélever les organites, y compris les endosomes chargés d’IONP, après traitement hypotonique et homogénéisation. Étape 3 : Purifier les endosomes chargés d’IONP par séparation magnétique. Étape 4 : Les endosomes sont homogénéisés et reconstitués en nanovésicules monodisperses. Étape 5 : Éliminez les IONP libres et les EM chargés d’IONP par séparation magnétique pour collecter les EM sans IONP. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : L’optimisation des conditions de préparation EM. (A) Le diamètre et la PDI des BMSC-EM en réponse aux changements de vitesse d’homogénéisation lorsque le temps est réglé sur 5 min ont été analysés par DLS. (B) Le diamètre et la PDI des BMSC-EM en réponse aux changements de temps d’homogénéisation lorsque la vitesse d’homogénéisation est fixée à 140 x g ont été analysés par DLS. (C) Le diamètre et la PDI des BMSC-EM à différents points de stockage ont été analysés par DLS. (D) Le diamètre et la concentration des BMSC-EM en réponse aux changements de vitesse d’homogénéisation lorsque le temps est réglé à 5 min ont été analysés par NTA. (E) Le diamètre et la concentration des BMSC-EM en réponse au changement de temps d’homogénéisation lorsque la vitesse d’homogénéisation est fixée à 140 x g ont été analysés par NTA. (F) Le diamètre et le rendement des BMSC-EMs en réponse à la co-incubation des cellules BMSC avec des IONP de différentes concentrations ont été analysés par NTA. p < 0,0001. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Caractérisation des EM. (A) Caractérisation TEM de la morphologie des cellules parentales avec des IONP, des endosomes et des EM endocytosés. Les barres d’échelle représentent 500 nm. (B) Les diamètres hydrodynamiques de BMSC-EM, BMSC-EV, 293T-EM et 293T-EV sont caractérisés par NTA. (C) Résultats de l’analyse par transfert Western des BMSC-EMs, des BMSC-EVs et des lysats cellulaires BMSC. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Le rendement des ME est supérieur à celui des VE. (A) Le rendement des ME et des VE préparés à partir de BMSC et de 293T a été analysé par NTA. (B) Rendement en protéines des EM et des VE préparés à partir de BMSC et de 293T. **p < 0,01. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Images au microscope fluorescent représentatives des VE et EM marqués PKH26 internalisées par BMSC et ID8. Les barres d’échelle représentent 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En tant que substitut de la thérapie acellulaire et d’un système d’administration de médicaments à l’échelle nanométrique, les VE n’ont pas encore répondu à leurs attentes cliniques, et l’un des principaux obstacles est le manque de méthodes de production et de purification évolutives et reproductibles6. Par conséquent, divers types d’EM ont été développés en tant qu’analogues de VE avec une complexité biologique similaire14. À ce jour, l’exemple EM le plus couramment utilisé est celui des nanovésicules dérivées de la membrane plasmique cellulaire. La préparation de ces nanovésicules est relativement facile et directe en extrudant directement des cellules mères entières17. Cependant, les nanovésicules dérivées de la membrane plasmique cellulaire ne peuvent pas récapituler les VE natives en raison de deux inconvénients : premièrement, l’origine biologique de ces nanovésicules provient de la membrane plasmique cellulaire, qui contient des compositions lipidiques et protéiques différentes par rapport aux VE natives ; Deuxièmement, les contaminations, y compris les protéines, les acides nucléiques et les lipides provenant d’organites non EV et de débris cellulaires, provoquant une hétérogénéité inévitable des EM. Dans cette méthode, nous avons incubé des cellules avec des IONP et collecté des endosomes chargés d’IONP par séparation magnétique, puis généré des nanovésicules monodisperses par homogénéisation à grande vitesse, obtenant finalement des EM sans IONP par un deuxième cycle de séparation magnétique. De plus, nous avons optimisé les conditions de préparation EM en explorant l’impact de différents paramètres, tels que la vitesse et le temps d’homogénéisation, sur la taille et le rendement EM. Ce protocole tire parti d’un phénomène biologique intéressant : les MNP (par exemple, les IONP de 10 nm) peuvent être efficacement internalisées par presque toutes les cellules via l’endocytose et s’accumulent exclusivement dans les endosomes, et non dans d’autres organites. Ce processus biologique unique a permis d’isoler des endosomes chargés de MNP sans contaminations non EV par séparation magnétique. En retour, les nanovésicules préparées par ces endosomes cellulaires purifiés pourraient récapituler plus fidèlement la complexité biologique des VE natives.

De plus, l’étalon-or de la méthode d’isolement EV est l’ultracentrifugation, qui coûte des milieux de culture cellulaire massifs et un long temps de traitement de plus de 5 h et ne produit que 1 × 107-1 × 108 particules à partir de 1 x 10 6 cellules6. Les méthodes traditionnelles d’extrusion de cellules parentales entières comprennent plusieurs étapes impliquant l’extrusion de membranes à ultra-haute pression et l’ultracentrifugation, qui ont un rendement relativement plus élevé mais nécessitent un équipement coûteux17. Cependant, le rendement, l’efficacité, le coût et la main-d’œuvre de la production EM sont considérablement améliorés par l’utilisation de notre protocole. L’homogénéisateur à grande vitesse est un équipement courant et peu coûteux pour un temps de traitement court de 5 min dans ce protocole, et cette méthode peut produire jusqu’à 100 fois plus d’EM à partir de 1 × 106 cellules par rapport aux VE natifs. Cependant, cette méthode présente certaines limites, telles que la perte de protéines endosomiques lors de l’homogénéisation à grande vitesse, et il a été démontré que les MNP endocytosés par les cellules peuvent être transférés aux lysosomes, ce qui constituerait une contamination potentielle18.

