Article de méthode

Application du graphène monocouche aux grilles de cryo-microscopie électronique pour la détermination de la structure à haute résolution

DOI :

10.3791/66023

⸱

10 novembre 2023

 ,  , 
1Department of Biology, Massachusetts Institute of Technology, 2Program in Computational and Systems Biology, Massachusetts Institute of Technology

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

L’application de couches de support aux grilles de microscopie électronique cryogénique (cryoEM) permet d’augmenter la densité des particules, de limiter les interactions avec l’interface air-eau, de réduire les mouvements induits par les faisceaux et d’améliorer la distribution des orientations des particules. Cet article décrit un protocole robuste pour le revêtement des grilles cryoEM avec une monocouche de graphène afin d’améliorer la préparation des échantillons cryogéniques.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

En microscopie électronique cryogénique (cryoEM), des macromolécules purifiées sont appliquées sur une grille portant une feuille de carbone trouée ; Les molécules sont ensuite tamponnées pour éliminer l’excès de liquide et rapidement congelées dans une couche de glace vitreuse d’environ 20 à 100 nm d’épaisseur, suspendue à travers des trous de feuille d’environ 1 μm de large. L’échantillon obtenu est imagé à l’aide de la microscopie électronique à transmission cryogénique et, après traitement de l’image à l’aide d’un logiciel approprié, des structures de résolution quasi atomique peuvent être déterminées. Malgré l’adoption généralisée de la cryoEM, la préparation des échantillons reste un goulot d’étranglement important dans les flux de travail cryoEM, les utilisateurs rencontrant souvent des problèmes liés au mauvais comportement des échantillons dans la glace vitrée en suspension. Récemment, des méthodes ont été développées pour modifier les grilles cryoEM avec une seule couche continue de graphène, qui agit comme une surface d’appui qui augmente souvent la densité des particules dans la zone d’imagerie et peut réduire les interactions entre les particules et l’interface air-eau. Ici, nous fournissons des protocoles détaillés pour l’application du graphène aux grilles cryoEM et pour évaluer rapidement l’hydrophilie relative des grilles résultantes. De plus, nous décrivons une méthode basée sur EM pour confirmer la présence de graphène en visualisant son diagramme de diffraction caractéristique. Enfin, nous démontrons l’utilité de ces supports de graphène en reconstruisant rapidement une carte de densité d’une résolution de 2,7 Å d’un complexe Cas9 à l’aide d’un échantillon pur à une concentration relativement faible.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La microscopie électronique cryogénique à particule unique (cryoEM) est devenue une méthode largement utilisée pour visualiser les macromolécules biologiques1. Alimentée par les progrès de la détection directe d’électrons 2,3,4, de l’acquisition de données5 et des algorithmes de traitement d’images 6,7,8,9,10, la cryoEM est désormais capable de produire des structures 3D à résolution quasi atomique d’un nombre croissant de macromolécules11. De plus, en tirant parti de la nature monomoléculaire de l’approche, les utilisateurs peuvent déterminer plusieurs structures à partir d’un seul échantillon 12,13,14,15, ce qui souligne la promesse d’utiliser les données générées pour comprendre des ensembles structurels hétérogènes16,17. Malgré ces progrès, des goulots d’étranglement persistent dans la préparation des grilles cryo-échantillonnées.

