Évaluation microbiologique rapide sur site des maladies infectieuses pulmonaires

Résumé

Le protocole ici présente un flux de travail rapide et standardisé d’évaluation microbiologique rapide sur site (M-ROSE), comprenant trois étapes : la fabrication des lames, la coloration et l’interprétation. Ce protocole aidera les médecins à prendre des décisions cliniques rapides.

Résumé

L’instauration rapide d’un traitement anti-infectieux empirique est cruciale chez les patients présentant une infection pulmonaire inexpliquée. Bien que l’acquisition d’imagerie soit relativement simple dans la pratique clinique, son manque de spécificité nécessite souvent des tests supplémentaires chronophages tels que la culture d’expectorations, la culture de liquide de lavage broncho-alvéolaire ou le séquençage génétique pour identifier avec précision l’étiologie sous-jacente de la maladie. De plus, l’efficacité limitée d’un traitement anti-infectieux empirique peut contribuer à l’utilisation abusive d’antibiotiques. Les progrès récents dans l’interprétation du fond microbien sur les lames d’évaluation rapide sur site (ROSE) ont permis aux cliniciens d’obtenir rapidement des échantillons par bronchoscopie (par exemple, lavage alvéolaire, brossage de la muqueuse, pince tissulaire), facilitant la coloration au chevet du patient et l’interprétation qui fournit des informations essentielles sur le fond microbien. Par conséquent, cela constitue une base pour l’élaboration d’un traitement anti-infectieux ciblé et de plans de traitement médicamenteux individualisés. Grâce à une meilleure compréhension en temps réel des agents pathogènes à l’origine des infections, les médecins peuvent éviter les antibiotiques à large spectre inutiles qui contribuent à la résistance aux antibiotiques. La mise en place d’un flux de travail M-ROSE rapide et standardisé au sein des services de médecine respiratoire ou des unités de soins intensifs aidera grandement les médecins à formuler des stratégies de traitement précises pour les patients, ce qui a des implications cliniques importantes.

Introduction

La technique d’évaluation rapide sur site (ROSE) est une méthode très efficace utilisée dans le domaine des procédures de maladies pulmonaires. Il permet un prélèvement en temps réel et une intervention diagnostique, facilitant ainsi une analyse cytologique immédiate¹. Cette approche innovante consiste à imprimer une partie de l’échantillon de tissu sur une lame tout en préservant son intégrité. L’un des principaux avantages de ROSE réside dans sa capacité à faciliter l’interprétation rapide des informations cliniques grâce à des techniques de microscopie spécialisées. Cela comprend l’analyse de la morphologie cellulaire, la classification, la quantification, la détermination des rapports de constituants, l’évaluation de l’arrangement, l’analyse de corrélation, l’évaluation du bruit de fond et l’identification des corps étrangers. En intégrant toutes ces données aux informations cliniques du patient, ROSE joue un rôle central dans l’évaluation de l’adéquation de l’échantillonnage et l’orientation des procédures et techniques d’intervention en temps réel².

En tant que filiale de ROSE technology, la technologie M-ROSE se concentre principalement sur l’acquisition du fond microbiologique des lésions cibles plutôt que sur la distinction entre les cellules bénignes et malignes ^3,4. D’une part, M-ROSE permet l’identification microscopique d’agents pathogènes tels que Aspergillus, Cryptococcus, Pneumocystis et Candida⁵. D’autre part, il a des implications importantes pour évaluer la qualité des échantillons respiratoires, distinguer les maladies infectieuses des maladies non infectieuses, distinguer l’infection de la contamination, ainsi que l’évaluation de la gravité et du pronostic de l’infection ^6,7. Par exemple, au sein d’un échantillon respiratoire, la coexistence de bactéries présentant une morphologie identique avec des cellules inflammatoires infiltrantes indique une infection ; À l’inverse, la présence de plusieurs bactéries morphologiquement diverses accompagnées de cellules épithéliales suggère une contamination. La capacité d’analyser de manière exhaustive les informations cliniques et de prédire les résultats fait de M-ROSE un outil inestimable dans les procédures de maladies pulmonaires.

