Utilisation du clivage sous cibles et du test de marquage (CUT & Tag) dans la recherche sur le myoblaste chez la souris

Résumé

Les chercheurs novices dans le domaine de l’épigénétique trouveront que CUT&Tag est une alternative beaucoup plus facile aux tests ChIP. CUT&Tag a énormément bénéficié aux études épigénétiques sur des populations de cellules rares et primaires, générant des données de haute qualité à partir de très peu de cellules. Ce protocole décrit la réalisation de dosages H3K4me1 CUT&Tag sur des myoblastes de souris isolés des muscles des membres postérieurs de souris.

Résumé

Ce document de protocole vise à fournir aux nouveaux chercheurs tous les détails de l’utilisation de Cleavage Under Targets and Tagmentation (CUT & Tagmentation) pour profiler les emplacements génomiques des facteurs de liaison à la chromatine, des marques d’histones et des variantes d’histones. Les protocoles CUT&Tag fonctionnent très bien avec les myoblastes de souris et les cellules souches musculaires fraîchement isolées (MuSCs). Ils peuvent facilement être appliqués à de nombreux autres types de cellules tant que les cellules peuvent être immobilisées par des billes de Concanavalin-A. Par rapport à CUT&Tag, les tests d’immunoprécipitation de la chromatine (ChIP) sont des expériences qui prennent beaucoup de temps. Les dosages ChIP nécessitent un prétraitement de la chromatine avant que le matériau chromatique puisse être utilisé pour l’immunoprécipitation. Dans la ChIP réticulée (X-ChIP), le prétraitement de la chromatine implique la réticulation et la sonication pour fragmenter la chromatine. Dans le cas de la ChIP native (N-ChIP), les chromatines fragmentées sont normalement obtenues par la digestion des nucléases micrococciques (MNase). La sonication et la digestion MNase introduisent toutes deux un certain biais dans les expériences ChIP. Les tests CUT&Tag peuvent être réalisés en moins d’étapes et nécessitent beaucoup moins de cellules que les ChIP, mais fournissent des informations plus impartiales sur les facteurs de transcription ou les marques d’histones à divers endroits génomiques. CUT&Tag peut fonctionner avec seulement 5 000 cellules. En raison de sa sensibilité plus élevée et de son signal de fond plus faible que les ChIP, les chercheurs peuvent s’attendre à obtenir des données de pointe fiables à partir de seulement quelques millions de lectures après le séquençage.

Introduction

Le test CUT&Tag a été inventé pour compenser certains défauts manifestes des ChIPs¹. Les deux principaux inconvénients des ChIPs sont 1) le biais introduit lors de la fragmentation de la chromatine et 2) l’incompétence à travailler avec un faible nombre de cellules. Les dosages X-ChIP reposent sur la sonication ou la digestion MNase pour obtenir des fragments de chromatine, tandis que la N-ChIP utilise principalement la digestion MNase pour obtenir des nucléosomes. La sonication montre un biais vers les emplacements de la chromatine détendus tels que les régions promotrinales², et apparemment, la digestion de la MNase fonctionne également plus efficacement sur les fibres de chromatine détendues. De plus, certains ont rapporté que la digestion de la MNase présente également un biais dépendant de la séquence d’ADN³. Par conséquent, à l’étape de préparation des tests ChIP, il est impossible d’obtenir des fragments de chromatine de toutes sortes d’emplacements génomiques de manière parfaitement aléatoire. De plus, les tests ChIP génèrent normalement des signaux de fond plus élevés que CUT&Tag et nécessitent plus de 10 fois plus de lectures que CUT&Tag pour accentuer là où les pics sont^{de 1,4,5}. C’est pourquoi les expériences ChIP doivent commencer avec beaucoup plus de cellules que CUT&Tag. Ce n’est pas un problème lors de l’étude des lignées cellulaires car elles peuvent être passées de manière répétitive pour obtenir un nombre de cellules très élevé. Cependant, le test ChIP n’est certainement pas un outil épigénétique puissant pour étudier des populations de cellules primaires rares ou précieuses, bien que les cellules primaires aient évidemment des implications plus pratiques et médicales.

Bien que la procédure longue et compliquée de la ChIP décourage certains chercheurs d’apprendre ou d’utiliser cette technique, les gens sont plus à l’aise avec des tests plus faciles tels que l’immunocytochimie (ICC) ou l’immunofluorescence (IF). Un test CUT&Tag ressemble essentiellement au processus des expériences ICC et IF, mais n’a lieu que dans un tube à essai. CUT&Tag n’a pas besoin de chromatine fragmentée pour commencer, mais le génome doit être intact pour la liaison de l’anticorps¹. Le premier jour d’une expérience ChIP, les chercheurs passent normalement jusqu’à 4 heures à préparer les chromatines fragmentées des noyaux par sonication ou digestion MNase avant que les courts morceaux de chromatine puissent être mélangés avec des billes d’anticorps ^4,5. À l’opposé, la charge de travail du premier jour d’une procédure CUT&Tag consiste simplement à immobiliser les cellules dans des billes de Concanavalin-A, puis à ajouter l’anticorps primaire sur les billes cellulaires. Cela ne nécessite que ~40 min¹.