Pour la caractérisation structurale par cryoEM, les échantillons biologiques doivent être bien dispersés dans une solution aqueuse, puis doivent être surgelés par un processus appelé vitrification18,19. L’objectif est de capturer les particules dans une couche uniformément mince de glace vitrifiée en suspension à travers des trous régulièrement espacés qui sont généralement découpés en une couche de carbone amorphe. Cette feuille de carbone amorphe à motifs est soutenue par une grille TEM portant un maillage de barres de support en cuivre ou en or. Dans les flux de travail standard, les grilles sont rendues hydrophiles à l’aide d’un traitement plasma à décharge luminescente avant l’application de l’échantillon. L’excès de liquide est tamponné avec du papier filtre, ce qui permet à la solution protéique de former un mince film liquide à travers les trous qui peut être facilement vitrifié pendant la congélation en plongée. Les défis les plus courants comprennent la localisation des particules à l’interface air-eau (AWI) et la dénaturation subséquente 20,21,22 ou l’adoption d’orientations préférées 23,24,25, l’adhérence des particules à la feuille de carbone plutôt que de migrer dans les trous, et le regroupement et l’agrégation des particules à l’intérieur des trous 26. L’épaisseur non uniforme de la glace est une autre préoccupation ; La glace épaisse peut entraîner des niveaux plus élevés de bruit de fond dans les micrographies en raison de l’augmentation de la diffusion des électrons, tandis que la glace extrêmement mince peut exclure les particules plus grosses27.

Pour relever ces défis, une variété de films de support minces ont été utilisés pour recouvrir les surfaces de la grille, permettant aux particules de reposer sur ces supports et, idéalement, d’éviter les interactions avec l’interface air-eau. Les supports en graphène se sont révélés très prometteurs, en partie en raison de leur résistance mécanique élevée associée à leur section efficace de diffusion minimale, ce qui réduit le signal de fond ajouté par la couche de support28. En plus de sa contribution minimale au bruit de fond, le graphène présente également une conductivité électrique et thermique remarquable29. Il a été démontré que les grilles recouvertes de graphène et d’oxyde de graphène permettent d’obtenir une densité de particules plus élevée, une distribution plus uniforme des particules30 et une localisation réduite dans l’AWI22. De plus, le graphène fournit une surface d’appui qui peut être modifiée pour : 1) ajuster les propriétés physico-chimiques de la surface de la grille par fonctionnalisation 31,32,33 ; ou 2) coupler des agents de liaison qui facilitent la purification par affinité des protéines d’intérêt 34,35,36.

Dans cet article, nous avons modifié une procédure existante pour recouvrir les grilles cryoEM d’une seule couche uniforme de graphène30. Les modifications visent à minimiser la manipulation du réseau tout au long du protocole, dans le but d’augmenter le rendement et la reproductibilité. De plus, nous discutons de notre approche pour évaluer l’efficacité de divers traitements UV/ozone pour rendre les grilles hydrophiles avant la plongée. Cette étape de la préparation d’échantillons cryoEM à l’aide de grilles recouvertes de graphène est essentielle, et nous avons trouvé utile notre méthode simple pour quantifier l’hydrophilie relative des grilles résultantes. À l’aide de ce protocole, nous démontrons l’utilité d’utiliser des grilles recouvertes de graphène pour la détermination de la structure en générant une reconstruction 3D à haute résolution de S. pyogenes Cas9 catalytiquement inactif en complexe avec l’ARN guide et l’ADN cible.

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Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1. Préparation du graphène CVD

  1. Préparez la solution de gravure au graphène comme décrit ci-dessous.
    1. Dissoudre 4,6 g de persulfate d’ammonium (APS) dans 20 mL d’eau de qualité moléculaire dans un bécher de 50 mL pour obtenir une solution de 1 M et couvrir de papier d’aluminium. Laissez l’APS se dissoudre complètement tout en passant à l’étape 1.2.
  2. Préparez une section de graphène CVD pour le revêtement en méthacrylate de méthyle (MMA). Coupez soigneusement une section carrée de graphène CVD. Transférez le carré sur une lamelle (50 mm x 24 mm) dans une boîte de Pétri propre et couvrez-la pendant le transport vers l’enrobeuse.
    REMARQUE : Un carré de 18 mm x 18 mm devrait donner 25 à 36 grilles recouvertes de graphène.