En conclusion, ROSE sert de vecteur cytologique crucial qui améliore considérablement l’efficacité et la précision du diagnostic des maladies pulmonaires. Ses capacités multidimensionnelles contribuent à améliorer les résultats pour les patients en assurant une intervention rapide et en facilitant un diagnostic précis grâce à des techniques d’échantillonnage et d’intervention diagnostique en temps réel. Cependant, il est important de noter que ces avancées reposent sur l’obtention d’échantillons qualifiés. Nous présentons ici un protocole M-ROSE standardisé englobant la préparation des lames, les techniques de coloration et les directives d’interprétation. Ce protocole sert de référence inestimable aux cliniciens pour établir des plans d’évaluation et de traitement précis tout en facilitant la prise de décision concernant la manipulation ultérieure des échantillons cibles.

Protocole

L’essai clinique a été approuvé par le Comité d’approbation de l’Hôpital de médecine traditionnelle chinoise de Chongqing (n° 2022-KY-31). Le cas typique impliquait un patient diagnostiqué avec une pneumonie à Pneumocystis, et le consentement éclairé a été obtenu du patient.

1. Exigences en matière d’équipement et de matériel pour ROSE

1. Équipement : Reportez-vous au fichier de la Table des matériaux pour connaître l’équipement utilisé dans ce protocole.
   REMARQUE : L’utilisation d’un microscope cytologique et d’un système d’imagerie graphique dédiés est impérative (Figure 1A).
2. Préparation des matériaux (voir tableau des matériaux).
   1. Préparez des lames de culture cellulaire stériles (avec une forte adhérence cellulaire), du papier absorbant, des gants en latex non poudrés, des aiguilles de seringue jetables de 2,5 à 5 ml et placez l’ensemble complet des solutions de coloration Diff Quik (DQ) dans des bocaux en verre avec des couvercles scellés pour une manipulation facile (Figure 1).

2. Flux de travail M-ROSE

1. Préparation de lames cytologiques
   REMARQUE : Il existe de nombreuses façons de préparer des diapositives, et voici plusieurs méthodes de préparation couramment utilisées.
   1. Toboggans roulants
      REMARQUE : Assurez-vous d’une perte minimale d’échantillon de tissu pendant ce processus.
      1. Extraire les particules de tissu à l’aide d’une aiguille de seringue jetable d’une capacité de 2,5 à 5 ml (figure 2A).
      2. Étalez une zone circulaire, d’environ 1 cm de diamètre et d’épaisseur modérée, de l’intérieur vers l’extérieur d’un tiers de l’extrémité colorée (l’extrémité présentant une forte attache cellulaire) sur la lame de cytologie stérile.
   2. Lames de brosse
      REMARQUE : Cette méthode s’applique aux échantillons obtenus à l’aide de brosses cellulaires conventionnelles, de brosses cellulaires antipollution ou de brosses cellulaires ultrafines, ainsi qu’aux échantillons semi-liquides tels que les expectorations et les fluides corporels visqueux.
      1. Étendez la tête de brosse et appliquez-la sur le tiers distal de la lame de verre cytologique stérile (la lame a de fortes propriétés d’adhérence cellulaire) pour obtenir une zone rectangulaire d’environ 2 cm x 1 cm avec une épaisseur modérée.
   3. Lames de pulvérisation
      1. Positionnez l’aiguille de ponction à un tiers de l’extrémité colorée d’une lame de cytologie stérile avec une adhérence cellulaire robuste.
      2. Appliquez une pression d’air sur la pointe de l’aiguille de piercing et insérez-la de l’intérieur vers l’extérieur, formant une zone circulaire d’épaisseur moyenne mesurant environ 1 cm de diamètre.
2. Coloration des lames cytologiques
   REMARQUE : L’Organisation mondiale de la santé (OMS) recommande une coloration rapide de la lame cytologique ROSE à l’aide du colorant⁵ de Diff. Le colorant Diff peut être réutilisé mais pas répété plusieurs fois. S’il y a des sédiments, ils doivent être filtrés après utilisation. Une teinture trop profonde peut être correctement décolorée par du méthanol ou de l’alcool, de préférence ne plus être teinte. Si la teinture est trop profonde ou trop peu profonde, le temps de teinture ou la concentration de liquide de travail doit être ajusté ; la valeur du pH a une certaine influence sur la teinture, et la lame doit être propre et exempte de pollution acide et alcaline. Les solutions de diff A et de diff B sont volatiles et doivent être scellées et stockées après utilisation.
   1. Immergez la lame dans la solution de Diff A pendant 10 à 30 s (Figure 2B), puis rincez-la dans le bain de colorant PBS pour éliminer l’excès de solution de Diff A et secouez doucement tout tampon restant (Figure 2C).
   2. Ensuite, immergez la lame dans la solution de différentiel B pendant 20 à 40 s (Figure 2E).
   3. Enfin, nettoyez la lame dans le réservoir de teinture à l’eau (Figure 2F), épongez et essuyez le liquide résiduel de la lame avec du papier absorbant (Figure 2D) et terminez la teinture.
      REMARQUE : M-ROSE permet de visualiser directement les micro-organismes pathogènes et facilite l’évaluation de la qualité des échantillons respiratoires, ce qui permet de distinguer l’infection de la non-infection ainsi que l’infection et la contamination, ce qui a une importance déterminante pour l’évaluation de la gravité et du pronostic de l’infection. La section de discussion couvrira cet aspect car il n’implique aucune procédure expérimentale.