Il convient de mentionner que le clivage sous les cibles et la libération à l’aide de nucléases (CUT & RUN) est une alternative importante à CUT&Tag. CUT&RUN a été créé sur la base d’un mécanisme de fonctionnement similaire à celui de CUT&Tag. Dans CUT&Tag, les anticorps guident la transposase pA/G-Tn5 vers tous les endroits où l’enzyme va chacun découper un morceau de chromatine et le marquer pendant ce temps avec des adaptateurs créant une bibliothèque, tandis que dans CUT&RUN, le rôle de pA/G-Tn5 est joué par la pA/G-MNase qui n’effectue que la partie coupante du travail⁶. Par conséquent, par rapport à CUT&Tag, CUT&RUN nécessite une étape supplémentaire qui consiste à coller les adaptateurs de création de bibliothèque sur les morceaux d’ADN fragmentés pA/G-MNase ^7,8. En raison des grandes similitudes entre CUT&Tag et CUT&RUN, les chercheurs familiers avec CUT&TAG s’adapteront facilement à la réalisation compétente de CUT&RUN. Cependant, il convient de noter qu’il existe quelques différences mineures entre CUT&Tag et CUT&RUN. Les protocoles CUT&RUN utilisent normalement la concentration physique de sel (~150 mM) dans les étapes de lavage, tandis que dans CUT&Tag, le tampon de lavage 300-Dig est riche en sel. Par conséquent, CUT&Tag est efficace pour contrôler le bruit de fond lors du profilage des marques/variantes d’histones ou des facteurs de transcription, car ces protéines se lient directement et fortement à l’ADN¹. CUT&Tag peut rencontrer des problèmes lors du profilage des facteurs associés à la chromatine qui ne se lient pas directement à l’ADN et montrent une faible affinité avec la chromatine. Les étapes élevées de lavage au sel dans CUT&Tag peuvent éliminer les facteurs associés à la chromatine et ne provoquer aucun signal dans la sortie finale. Bien qu’il existe des cas réussis où CUT&Tag peut être utilisé pour profiler certaines protéines non histones/non-facteurs de transcription⁹, nous recommandons toujours CUT&RUN plutôt que CUT&Tag pour profiler les protéines associées à la chromatine faiblement liées.

Une fois que les mammifères ont atteint l’âge adulte, leurs tissus musculaires squelettiques contiennent encore des cellules souches musculaires. Lors d’une lésion musculaire, ces cellules souches peuvent être activées et subir une expansion et une différenciation du nombre de cellules pour régénérer les fibres musculaires endommagées¹⁰. Ces cellules souches sont connues sous le nom de cellules souches/satellites musculaires (MuSC). Une fois que les MuSC sont isolés chez les animaux ou une fois activés par une blessure musculaire, ils commencent à proliférer et deviennent des myoblastes.

Pour obtenir des MuSC à partir de la digestion des muscles squelettiques de souris, les marqueurs de surface MuSC tels que Vcam1 (Cd106), Cd34 et l’intégrine α7 (Itga7) sont souvent utilisés individuellement ou en combinaison pour enrichir les MuSC lors du tri cellulaire activé par fluorescence (FACS)¹¹. Il a été démontré que Cd31^-/Cd45^-/^Sca1-/Vcam1⁺ est probablement la meilleure combinaison de marqueurs pour obtenir des MuSCs¹² purs à >95%. Le FACS peut isoler les MuSC purs juste après la digestion des muscles frais. Cependant, si la conception expérimentale ne nécessite pas de MuSC purs dès leur isolement, le pré-placage est plus rentable que le FACS pour obtenir des myoblastes purs à >90% (descendance MuSC).

Les MuSC fraîchement isolés chez la souris ne prolifèrent pas efficacement dans les milieux F10 de Ham complétés par du sérum fœtal bovin (FBS). Pour mieux augmenter le nombre de cellules de MuSC et obtenir suffisamment de myoblastes, le sérum de croissance bovine (BGS) doit être utilisé à la place du FBS. Cependant, si le BGS n’est pas disponible, le milieu complet F10 de Ham (contenant environ 20 % de FBS) peut être mélangé avec un volume égal de milieu conditionnel à cellules T pour favoriser considérablement l’expansion des myoblastes¹³. Par conséquent, ce protocole décrira également la préparation de milieux MuSC conditionnés par des cellules T.

Plus important encore, ce protocole fournit un exemple complet de réalisation de tests H3K4me1 CUT&Tag sur des myoblastes de souris isolés des muscles des membres postérieurs de souris. Veuillez noter que ce protocole s’applique également à d’autres types de cellules et aux marques d’histones et aux variantes d’histones, et que les lecteurs n’ont qu’à optimiser le nombre de cellules ou les quantités d’anticorps pour leurs cas en fonction de l’enrichissement des marques ou variantes d’histones spécifiques qu’ils étudient.

Pour être utilisée dans CUT&Tag ou CUT&RUN, la Tn5 ou la MNase doit être fusionnée avec la protéine A ou la protéine G pour former pA-Tn5, pG-Tn5, pA-MNase ou pG-MNase. Apparemment, les protéines A et G peuvent être fusionnées sur ces enzymes en même temps pour générer pA/G-Tn5 ou pA/G-MNase. Les protéines A et G présentent des affinités différentielles pour les IgG de différentes espèces. Par conséquent, la fusion des protéines A et G sur l’enzyme peut surmonter ce problème et rendre l’enzyme compatible avec les anticorps de plusieurs espèces.