2. Revêtement du graphène CVD avec du MMA

  1. Réglez les réglages de l’enrobeuse par essorage sur une vitesse d’essorage élevée de 60 s à 2 500 tr/min. Placez délicatement le graphène CVD sur le mandrin de taille appropriée.
    REMARQUE : Idéalement, le graphène CVD s’étendra de 1 à 2 mm sur le bord du mandrin sélectionné pour empêcher l’aspiration de MMA dans le système de vide.
  2. Appuyez sur le bouton Take/Absorb pour engager la pompe à vide et fixez le graphène CVD sur le mandrin. Appliquez le MMA au centre du carré de graphène CVD, fermez le couvercle et appuyez immédiatement sur le bouton Start/Stop . Pour un carré de graphène CVD de 18 mm x 18 mm, 40 μL de MMA suffisent.
  3. Une fois l’essorage arrêté, débrayez la pompe à vide et récupérez soigneusement le graphène CVD revêtu de MMA à l’aide d’une pince à épiler. Retournez le graphène CVD de manière à ce que le côté revêtu de MMA soit orienté vers le bas et replacez-le sur la lamelle de verre.

3. Gravure au plasma de la face arrière du graphène

  1. Transférez le graphène CVD sur la lamelle dans le déchargeur lumineux et déchargez-le pendant 30 s à 25 mA à l’aide d’une pince à épiler à pointe plate.
  2. Remettez le graphène CVD sur la lamelle de Pétri dans la boîte de Pétri et couvrez-la pendant le transport vers la zone de gravure sur cuivre. Le revêtement MMA protégera la couche supérieure de graphène de la gravure au plasma.

4. Découpe de carrés de graphène CVD revêtus de MMA de la taille d’une grille

  1. Utilisez deux paires de pinces à épiler pour soutenir le carré de graphène CVD. Prenez note de l’orientation du carré de graphène CVD, gardez le côté MMA vers le haut lorsqu’il est attaché à la pince à épiler (CRITIQUE).
  2. Coupez le graphène CVD en carrés d’environ 3 mm x 3 mm. Utilisez deux jeux de pinces à action inversée pour cette étape afin de maintenir le carré de graphène CVD à l’endroit et de l’ancrer en position, ainsi que pour maintenir le bord d’un carré de 3 mm x 3 mm après l’avoir coupé du reste du carré.

5. Dissoudre le substrat de cuivre du graphène CVD revêtu de MMA

  1. Faites flotter soigneusement chaque carré de 3 mm x 3 mm dans la solution APS. Entrez en contact avec la surface de la solution APS avant de libérer chaque carré. Inclinez le bécher de manière à ce que chaque carré puisse être placé dans la solution à un angle peu profond ; Cela permet de s’assurer que la place ne s’enfonce pas.
  2. Couvrir le bécher de papier d’aluminium et incuber toute la nuit à 25 °C.

6. Retrait des films MMA/graphène de l’APS

  1. Utilisez une lamelle en verre de dimensions 12 mm x 50 mm et extrayez les carrés MMA/graphène de l’APS en plongeant doucement la lamelle verticalement dans l’APS, puis en déplaçant la lamelle latéralement de manière à ce qu’elle bute un carré flottant MMA/graphène.
  2. Retirez soigneusement la lamelle et assurez-vous que l’équerre adhère complètement au côté de la lamelle lors du retrait.
  3. Transférer les carrés de MMA/graphène dans un bécher propre de 50 ml rempli d’eau de qualité moléculaire pendant 20 minutes. Plongez doucement la lamelle avec un carré MMA/graphène fixé verticalement dans l’eau et assurez-vous que le carré se déloge de la lamelle lors de l’interaction avec la surface de l’eau. Répétez l’opération pour tous les carrés MMA/graphène.