Résultats

Dans un cas typique, un homme de 63 ans s’est présenté à l’hôpital avec une toux, de la fièvre et des douleurs thoraciques. Le patient avait déjà été diagnostiqué avec un syndrome néphrotique, caractérisé par une protéinurie et un œdème, et a reçu un traitement à base de prednisone et de tacrolimus pendant une longue période. Les premiers résultats de laboratoire ont révélé une numération des globules blancs de 10,49 x 10⁹/L, une numération des neutrophiles de 8,87 x 10⁹/L, des concentrations de protéine C-réactive dans le sang total et de (1-3)-β-D-glucane de 155,81 mg/L et de 249,7 pg/mL. La tomodensitométrie thoracique (TDM) a montré une opacification du verre dépoli avec une localisation diffuse, bilatérale et centrale (figure 3A). Le traitement anti-infectieux initial à base de céfoperazone tazobactam a été inefficace et ses symptômes ont été aggravés par une fatigue cardiaque, un essoufflement et une dyspnée après l’exercice ; des tomodensitométries répétées n’ont montré aucune amélioration significative (Figure 3B). Ensuite, le patient a été transféré à l’unité de soins intensifs (USI) pour une ventilation mécanique et a subi une bronchoscopie. L’échantillonnage de foyer a été consulté à l’aide de la navigation virtuelle, et trois échantillons de biopsie par forceps ont été prélevés (figure 4). L’étude ROSE était disponible pour une évaluation microscopique immédiate du tissu, et le diagnostic de Pneumocystis jiroveci a été confirmé (figure 5A). Le patient a immédiatement reçu un traitement antifongique à base de sulfaméthoxazole (1,92 g, q6h) ; une coloration ultérieure (figure 5B-E) a confirmé ce diagnostic. Cependant, des tomodensitométries répétées n’ont toujours pas montré d’amélioration significative (Figure 3C). Le patient a reçu de la carbofongine (le premier jour de 70 mg et suivi de 50 mg par jour), de la méthylprednisolone (80 mg par jour) et de l’immunoglobuline (10 g par jour) pour une infection fongique. Les symptômes ont été rapidement soulagés et le patient a poursuivi le traitement de suivi.