Protocole

Les méthodes présentées dans ce manuscrit sont toutes approuvées par le Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du laboratoire de Guangzhou. Les souris utilisées pour générer les résultats représentatifs de ce manuscrit ont été hébergées et entretenues conformément aux directives du Comité institutionnel de soin et d’utilisation des animaux du laboratoire de Guangzhou.

1. Isolement du myoblaste des muscles des membres postérieurs de la souris (exemple d’utilisation d'1 souris)

1. Diluer l’acide acétique glacial avec du ddH₂O à 0,02 M et l’autoclaver.
2. Diluer le collagène (de la queue de rat) à 0,1 mg/mL avec 0,02 M d’acide acétique.
3. Ajoutez cette solution de collagène dans des boîtes de culture pour enrober le fond de la boîte dans un incubateur cellulaire à 37 °C pendant la nuit.
4. Avant utilisation, retirez la solution de collagène et lavez la vaisselle deux fois avec 1x PBS. La solution de collagène peut être réutilisée 8 à 10 fois.
5. Sacrifiez une souris de 8 à 12 semaines. (Les vieilles souris ont de faibles rendements en MuSC et en myoblastes.)
6. Isolez et placez tous les muscles des membres postérieurs de la souris dans une boîte de 10 cm.
7. Utilisez 1x PBS (avec pénicilline/streptomycine) pour rincer les muscles 4 fois. Après chaque rinçage, transférez toujours les muscles dans une nouvelle assiette.
8. Après le rinçage final, retirez le PBS et émincez les muscles avec des ciseaux.
9. Ajoutez 6 ml de 1x PBS contenant de la dispase II (1,1 U/mL) et de la collagénase II (830 U/mL) pour digérer les muscles hachés, et la digestion devrait durer ~1,5 h.
10. Pour effectuer la digestion, transférez les muscles hachés dans un tube dans un bain-marie à 37 °C ou laissez directement les muscles hachés dans le plat et placez-le dans un incubateur à₂ cellules à 37 °C CO.
11. Si vous utilisez un incubateur cellulaire pour digérer, secouez le plat toutes les 15 à 30 minutes pour bien mélanger la digestion.
    REMARQUE : Dispase II doit d’abord être fabriqué sous forme de stock de 11 U/mL avec un milieu DMEM (sans sérum), et la collagénase II doit être fabriquée sous forme de stock de 10 000 U/mL avec 1x PBS.
12. Une fois la digestion terminée, utilisez une pipette en plastique de 10 ml pour rincer les tissus digérés de haut en bas à plusieurs reprises afin d’homogénéiser complètement le mélange de digestion.
13. Ajouter 10 ml de milieu de culture MuSC/Myoblast pour ralentir la digestion. Des détails sur la préparation des milieux de croissance MuSC/Myoblast se trouvent à la section 2.
14. Passez le mélange dans une passoire de 70 μm. Utilisez 1x PBS pour rincer la plaque de digestion et faites passer ce PBS à travers la passoire également, afin de collecter toutes les cellules de la plaque de digestion.
15. Centrifuger à 350 x g pendant 10 min et jeter le surnageant sous vide.
16. Remettez en suspension la pastille cellulaire avec 20 ml de 1x PBS et passez les cellules dans une passoire de 40 μm.
17. Centrifuger à 350 x g pendant 5 min et retirer le surnageant sous vide.
18. Utilisez 20 ml de milieu de culture MuSC/Myoblast pour remettre les cellules en suspension et ensemencez-les dans une plaque de plastique normale de 10 cm. Les MuSC ne peuvent pas se fixer au fond de la plaque pendant ce temps et resteront flottants principalement dans le support.
    REMARQUE : Il s’agit du premier pré-placage sur des plaques en plastique.
19. Après 1,5 h, basculez brièvement la plaque et transférez le liquide dans deux plats de 10 cm enrobés de collagène, chaque plat contenant 10 ml de culture. Maintenant, les MuSC vont se fixer et se développer sur les plaques recouvertes de collagène. Changez le support après 2 jours. Les plaques recouvertes de collagène sont préparées comme aux étapes 1 à 4 de cette section.
20. Après un autre jour, passez les cellules : Retirez le milieu, lavez les cellules une fois avec 1x PBS et essayez de pressiniser les cellules.
21. Utilisez un milieu de culture MuSC/Myoblast pour rincer les cellules des plaques, déplacez les cellules sur une nouvelle plaque en plastique et incubez dans l’incubateur cellulaire pendant 40 min.
    REMARQUE : Il s’agit du deuxième pré-placage sur des plaques en plastique.
22. Versez la culture dans une nouvelle plaque en plastique et incubez dans l’incubateur cellulaire pendant encore 20 min.
    REMARQUE : Il s’agit du troisième pré-placage sur des plaques en plastique.
23. Ensuite, divisez le surnageant dans la plaque en 8 boîtes de 10 cm enrobées de collagène pour sous-cultiver les cellules. Le rapport de passage est ici de 2:8 (1:4). Après trois fois le pré-placage décrit ci-dessus, les myoblastes peuvent atteindre plus de 90% de pureté. Par conséquent, après ce point, il n’est pas nécessaire de pré-plaquer lors du passage ultérieur des myoblastes.