7. Collage du graphène sur les grilles

  1. À l’aide d’une pince à épiler à action négative, plongez doucement une grille verticalement dans l’eau avec le côté carbone face à un carré flottant MMA/graphène. Une fois en contact avec le carré, retirez soigneusement la grille et assurez-vous que la grille adhère complètement au côté carbone de la grille lors du retrait. Minimisez le mouvement latéral de la grille lorsqu’elle est immergée dans l’eau pour éviter d’endommager les carrés de la grille (CRITIQUE).
  2. Placez les grilles sur une lamelle propre, côté MMA/graphène vers le haut, et séchez à l’air libre pendant 1 à 2 min. Transférez les grilles revêtues de graphène/MMA sur une plaque chauffante réglée à 130 °C à l’aide d’une pince à épiler à pointe plate.
  3. Couvrir avec le dessus d’une boîte de Pétri en verre et incuber pendant 20 min. Retirer du feu et laisser refroidir à température ambiante pendant 1 à 2 min.
    ATTENTION : Faites preuve de prudence car le dessus de la boîte de Pétri sera extrêmement chaud.

8. Dissoudre le MMA avec de l’acétone

  1. Transférer la lamelle entière dans une boîte de Pétri remplie de 15 mL d’acétone. Incuber pendant 30 min.
  2. À l’aide d’une pipette sérologique en verre propre, transférez l’acétone, dans laquelle les grilles ont été incubées, dans un conteneur à déchets. Ajouter délicatement 15 mL d’acétone fraîche dans la boîte de Pétri à l’aide d’une pipette sérologique en verre propre. Incuber pendant 30 min.
  3. Répétez ces étapes de lavage pour un total de 3 lavages à l’acétone.

9. Élimination de l’acétone résiduelle avec de l’isopropanol

  1. Après 3 lavages à l’acétone, retirer l’acétone et la remplacer par 15 mL d’isopropanol à l’aide d’une pipette sérologique en verre propre. Incuber pendant 20 min.
  2. Répétez 3 fois pour un total de 4 lavages à l’isopropanol. Retirez délicatement les grilles de l’isopropanol et séchez-les à l’air libre sur une lamelle propre à l’aide d’une pince à épiler.
    REMARQUE : L’isopropanol résiduel peut rendre difficile le détachement des grilles de la pince à épiler. Le contact entre la grille et la lamelle propre avant de libérer la grille de la pince à épiler peut atténuer ce problème.
  3. Évaporez les matières organiques résiduelles en transférant la lamelle avec des grilles recouvertes de graphène sur une plaque chauffante réglée à 100 °C pendant 10 min. Laisser refroidir à température ambiante et conserver sous vide jusqu’à utilisation.

10. Traitement UV/ozone des grilles revêtues de graphène

  1. À l’aide d’une pince à épiler à action inversée, placez délicatement les grilles dans une zone d’éclairage propre d’un nettoyant UV/ozone avec le côté recouvert de graphène vers le haut.
  2. Faites glisser la zone d’éclairage fermée et allumez la machine. Tournez le cadran de l’heure sur le temps de traitement désigné pour commencer le traitement UV/ozone des grilles.
    REMARQUE : La durée du traitement est un paramètre réglable, l’excès de traitement ayant le potentiel d’endommager le réseau. Han et al.30 recommandent 10 min de traitement UV/ozone, et nous avons également trouvé qu’un traitement de 10 min suffisait. Reportez-vous à l’étape 12 pour obtenir des conseils sur le réglage de cette durée de traitement.
  3. Procéder directement à la plongée d’un échantillon cryoEM sur les grilles traitées en suivant les étapes de plongée décrites dans Koh et al.37.
    REMARQUE : Les hydrocarbures atmosphériques peuvent s’accumuler à la surface de la grille après un traitement UV/ozone et augmenter l’hydrophobicité de la surface du graphène38,39. Pour éviter cela, plongez immédiatement les grilles traitées aux UV/ozone. Il peut être avantageux de traiter les grilles par lots, par exemple, en traitant six grilles par UV/ozone et en plongeant immédiatement ces six grilles, puis en traitant les UV/ozone avec un deuxième lot de grilles, suivi de la plongée du deuxième lot.