En perspective, les EM peuvent être conçus pour exercer des fonctions biologiques importantes comme leurs homologues natifs, ce qui peut constituer un type nouveau et prometteur de thérapies biologiques. Des substances bioactives (p. ex., des protéines et des acides nucléiques) peuvent être intégrées dans les EM par sélection de cellules parentales spécifiques (p. ex., cellules souches19) ou par modification génétique (p. ex., protéines de fusion20). Par exemple, les nanovésicules dérivées de cellules par extrusion de cellules souches embryonnaires vivantes ont un effet positif sur le processus de récupération ou de cicatrisation des plaies19. La modification génétique est une approche alternative pour générer des EM avec des fonctions biologiques spécifiques. Par exemple, lorsque des cellules ont été transfectées avec des vecteurs de nanocorps de récepteurs anti-épidermiques du facteur de croissance (EGFR) fusionnés à des peptides de signal d’ancrage de glycosylphosphatidylinositol (GPI), les nanocorps de l’EGFR peuvent être ancrés à la surface des VE pour cibler les cellules tumorales exprimant l’EGFR20. Les EM ont donné de bons résultats en tant que substitut de la thérapie acellulaire et d’un système d’administration de médicaments à l’échelle nanométrique dans de multiples études précliniques14, mais il y a un manque de compréhension mécanistique globale de la thérapie EM ou EV avec des préoccupations concernant l’hétérogénéité et la reproductibilité des VE et des EM dans les enquêtes cliniques. Dans l’ensemble, les fonctions biologiques des EM et leurs implications cliniques justifient des recherches plus approfondies.

Disclosures

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D.W. et P.G. sont les co-inventeurs d’une demande de brevet déposée par l’Institut de médecine fondamentale et de cancérologie (IBMC) de l’Académie chinoise des sciences. L’autre auteur ne déclare aucun conflit d’intérêts.

Acknowledgements

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Les auteurs reconnaissent l’utilisation d’instruments à l’installation centrale d’instrumentation partagée de l’Institut de médecine fondamentale et de cancérologie (IBMC) de l’Académie chinoise des sciences. Cette étude a été soutenue par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (NSFC ; 82172598), la Fondation des sciences naturelles de la province du Zhejiang, en Chine (LZ22H310001), le projet de formation des talents en santé 551 de la Commission de la santé de la province du Zhejiang, en Chine, le projet de recherche sur le développement agricole et social du Bureau municipal des sciences et de la technologie de Hangzhou (2022ZDSJ0474) et la subvention de recherche interdisciplinaire de Qiantang.

Materials

List of materials used in this article
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Anticorps anti-annexineABclonalA11235Western blot
Kit de dosage BCABeyotimeP0012Dosage de la concentration en protéines
CalnexinGeneTexHL1598Western blot
CD63 anticorpsABclonalA19023Western blot
Tampon de lyse cellulaire pour Western et IPBeyotimeP0013Western
CentrifugeuseBeckmanAllegra X-30RCentrifugeuse cellulaire
CO2ThermoCell culture
Confocal laser scanning fluorescence microscopieNIKONA1 HD25Photo the fluorescence picture
DMEM basic (1x)GIBCOC11995500BTCulture cellulaire
Diffusion dynamique de la lumière (DLS)MalvernZetasizer Nano ZS ZEN3600 Analyse dediamètre
Homogénéisateur de verre électriqueSCIENTZ(Ningbo, Chine)DY89-IIHomogénéisation à basse vitesse
Système FBS appauvri en exosomesBioscienceEXO-FBS-50A-1Culture cellulaire
Homogénéisateur à grande vitesseSCIENTZ(Ningbo, Chine)XHF-DYHomogénéisation à grande vitesse
GrillemagnétiqueTuohe Electromechanical Technology (Shanghai, Chine)NASéparation magnétique
PKH26 Red Fluorescent Cell Linker Kit pour le marquage général de la membrane cellulaireSigma-AldrichPKH26GL-1KTLe kit contient un linker cellulaire PKH26 dans de l’éthanol et du diluant C
Nanoparticules d’oxyde de fer (IONPs) modifiées par la polylysineTechnologieZhongke Leiming (Pékin, Chine)Mag1100-10Culture cellulaire
Potassium chlorureAladdin7447-40-7Traitement hypotonique cellulaire
Cocktail inhibiteur de protéaseBeyotimeP1030Inhibiteur de la protéinase
Citrate de sodiumAladdin7447-40-7Traitement hypotonique cellulaire
Microscopie électronique à transmission (TEM)JEOLJEM-2100plusMorphologie image
UltracentrifugeuseBeckmanOptima XPN-100Centrifugeuse à exosomes
ZetaView Analyseurs de suivi de nanoparticulesParticle MetrixPMX120Analyse de suivi de nanoparticules
buvard

References

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