2. Préparation du milieu de croissance MuSC/Myoblast (exemple de préparation à partir de 5 souris)

1. Sacrifiez 5 souris sauvages jeunes et en bonne santé, isolez la rate et rincez la rate une fois avec 1x PBS (avec pénicilline/streptomycine).
2. Utilisez des ciseaux pour enlever les parties/taches sombres sur la rate, le cas échéant. Jetez la rate si la majeure partie est devenue noire.
3. Placez les 5 rates dans une crépine de 40 μm sur le dessus d’un tube de 50 mL.
4. Ouvrez un emballage de seringue stérile de 1 ml, retirez le piston et jetez le canon.
5. Dans la passoire de 40 μm, tenez le bouchon en caoutchouc et utilisez le repose-pouce du piston pour broyer et dissocier les tissus de la rate en cellules individuelles. Veillez à ne pas toucher et contaminer le repose-pouce du piston lorsque vous déchirez l’emballage de la seringue.
6. Pendant que vous broyez la rate, utilisez de temps en temps 1x PBS pour laver les cellules dissociées de la rate dans le tube de 50 ml sous la crépine.
7. Une fois que toutes les cellules de la rate ont été rincées dans le tube de 50 mL à travers la crépine, centrifugez le tube à 500 x g pendant 10 min.
8. Utilisez 1 ml de 1 tampon de lyse des globules rouges pour remettre la pastille en suspension. Lyser les globules rouges pendant ~1 min.
   REMARQUE : 10x tampon de lyse des globules rouges contient 155 mM NH₄Cl, 10 mM NaHCO₃ et 1 mM de sel disodique EDTA dans ddH₂O. Filtrer pour stériliser et ne pas autoclaver. Diluer avec du ddH₂O à 1x avant utilisation.
9. Remplissez le tube de 50 ml avec 1x PBS pour arrêter le processus de lyse des globules rouges.
10. Filtrez à nouveau la suspension cellulaire à l’aide d’une passoire de 40 μm, puis centrifugez à 500 x g pendant 10 min.
11. Remettre les cellules en suspension avec 2 mL de milieu complet RPMI-1640 (milieu RPMI-1640 avec 10 % de FBS et pénicilline/streptomycine) avec un pipetage très doux.
12. Ajoutez plus de support complet RPMI-1640 dans le tube et mélangez bien. Répartissez la suspension cellulaire dans dix flacons de culture T75. Le volume final de culture dans chaque flacon de culture T75 doit être de 20 mL.
13. Ajouter 10 μL de Concanavalin-A dans chaque flacon de culture T75 et bien mélanger. La concanavaline-A active la prolifération des lymphocytes T.
    REMARQUE : La pâte de Concanavalin-A est de 4 mg/mL et est préparée en dissolvant Concanavalin-A dans 1x PBS. Le Concanavalin-A lui-même est utilisé ici, et ne le confondez pas avec les billes Concanavalin-A utilisées dans les tests CUT&Tag plus tard.
14. Après 48 h, compléter chaque fiole T75 avec 20 mL de support complet RPMI-1640 afin que le volume total atteigne 40 mL.
15. Encore 24 h plus tard, recueillir toute la culture dans chaque ballon T75 et centrifuger à 600 x g pendant 3 min.
16. Le surnageant est un milieu conditionnel aux lymphocytes T et peut être stocké à une température de -20 °C à -80 °C jusqu’à 2 mois. Jetez les pastilles de cellules de rate. Avant utilisation, décongelez le milieu conditionnel aux lymphocytes T et stérilisez-le davantage à l’aide d’un filtre de 0,22 μm.
17. Pour préparer le milieu F10 complet de Ham, ajoutez 100 ml de FBS, 300 μL de bouillon bFGF et 6 ml de pénicilline/streptomycine dans 500 ml de milieu F10 de Ham.
    REMARQUE : La matière de bFGF est de 5 μg/mL et préparée en dissolvant le bFGF dans le milieu F10 de Ham.
18. Mélangez le milieu complet F10 de Ham avec un milieu conditionnel à cellules T filtré décrit ci-dessus dans un rapport de 1:1 pour obtenir un milieu de croissance MuSC/Myoblast.