11. Capture d’une image de diffraction

  1. Assurez-vous que le microscope est bien réglé avec un éclairage parallèle établi et réglez la défocalisation finale à -0,2 μm.
  2. Insérez l’écran fluorescent et le faisceau s’arrête complètement. Passez en mode diffraction pour visualiser clairement les taches de diffraction.
  3. Acquérir une image à l’aide d’une caméra CCD et l’évaluer à l’aide d’un logiciel d’analyse d’images.
    NOTE : Les taches de diffraction les plus facilement observables et identifiables générées par une monocouche de graphène sont 6 taches correspondant à une fréquence spatiale de 2,13 Å. Utilisez un outil de mesure pour estimer la distance entre le centre du faisceau diffracté et l’un de ces points de diffraction en unités réciproques. Notamment 2,13 Å figure-protocol-1 0,47 Å-1.

12. Évaluation de l’hydrophilie du réseau

  1. Préparez la configuration de l’imagerie. Localisez un support de téléphone, une surface d’imagerie de table, un téléphone avec appareil photo, une lamelle en verre et un film de paraffine. Les images présentées ici ont été obtenues à l’aide d’un support de téléphone et d’une surface d’imagerie de table qui ont été imprimées en 3D à l’aide des fichiers .stl fournis, ce qui a permis d’obtenir des mesures d’angle de contact plus facilement reproductibles et quantifiables (figure supplémentaire 1A).
  2. Posez une lamelle de verre sur la surface plane, puis découpez un carré de film de paraffine de 1 cm sur 1 cm et placez-le sur la lamelle de verre. Placez le téléphone sur le support du téléphone, en l’orientant de manière à ce que l’appareil photo soit dans le plan de la lamelle en verre. Fixez le téléphone dans cette position à l’aide d’élastiques (Figure supplémentaire 1B). Prenez un exemple de photo pour vérifier que l’appareil photo est aligné avec la surface d’imagerie.
  3. Directement après le traitement UV/ozone des grilles recouvertes de graphène, placez une seule grille sur le carré de film de paraffine sur la lamelle en verre. Assurez-vous que le côté graphène est orienté vers le haut. Ajoutez une goutte d’eau de 2 μL au centre de la surface de la grille à l’aide d’une pipette et prenez immédiatement une photo.
    REMARQUE : Répétez cette étape après : i) les intervalles souhaités de traitement UV/ozone pour déterminer une durée suffisante de traitement ; ou ii) les intervalles de temps souhaités après le traitement UV/ozone pour mesurer combien de temps après le traitement, la surface du réseau conserve son caractère hydrophile.
  4. Calculez les angles de contact à partir de photos en les important dans ImageJ43 et en utilisant le plug-in d’angle de contact.

13. Analyse d’une seule particule de l’ensemble de données complexes dCas9

REMARQUE : Tous les traitements d’image décrits dans ce protocole ont été effectués à l’aide de cryoSPARC version 4.2.1.

  1. Prétraitez les films à l’aide des tâches de correction de mouvement de patch et d’estimation CTF de patch. Effectuez le prélèvement de particules à l’aide du travail de sélection d’objets blob, à l’aide d’un objet blob sphérique dont le diamètre est compris entre 115 Å et 135 Å.
  2. Extrayez les particules à l’aide de la tâche Extraire à partir de micrographies, à l’aide du coefficient de corrélation normalisé (NCC) et des seuils de puissance, ce qui donne environ 200 à 300 particules par micrographie. Notez que les seuils appropriés et le nombre de particules qui en résulte peuvent varier, et que les utilisateurs doivent inspecter la qualité du prélèvement à l’aide d’une gamme de micrographies pour identifier les conditions appropriées.
  3. Effectuez des reconstructions initiales multiclasses à l’aide de la tâche de reconstruction Ab-initio, nécessitant trois classes. Deux des trois classes contiendront probablement des particules autres que le Cas9, y compris des contaminants de surface. Sélectionnez la classe ressemblant à dCas9 pour un traitement ultérieur.
    REMARQUE : Des cycles supplémentaires de reconstruction Ab-initio multiclasse ou d’affinement hétérogène peuvent être appliqués pour affiner davantage la pile de particules.
  4. Effectuez un affinement 3D à l’aide de la tâche Affinement non uniforme en sélectionnant les paramètres par défaut. Estimez la résolution de la reconstruction à l’aide des tâches de validation (FSC) et de ThreeDFSC, en utilisant les cartes et le masque de l’affinement 3D final.