Figure 1 : Équipement et matériaux. (A) Microscope cytologique et système d’imagerie graphique. (B) Solution de coloration Diff Quik (DQ) A. (C) Solution de coloration Diff Quik (DQ) B. (D) Gants en latex non poudrés. (E) Lames de culture cellulaire stériles. (F) Aiguilles de seringue jetables de 2,5 à 5 ml. (G) Papier absorbant. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Flux de travail M-ROSE. (A) Impression de la diapositive. (B) Immergez la lame dans la solution de Diff A pendant 10 à 30 s. (C) Rincez la lame dans le bain de colorant PBS pour éliminer l’excès de solution de Diff A. (D) Épongez et essuyez le liquide résiduel de la lame avec du papier absorbant. (E) Immerger la lame dans la solution de différentiel B pendant 20 à 40 s. (F) Nettoyer la lame dans le réservoir de teinture à l’eau. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images de la tomodensitométrie thoracique. (A) À l’admission. (B) Le jour du transfert à l’unité de soins intensifs. (C) Après le traitement du sulfaméthoxazole Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Localisation du segment basal postérieur du lobe inférieur du poumon droit par VBN. (A) Bronche principale droite. (B) Bronche moyenne droite. (C) Segment basal postérieur de la bronche du lobe inférieur du poumon droit. (D) Carte 3D de VBN. (E) Carte coronale de la TDM thoracique. (F) Carte axiale de la TDM thoracique. (G) Carte sagittale de la TDM thoracique Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 5 : Images documentant l’apparition de pneumocystis dans diverses méthodes de coloration. (A) ROSE 100 x 10 ; Flèche blanche : kystes contenant des ascospores. (B) Hématoxyline et éosine (H-E), 60 x 10. (C) Bleu Alcien, 60 x 10. (D) GIEMSA, 40 x 10. (E) Argent Hexamine, 20 x 10. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La pneumologie interventionnelle est une branche précieuse des maladies respiratoires modernes ; En particulier, il a été largement utilisé dans le diagnostic des maladies pulmonaires ^8,9. Ces dernières années, la pneumologie interventionnelle diagnostique a prospéré en raison de la prévalence accrue des tumeurs malignes pulmonaires, de l’augmentation du nombre d’infections pathogènes résistantes aux médicaments dans les voies respiratoires inférieures et des demandes exigeantes de diagnostic de maladies respiratoires déconcertantes et critiques 10,11,12. L’efficacité du diagnostic interventionnel dépend de facteurs tels que la taille et l’emplacement anatomique des zones focales, les taux de complications et le nombre de sites de biopsie, ainsi que les maladies sous-jacentes, ce qui favorise l’utilisation clinique de nombreuses technologies et installations de pointe¹³. ROSE a fait l’objet d’une attention remarquable et s’est rapidement imposée comme une « technique d’accompagnement en temps réel » pour le diagnostic en pneumologie interventionnelle.

ROSE est conçu pour l’évaluation rapide, le diagnostic préliminaire et la hiérarchisation de la satisfaction de l’échantillon lors de procédures telles que la ponction, la biopsie et le brossage. Il fournit un retour d’information pour guider les avancées technologiques ultérieures 14,15,16,17. M-ROSE, une branche de ROSE, se concentre principalement sur l’évaluation du fond microbien plutôt que sur l’évaluation de la malignité des cellules tissulaires⁵. La méthode M-ROSE est une technique d’évaluation rapide plutôt qu’un outil de diagnostic, de sorte que son efficacité diagnostique ne doit pas être exagérée. Son application clinique englobe principalement les aspects suivants : identification visuelle de certains micro-organismes pathogènes, différenciation entre infection et contamination, discrimination entre infection et non-infection⁷.

Après une coloration rapide, le noyau cellulaire du tissu présentait une teinte rouge violacé, tandis que le cytoplasme présentait une couleur bleu-violet. Les bactéries et les champignons apparaissaient bleus, ce qui entraînait un contraste distinct entre les cellules tissulaires et les agents pathogènes⁷. M-ROSE pourrait démontrer un certain niveau de capacité à identifier les bactéries et les champignons. Plus précisément, il présente un taux élevé de positivité pour Aspergillus, cryptococcus, Pneumocystis jiroveci et d’autres champignons ^3,18. Cependant, il a des limites lorsqu’il s’agit de reconnaître des agents pathogènes de petit volume et de petit diamètre ou des agents pathogènes intracellulaires. Il est crucial de souligner que le diagnostic de toute maladie doit être fondé sur une évaluation complète englobant l’état fondamental du patient, les manifestations cliniques, les examens d’imagerie et d’autres facteurs plutôt que de s’appuyer uniquement sur l’identification microscopique des micro-organismes pathogènes.

M-ROSE offre également des avantages dans l’identification de l’infection et de la contamination, tels que l’évaluation de la qualité des échantillons de liquide de lavage alvéolaire. Dans les services où les conditions le permettent, l’évaluation du liquide de lavage au chevet du patient peut être effectuée par centrifugation et coloration. Des échantillons qualifiés de liquide de lavage alvéolaire montrent que la proportion de cellules squameuses parmi toutes les cellules (à l’exclusion des globules rouges) sous microscopie de faible puissance est inférieure à 1 %, les cellules épithéliales cylindriques sont inférieures à 5 % et les globules rouges sont inférieures à 10 % (à l’exclusion des facteurs liés au traumatisme ou à l’hémorragie⁾¹⁹. L’examen microscopique du fond cytologique nous aidera à faire des évaluations en temps opportun.