3. CUT&Tag avec des myoblastes (Exemple de 3 réactions CUT&Tag)

1. Préparation des réactifs clés
   1. Purifier la transposase pA/G-Tn5 en interne à partir d’une culture bactérienne à l’aide de la méthode^{publiée 14}. Cette enzyme n’atteint sa forme fonctionnelle que jusqu’à ce qu’elle soit montée avec des adaptateurs d’ADN créant des bibliothèques. Plus important encore, pA/G-Tn5 est disponible dans le commerce auprès de nombreuses sources.
   2. Les oligonucléotides utilisés pour fabriquer des adaptateurs sont indiqués dans le tableau 1. Plus précisément, recuit Oligo-Rev avec Oligo-A et Oligo-B, respectivement, pour fabriquer en conséquence un adaptateur double brin A et un adaptateur B. Les détails du recuit pour fabriquer les adaptateurs peuvent être trouvés ailleurs¹⁴.
   3. Incuber l’Adaptor-A et l’Adaptor-B avec la transposase pA/G-Tn5 à température ambiante (RT) pendant 2 h. Ensuite, cette transposition va prendre sa forme fonctionnelle. Dans les sections suivantes de ce manuscrit, la forme fonctionnelle de pA/G-Tn5 sera appelée pA/G-Tn5a.
      REMARQUE : Si le pA/G-Tn5 est acheté au lieu d’être fabriqué en interne, assurez-vous de préciser si l’article acheté est monté sur pA/G-Tn5 avec des adaptateurs (en d’autres termes, prêt à l’emploi) ou s’il s’agit simplement de l’enzyme pA/G-Tn5 elle-même. S’il ne s’agit que de l’enzyme, préparez les deux adaptateurs décrits ci-dessus et montez-les sur le pA/G-Tn5 avant d’utiliser enfin cette enzyme pour CUT&Tag.
   4. Pour les recettes du tampon de liaison, du tampon de lavage, du tampon de lavage, du tampon de lavage 300 et du tampon de tagmentation, les lecteurs peuvent également se référer à Kaya-Okur et ^al.1.
   5. Préparez le tampon de liaison, qui contient 20 mM de HEPES pH 7,5, 10 mM de KCl, 1 mM de CaCl₂ et 1 mM de MnCl₂.
   6. Préparez le tampon de lavage, qui contient 20 mM de HEPES pH 7,5, 150 mM de NaCl, 0,5 mM de spermidine et 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase.
   7. Fabriquez de la digitonine sous forme de stock concentré dans du DMSO, puis préparez le tampon Dig-wash en ajoutant de la digitonine dans le tampon Wash à une concentration de 0,5 mg/mL.
   8. Préparez le tampon d’anticorps en ajoutant de l’EDTA à une concentration de 2 mM et du BSA à une concentration de 0,1 % dans le tampon Dig-wash.
   9. Préparez un tampon 300-Dig contenant 20 mM de HEPES pH 7,5, 300 mM de NaCl, 0,5 mM de spermidine, 1x cocktail d’inhibiteurs de protéase et 0,1-0,5 mg/mL de digitonine.
   10. Préparez le tampon de tagmentation en complétant le tampon 300-Dig avec 10 mM MgCl₂. Le MgCl₂ peut activer l’activité enzymatique de pA/G-Tn5a.
       REMARQUE : Les informations relatives aux autres matériaux sont fournies dans le fichier Table des matériaux .
2. Activation de la bille Concanavalin-A
   1. Mélangez 30 μL de billes de Concanavalin-A (10 μL pour chaque réaction) dans 300 μL de tampon de liaison dans un tube à centrifuger de 1,5 mL. Retournez plusieurs fois pour bien mélanger. Placez le tube sur une grille magnétique. Une fois que le liquide est clair, retirez le surnageant.
   2. Retirez le tube du support magnétique, ajoutez 300 μL de tampon de liaison dans le tube, mélangez bien et divisez uniformément en 3 tubes d’une bande de tube de 8 PCR. Désignez chaque tube avec une réaction CUT&Tag.
   3. Placez la bande du tube 8-PCR sur un support magnétique et attendez que le liquide soit clair.
   4. Aspirez le surnageant et retirez les tubes de la crémaillère magnétique. Ajoutez 10 μL de tampon de liaison dans chaque tube et mélangez bien. Placez les perles préparées sur de la glace ou à 4 °C jusqu’à ce que les cellules soient prêtes à continuer.
3. Liaison de cellules sur des billes de Concanavalin-A
   1. Trypsinisez les myoblastes de souris en culture sur les plaques, lavez les cellules une fois avec RT 1x PBS et remettez éventuellement les cellules en suspension dans le tampon de lavage à RT. Évitez la sur-trypsinisation, car cela peut compromettre l’affinité de la membrane cellulaire pour les billes de Concanavalin-A.
   2. Ajustez la densité cellulaire à environ 7 x 10⁵ cellules/mL dans le tampon de lavage de sorte que 100 μL de suspension cellulaire contiennent environ 70 000 cellules, ce qui est suffisant pour une réaction CUT&Tag.
   3. Placez 100 μL de suspension cellulaire dans chaque tube de la bande de tube 8-PCR, qui contient déjà 10 μL de billes de Concanavalin-A préparées. Bien mélanger et incuber sur un agitateur à bascule pendant 10 min à RT.
   4. Placez la bande du tube 8-PCR sur un support magnétique. Attendez qu’il disparaisse et retirez le surnageant.
   5. Pour évaluer si les billes de Concanavalin-A ont efficacement séquestré les cellules, vérifiez le surnageant au microscope pour voir combien de cellules restent dans le surnageant. Après l’étape de liaison de la bille Concanavalin-A, très peu ou pas de cellules doivent être observées dans le surnageant.
4. Incubation des cellules avec un anticorps primaire
   1. Pour chaque échantillon, diluez 1 μL d’anticorps H3K4me1 dans 50 μL de tampon d’anticorps et ajoutez l’anticorps dilué dans chaque tube d’échantillon. Mélangez bien les billes avec l’anticorps dilué en inversant les tubes plusieurs fois. Placez les échantillons sur l’agitateur à bascule pour les incuber à 4 °C pendant une nuit.
      REMARQUE : Comme l’a mentionné le Dr Steven Henikoff¹, il n’était pas nécessaire d’utiliser un témoin IgG négatif dans tous les essais CUT&Tag. Par rapport aux ChIP, les tests CUT&Tag sont livrés avec un signal de fond beaucoup plus faible ou nul. Par conséquent, l’utilisation d’IgG pour effectuer un test CUT&Tag « témoin négatif » n’introduit aucune information utile. En revanche, l’utilisation d’un anticorps validé par CUT&Tag pour effectuer un contrôle positif est importante pour évaluer si le test CUT&Tag a fonctionné.
5. Incuber les cellules avec un anticorps secondaire
   1. Le lendemain matin, placez les échantillons sur le support magnétique et attendez qu’ils soient clairs.
   2. Retirez le surnageant, qui est l’anticorps primaire. Il n’est pas nécessaire de laver les perles ; Ajouter directement 50 μL d’anticorps secondaires dilués (1:100) dans chaque tube d’échantillon.