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Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La fabrication réussie de grilles cryoEM recouvertes de graphène à l’aide de l’équipement (Figure 1) et du protocole (Figure 2) décrits ici se traduira par une monocouche de graphène recouvrant les trous de la feuille qui peut être confirmée par son motif de diffraction caractéristique. Pour favoriser l’adsorption des protéines à la surface du graphène, un traitement UV/ozone peut être utilisé pour rendre la surface hydrophile en installant des groupes fonctionn...

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Discussion

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

La préparation d’échantillons cryoEM implique une multitude de défis techniques, la plupart des flux de travail exigeant des chercheurs qu’ils manipulent manuellement des grilles fragiles avec un soin extrême pour éviter de les endommager. De plus, l’aptitude d’un échantillon à la vitrification est imprévisible ; Les particules interagissent souvent avec l’interface air-eau ou avec la feuille de support solide qui recouvre les grilles, ce qui peut conduire les particules à adopter des orientations préférées ou à ne pas p...

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Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Les auteurs n’ont aucun conflit à divulguer.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Des échantillons ont été préparés et imagés à l’installation CryoEM du MIT.nano sur des microscopes acquis grâce à la Fondation Arnold et Mabel Beckman. Des appareils d’imagerie d’angle de contact ont été imprimés au MIT Metropolis Maker Space. Nous remercions les laboratoires de Nieng Yan et Yimo Han, ainsi que le personnel de MIT.nano pour leur soutien tout au long de l’adoption de cette méthode. Nous remercions tout particulièrement les Drs Guanhui Gao et Sarah Sterling pour leurs discussions et leurs commentaires perspicaces. Ce travail a été soutenu par les subventions R01-GM144542, 5T32-GM007287 des NIH et les subventions NSF-CAREER 2046778. La recherche dans le laboratoire de Davis est soutenue par la Fondation Alfred P. Sloan, le Fonds James H. Ferry, la J-Clinic du MIT et la famille Whitehead.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Bécher de 250 mL (3x)Fisher02-555-25B
Bécher de 50 mL (2x)Corning1000-50
AcétoneFisherA949-4
Feuille d’aluminiumFisher15-078-292
Persulfate d’ammoniumFisher(I17874
Lamelles de recouvrement 50 mm x 24 mmMattekPCS-1.5-5024
CVD graphèneGraphène Supermarché GraphèneCVD-Cu-2x2
easiDéchargeur de luminescenceTed-Pella91000S
EthanolMillipore-Sigma1.11727
Pince à épiler à bout plat  ;Fisher50-239-60
Coupe-verreGrainger21UE26
Plaque de Petri en verre et couvercle  ;VWR75845-544
Pipette sérologique en verreFisher13-676-34D
Grille de rangementEMS71146-02
Plaque chauffanteFisher07-770-108
IsopropanolSigmaW292907
KimwipeFisher06-666
Ciseaux de laboratoire  ;Fisher13-806-2
Méthacrylate de méthyle EL-6  ;KayakuMMA M310006 0500L1GL
Eau de qualité moléculaireCorning46-000-CM
Pince à épiler à action négative (2x)Fisher50-242-78
Pipette P20Rainin17014392
Pipette P200Rainin17008652  ;
ParafilmFisher13-374-12
Pointes de pipetteRainin30389291
Quantifoil grilles avec carbone troué  ;EMSQ2100CR1
Spin coater  ;SetCasKW-4Aavec mandrin SCA-19-23
Règle droiteULINEH-6560
Thermomètre  ;Grainger3LRD1
Nettoyeur UV/Ozone  ;BioForceSKU : PC440
Dessiccateur sous videThomas Scientific1159X11
Papier WhatmanVWR28297-216