De plus, M-ROSE peut aider à distinguer les lésions infectées et non infectées⁵. Dans les lésions infectées, il y a souvent une infiltration de neutrophiles, de macrophages et de lymphocytes par des cellules inflammatoires, avec une observation occasionnelle de la phagocytose des neutrophiles. À l’inverse, les lésions non infectées manquent généralement d’infiltration de cellules inflammatoires.

Le protocole présenté ici illustre le processus de fonctionnement de M-ROSE ; Grâce à l’interprétation du contexte microbiologique, le diagnostic préliminaire peut être établi ou le diagnostic différentiel peut être restreint. Comme le suggèrent nos résultats, le diagnostic de PCP nécessite des preuves confirmées de Pneumocystis jiroveci, qui ne doivent pas être basées sur les manifestations cliniques et l’imagerie, même chez les patients symptomatiques à haut risque. L’identification microscopique de l’asque et des formes trophiques est la preuve la plus intuitive. L’efficacité diagnostique est largement déterminée par la méthode de coloration de l’échantillon. Historiquement, les colorants conventionnels tels que le Wright’s-Giemsa, l’hexaamine argent et le bleu de toluidine sont disponibles pour le PCP, mais prennent du temps et ont une sensibilité plus faible. Dans ce cas, le diagnostic immédiat de PPC a été confirmé le premier jour du transfert du patient à l’unité de soins intensifs avec l’utilisation de ROSE. Diff-quick a montré son avantage dans l’identification de pneumocystis, caractérisé par une structure claire, un contraste net et une identification facile de l’asque (Figure 5A).

Dans l’application de la médecine ethnique, ROSE a également une valeur significative. Par exemple, dans les maladies suppuratives, les cliniciens peuvent identifier un large éventail de cellules inflammatoires principalement dominées par les neutrophiles dans le contexte microbiologique⁵. Par conséquent, des médicaments aux propriétés détoxifiantes et détoxifiantes peuvent être sélectionnés comme traitements potentiels pour ces affections, tels que le chèvrefeuille, le pissenlit et le patrinia, entre autres.

Étant donné que ROSE est un programme supplémentaire qui n’a pas besoin d’être sélectionné en pneumologie interventionnelle, la réalisation de ROSE ne peut qu’augmenter les coûts de main-d’œuvre et les coûts économiques. On peut se demander si ROSE doit être utilisé régulièrement. En termes d’avantages économiques, le temps et les coûts de main-d’œuvre sont ce qui nous préoccupe. Le principal besoin de main-d’œuvre supplémentaire est l’évaluateur. L’évaluation ROSE peut être effectuée par un cytotechnologue, un pathologiste ou un clinicien. Les cytotechnologues sont le personnel le plus susceptible d’être affecté à la procédure ROSE. Cependant, dans la pratique clinique, ce sont les cliniciens qui remplacent ce rôle, mais cela peut nécessiter une certaine formation¹⁵. Une étude antérieure a montré qu’un programme de formation pourrait aider à améliorer la précision de l’évaluation de l’adéquation effectuée par les cliniciens et à éliminer les variables confondantes²⁰. De plus, M-ROSE, en tant que technique de diagnostic morphologique, comporte des facteurs subjectifs dans son rapport de résultats. Les cliniciens doivent faire une évaluation complète basée sur des informations cliniques supplémentaires.

Nous recommandons aux hôpitaux disposant d’installations appropriées et de professionnels formés d’envisager de mettre en œuvre la procédure ROSE dans leurs services respiratoires ou leurs unités de soins intensifs, car elle peut faciliter l’évaluation précoce des maladies respiratoires critiques difficiles et guider efficacement le traitement clinique.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Microscope cytologique	Olympus Corporation	CX43
Diff Quik (DQ) solutions de coloration	Besso Biotechnology Co. LTD	G1541
Aiguilles à seringue jetables de 2,5 à 5 mL	Shandong Zhu Pharmaceutical Group	20183150304
Gants en latex non poudrés	Henan Yadu Industrial Co., LTD	20182140728
Cellule stérile diapositives de culture	Jinan Preret industrie et commerce Co., LTD	7101