      REMARQUE : L’anticorps secondaire est dilué avec un tampon Dig-wash à un rapport de 1:100. Pour permettre une reconnaissance plus efficace de pA/G-Tn5a, les anticorps secondaires ne doivent pas être conjugués avec des molécules ou des groupes tels que la HRP, la biotine ou les fluorophores.
   3. Bien mélanger et incuber sur l’agitateur « balançoire » à RT pendant 1 h.
   4. Remettez les échantillons sur le support magnétique, attendez qu’ils soient clairs et jetez le surnageant.
   5. Ajoutez 200 μL de tampon Dig-wash dans chaque tube et retournez plusieurs fois pour éliminer l’excès d’anticorps.
   6. Remettez-le sur la grille magnétique, attendez qu’il disparaisse et retirez le surnageant. Répétez ce lavage deux fois de plus pour éliminer complètement l’excès d’anticorps non liés.
6. Incuber les cellules avec pA/G-Tn5a
   1. Après le dernier lavage, placez les échantillons sur le support magnétique, attendez que les échantillons soient clairs et retirez tout le liquide dans le tube. Pour chaque tube d’échantillon, ajoutez 100 μL de tampon 300-Dig contenant pA/G-Tn5a à 0,04 μM. Mélangez bien et incubez sur l’agitateur de mouvement à bascule pendant 1 h à RT.
   2. Mettez sur la grille magnétique. Attendez que les échantillons soient clairs et retirez le surnageant.
   3. Ajoutez 200 μL de tampon 300-Dig dans chaque échantillon, mélangez bien et placez-le sur l’agitateur pour laver l’échantillon pendant 3 min à RT.
   4. Mettez sur la grille magnétique. Attendez que les échantillons soient clairs et retirez le surnageant. Répétez ce lavage deux fois de plus pour éliminer l’excès de pA/G-Tn5a et abaisser l’arrière-plan.
7. Clivage et marquage des génomes
   1. Après le dernier lavage, placez les échantillons sur le support magnétique et pipetez soigneusement le liquide du tube. Pour chaque échantillon, ajoutez 50 μL de tampon de tagmentation. Bien mélanger et incuber dans une machine PCR à 37 °C pendant 1 h. N’utilisez pas la fonction de chauffage du couvercle de la machine PCR.
      REMARQUE : Facultativement, en raison de l’usure du matériel lors de l’étape suivante de purification de l’ADN génomique, certains ADN de pointe peuvent être ajoutés dans le tampon de marquage afin que la pointe apparaisse dans les résultats finaux de séquençage et puisse être utilisée pour normaliser les données. La méthode de préparation et d’utilisation de l’ADN de pointe peut être trouvée ailleurs¹⁴.
8. Purification totale de l’ADN génomique
   1. Après le marquage, ajoutez 150 μL supplémentaires de tampon de marquage pour chaque échantillon. Le volume total est maintenant de 200 μL.
   2. Ensuite, pour chaque échantillon, ajoutez 10 μL d’EDTA 0,5 M, 3 μL de SDS à 10 % et 2,5 μL de protéinase K. Vortex à 20 mg/mL pour bien mélanger et incuber à 55 ^°C pendant 2 h.
   3. Injecter chaque échantillon dans 200 μL de phénol/chloroforme dans un tube à centrifuger de 1,5 mL et agiter pendant 10 s. Centrifugeuse à 18 000 x g pendant 5 min. Transférez la couche supérieure dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 ml.
   4. Ajouter 200 μL de chloroforme dans chaque tube et agiter pendant 10 s. Centrifugeuse à 18 000 x g pendant 5 min.
   5. Aspirez la couche supérieure dans un nouveau tube à centrifuger de 1,5 ml. Ensuite, pour chaque échantillon, ajoutez 550 μL d’éthanol à 100 % pour précipiter l’ADN à -80 °C pendant 1 h. Pour mieux visualiser la pastille d’ADN, ajoutez 1 μL de glycogène à 20 mg/mL.
   6. Centrifuger à vitesse maximale (>18 000 x g) pendant 15 min pour granuler l’ADN.
   7. Versez soigneusement le surnageant, lavez une fois la pastille de glycogène/ADN avec de l’éthanol à 75 % et centrifugez-la à nouveau à vitesse maximale pendant 5 min.
   8. Retirez l’éthanol à 75 % et remettez en suspension la pastille de glycogène/ADN avec 21 μL de ddH₂O.
9. Préparation et séquençage de la bibliothèque
   1. Configurez la PCR de préparation de la bibliothèque. Pour indexer les échantillons à séquencer ensemble, utilisez une amorce N7XX Illumina différente pour chaque échantillon et une amorce universelle N5XX Illumina. Si vous indexez plus de 12 échantillons, différentes amorces N5XX Illumina seront également nécessaires. Illumina fournit douze amorces N7XX et huit amorces N5XX, de sorte que le nombre total de combinaisons N7XX avec N5XX est de 12 x 8 = 96. La configuration de la réaction PCR est illustrée dans le Tableau 2.
   2. Déterminez approximativement le numéro de cycle de PCR dans la PCR préparée en banque par le numéro de cellule utilisé dans le test CUT&Tag. Normalement, pour un test CUT&Tag utilisant 50 000 à 100 000 cellules, 9 à 12 cycles sont tout à fait suffisants, et un nombre de cellules compris entre 10 000 et 50 000 peut nécessiter jusqu’à 14 cycles. Le programme de PCR est présenté dans le Tableau 3.
      REMARQUE : Pour la plupart des tests CUT&Tag, si l’anticorps a fonctionné correctement, un numéro de cycle PCR compris entre 9 et 14 devrait toujours générer une banque utile pour le séquençage. Une bonne banque a normalement une concentration de 10 à 50 ng/μL (déterminée par le dosage Qubit) et un volume de 20 à 30 μL. Au contraire, si l’anticorps n’a pas fonctionné efficacement et spécifiquement, la simple augmentation du nombre de cycles ne peut pas sauver les expériences. Un nombre excessif de cycles n’améliore pas du tout les résultats et introduit plutôt plus de doublons PCR, ce qui compliquera plus tard l’analyse des données.
   3. Utilisez des billes de purification ou de sélection de taille d’ADN disponibles dans le commerce pour purifier l’ADN de la bibliothèque et sélectionner l’ADN des tailles souhaitées.
   4. Diluez une petite aliquote de la banque purifiée avec de l’eau et utilisez-la pour la qPCR avec des amorces spécifiques au locus afin de vérifier les enrichissements, comme dans les expériences ChIP-qPCR. Avant de séquencer la bibliothèque, cela peut aider à déterminer si le CUT&Tag a fonctionné.
   5. Effectuez le séquençage et l’analyse des données selon les instructions du fabricant.
      REMARQUE : Les kits CUT&Tag sont disponibles dans le commerce auprès d’une poignée d’entreprises, et un exemple peut être trouvé dans le fichier de la table des matériaux .