Références

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Chua, E. Y. D., et al. cheaper: Recent advances in cryo-electron microscopy. Annu Rev Biochem. 91, 1-32 (2022).
  2. Bai, X. C., Fernandez, I. S., McMullan, G., Scheres, S. H. Ribosome structures to near-atomic resolution from thirty thousand cryo-EM particles. Elife. 2, 00461(2013).
  3. Li, X., et al. Electron counting and beam-induced motion correction enable near-atomic-resolution single-particle cryo-EM. Nat Methods. 10 (6), 584-590 (2013).
  4. Campbell, M. G., et al. Movies of ice-embedded particles enhance resolution in electron cryo-microscopy. Structure. 20 (11), 1823-1828 (2012).
  5. Cheng, A., et al. Leginon: New features and applications. Protein Sci. 30 (1), 136-150 (2021).
  6. Scheres, S. H. RELION: implementation of a Bayesian approach to cryo-EM structure determination. J Struct Biol. 180 (3), 519-530 (2012).
  7. Punjani, A., Rubinstein, J. L., Fleet, D. J., Brubaker, M. A. cryoSPARC: algorithms for rapid unsupervised cryo-EM structure determination. Nat Methods. 14 (3), 290-296 (2017).
  8. Tegunov, D., Cramer, P. Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp. Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).
  9. Grant, T., Rohou, A., Grigorieff, N. cisTEM, user-friendly software for single-particle image processing. Elife. 7, 35383(2018).
  10. Bell, J. M., Chen, M., Baldwin, P. R., Ludtke, S. J. High resolution single particle refinement in EMAN2.1. Methods. 100, 25-34 (2016).
  11. Cheng, Y. Single-particle cryo-EM-How did it get here and where will it go. Science. 361 (6405), 876-880 (2018).
  12. Kinman, L. F., Powell, B., Zhong, E., Berger, B., Davis, J. H. Uncovering structural ensembles from single particle cryo-EM data using cryoDRGN. Nat Protoc. 18 (2), 319-339 (2022).
  13. Zhong, E. D., Bepler, T., Berger, B., Davis, J. H. CryoDRGN: reconstruction of heterogeneous cryo-EM structures using neural networks. Nat Methods. 18 (2), 176-185 (2021).
  14. Chen, M., Ludtke, S. J. Deep learning-based mixed-dimensional Gaussian mixture model for characterizing variability in cryo-EM. Nat Methods. 18 (8), 930-936 (2021).
  15. Punjani, A., Fleet, D. J. 3D variability analysis: Resolving continuous flexibility and discrete heterogeneity from single particle cryo-EM. J Struct Biol. 213 (2), 107702(2021).
  16. Dashti, A., et al. Retrieving functional pathways of biomolecules from single-particle snapshots. Nat Commun. 11 (1), 4734(2020).
  17. Sun, J., Kinman, L. F., Jahagirdar, D., Ortega, J., Davis, J. H. KsgA facilitates ribosomal small subunit maturation by proofreading a key structural lesion. Nat Struct Mol Biol. , (2023).
  18. Dubochet, J., Chang, J. J., Freeman, R., Lepault, J., McDowall, A. W. Frozen aqueous suspensions. Ultramicroscopy. 10 (1-2), 55-61 (1982).
  19. Dubochet, J. Cryo-EM--the first thirty years. J Microsc. 245 (3), 221-224 (2012).
  20. Glaeser, R. M., et al. Factors that influence the formation and stability of thin, cryo-EM specimens. Biophys J. 110 (4), 749-755 (2016).
  21. Glaeser, R. M. Proteins, interfaces, and cryo-Em grids. Curr Opin Colloid Interface Sci. 34, 1-8 (2018).
  22. D'Imprima, E., et al. Protein denaturation at the air-water interface and how to prevent it. Elife. 8, 42747(2019).
  23. Tan, Y. Z., et al. Addressing preferred specimen orientation in single-particle cryo-EM through tilting. Nat Methods. 14 (8), 793-796 (2017).