Résultats

Avant de lier des cellules à des billes de Concanavalin-A, vérifiez la suspension cellulaire au microscope. Par conséquent, après avoir incubé les cellules avec des billes de Concanavalin-A, placez les tubes d’échantillon sur le support magnétique, et le surnageant devrait être observé à nouveau à l’aide d’un microscope. Il s’agit d’évaluer l’efficacité avec laquelle les cellules ont été capturées par les billes de Concanavalin-A. Le tampon de lavage contenant 7 x 10⁵ cellules/mL doit ressembler à la figure 1A au microscope. En revanche, la figure 1B montre le surnageant après la liaison des billes de Concanavalin-A, où les billes ont emporté toutes les cellules. Il ne sert à rien de passer aux étapes suivantes de CUT&Tag si les billes de Concanavalin-A n’ont même pas capturé efficacement les cellules. Le tampon de lavage ne doit pas contenir de sérum ou d’EDTA/EGTA, car ils peuvent abolir la liaison de la membrane cellulaire aux billes de Concanavalin-A. L’albumine sérique bovine, cependant, n’interfère pas avec la liaison de la Concanavalin-A aux cellules.

Après avoir fabriqué les banques CUT&Tag par PCR, une petite aliquote de la bibliothèque (3-4 μL) peut être électrophorisée sur un gel d’agarose à 1,2-1,5 % pour tester si la banque est bonne. La figure 2 montre l’exemple des bibliothèques CUT&Tag H3K4me1 que nous avons créées. Dans une marque d’histones ou une variante d’histones CUT&Tag, la majorité des unités clivées sont apparemment des mononucléosomes, bien que deux nucléosomes puissent également être coupés ensemble. Trois nucléosomes coupés et marqués au total seraient très rares. Par conséquent, un réseau de nucléosomes contenant des mononucléosomes, des di-nucléosomes et très peu de tri-nucléosomes doit être observé dans l’électrophorèse des banques d’histones CUT&Tag. Les nucléosomes contiennent 147 pb d’ADN, mais avec les adaptateurs de séquençage ajoutés par la transposase Tn5 et la PCR de banque, la taille totale d’un mononucléosome CUT&Tagged devrait être de 300 pb, comme le montre la figure 2.