  24. Chen, J., Noble, A. J., Kang, J. Y., Darst, S. A. Eliminating effects of particle adsorption to the air/water interface in single-particle cryo-electron microscopy: Bacterial RNA polymerase and CHAPSO. J Struct Biol X. 1, 100005(2019).
  25. Noble, A. J., et al. Reducing effects of particle adsorption to the air-water interface in cryo-EM. Nat Methods. 15 (10), 793-795 (2018).
  26. Drulyte, I., et al. Approaches to altering particle distributions in cryo-electron microscopy sample preparation. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 560-571 (2018).
  27. Neselu, K., et al. Measuring the effects of ice thickness on resolution in single particle cryo-EM. J Struct Biol X. 7, 100085(2023).
  28. Pantelic, R. S., et al. Graphene: Substrate preparation and introduction. J Struct Biol. 174 (1), 234-238 (2011).
  29. Geim, A. K., Novoselov, K. S. The rise of graphene. Nat Mater. 6 (3), 183-191 (2007).
  30. Han, Y., et al. High-yield monolayer graphene grids for near-atomic resolution cryoelectron microscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (2), 1009-1014 (2020).
  31. Fujita, J., et al. Epoxidized graphene grid for highly efficient high-resolution cryoEM structural analysis. Sci Rep. 13 (1), 2279(2023).
  32. Lu, Y., et al. Functionalized graphene grids with various charges for single-particle cryo-EM. Nat Commun. 13 (1), 6718(2022).
  33. Naydenova, K., Peet, M. J., Russo, C. J. Multifunctional graphene supports for electron cryomicroscopy. Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (24), 11718-11724 (2019).
  34. Liu, N., et al. Bioactive functionalized monolayer graphene for high-resolution cryo-electron microscopy. J Am Chem Soc. 141 (9), 4016-4025 (2019).
  35. Benjamin, C. J., et al. Selective capture of histidine-tagged proteins from cell lysates using TEM grids modified with NTA-graphene oxide. Sci Rep. 6, 32500(2016).
  36. Wang, F., et al. General and robust covalently linked graphene oxide affinity grids for high-resolution cryo-EM. Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (39), 24269-24273 (2020).
  37. Koh, A., et al. Routine Collection of High-Resolution cryo-EM Datasets Using 200 KV Transmission Electron Microscope. J Vis Exp. (181), (2022).
  38. Schweizer, P., et al. Mechanical cleaning of graphene using in situ electron microscopy. Nat Commun. 11 (1), 1743(2020).
  39. Li, Z., et al. Effect of airborne contaminants on the wettability of supported graphene and graphite. Nat Mater. 12 (10), 925-931 (2013).
  40. Jinek, M., et al. A programmable dual-RNA-guided DNA endonuclease in adaptive bacterial immunity. Science. 337 (6096), 816-821 (2012).
  41. Zhu, X., et al. Cryo-EM structures reveal coordinated domain motions that govern DNA cleavage by Cas9. Nat Struct Mol Biol. 26 (8), 679-685 (2019).
  42. Croll, T. I. ISOLDE: a physically realistic environment for model building into low-resolution electron-density maps. Acta Crystallogr D Struct Biol. 74, 519-530 (2018).
  43. Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of image analysis. Nat Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
  44. Prydatko, A. V., Belyaeva, L. A., Jiang, L., Lima, L. M. C., Schneider, G. F. Contact angle measurement of free-standing square-millimeter single-layer graphene. Nat Commun. 9 (1), 4185(2018).

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