Avant de dépenser de l’argent pour le séquençage à haut débit des banques CUT&Tag, une autre méthode de contrôle de la qualité consiste à effectuer une qPCR avec des amorces spécifiques au locus. Cela équivaut à effectuer une ChIP-qPCR. De plus, les amorces spécifiques au locus de la qPCR CUT&Tag sont conçues sur la base des mêmes principes que les amorces ChIP-qPCR. La figure 3 montre l’amplification par qPCR de différents emplacements sur le locus du gène Myod1. Myod1 code pour le facteur de transcription maître, MyoD, qui détermine la lignée des muscles squelettiques au cours de la myogenèse¹⁵. Comme le montre la figure 3, H3K4me1 est fortement enrichi au niveau de l’amplificateur central (CER) et de la région régulatrice distale (DRR) du locus Myod1. CER et DRR sont des régions d’amplification très bien établies pour Myod1¹⁶. Ceci est cohérent avec le phénotype bien documenté que H3K4me1 marque spécifiquement les amplificateurs commandés¹⁷. De plus, la figure 3 montre que le taux de H3K4me1 est très faible au niveau de la région régulatrice proximale (PRR) car les nucléosomes de la région proximale des promoteurs actifs sont normalement modifiés avec H3K4me3¹⁸ au lieu de H3K4me1. Toutes les paires d’amorces pour ces loci évalués ont déjà été publiées^19,20, et les séquences se trouvent dans le tableau 4. Normalement, après les contrôles de qualité par électrophorèse de l’ADN en banque et qPCR sur des loci spécifiques, les chercheurs seront confiants pour procéder au séquençage.

Figure 1 : Myoblastes remis en suspension dans le tampon de lavage. Vues microscopiques prises (A) avant et (B) après la reliure en perles Concanavalin-A. Le graphique B montre qu’il ne reste presque plus de cellules dans la suspension après l’incubation des billes de Concanavalin-A, ce qui indique que les cellules ont été efficacement capturées par les billes. Les petites particules du panneau B sont probablement les billes excessives de Concanavalin-A. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Électrophorèse des banques CUT&Tag. Trois tests indépendants H3K4me1 CUT&Tag ont été réalisés, et chacun a été transformé en une bibliothèque de séquençage à l’aide d’amorces Illumina et de la PCR. Chaque CUT&Tag H3K4me1 a utilisé 70 000 myoblastes de souris. Les bibliothèques contiennent principalement des mononucléosomes marqués. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : amplification par qPCR de différents emplacements sur le locus du gène Myod1. La qPCR montre que dans les myoblastes de souris, la marque H3K4me1 est fortement enrichie au niveau des régions amplificateurs du gène Myod1, ce qui correspond aux conclusions publiées. CER et DRR sont des amplificateurs publiés de Myod1 qui sont situés en amont du promoteur de Myod1. Veuillez noter que le PRR n’a pas d’accumulation de H3K4me1, ce qui est également cohérent avec le fait que les promoteurs actifs sont principalement marqués par H3K4me3. Les enrichissements ont été calculés en normalisant à l’enrichissement de H3K4me1 sur le « désert de gènes » de l’échantillon « Repeat 1 ». Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Nom	Séquences (5'-3') :
Oligo-Rev	phos-CTGTCTCTTATACACATCT
Oligo-A	TCGTCGGCAGCGTCAGATGTGTATAAGAGACAG
Oligo-B	GTCTCGTGGGCTCGGAGATGTGTATAAGAGACAG

Tableau 1 : Séquences d’oligo-fluides pour la fabrication de l’Adaptor-A et de l’Adaptor-B à monter sur la transposase pA/G-Tn5.

Fraction	Volume
ADN génomique purifié après réaction CUT&Tag	21 μL
Amorce N5XX (10 μM)	2 μL
Amorce N7XX (10 μM)	2 μL
NEBNext Mélange maître PCR haute fidélité 2×	25 μL
	Total 50 μL

Tableau 2 : Configuration de la PCR pour la préparation de la bibliothèque CUT&Tag à l’aide des amorces d’indexation Illumina. Si vous utilisez un kit CUT&Tag commercial qui contient des réactifs PCR de banque tels qu’un mélange d’ADN polymérase, suivez le manuel spécifique de ce kit pour configurer la PCR de bibliothèque.

Pas	Température	Heure	Numéro de cycle
1	72 °C	3 min	1
2	95 °C	3 min	1
3	98 °C	10 s	9 à 14
4	60 °C	5 s, puis passez à l’étape 3
5	72 °C	1 minute	1
6	4 oC	tenir	N/A

Tableau 3 : Programme PCR pour la préparation de la bibliothèque CUT&Tag à l’aide des amorces d’indexation Illumina.

Emplacement	Séquences d’amorces (5'-3')
Le	Pour : GGG CAT TTA TGG GTC TTC CT
	Rev : CTC ATG CCT GGT GTT TAG GG
-15,000	Pour : TGC CCA GAG CCT AGA ATC AT
	Rev : TCA TGC ATC CTT GCT GGA TA
-7,000	Pour : GGC ATG GGA GGT TTA TAG CA
	Rév. : ATG CCA CTA TGC AAT CCA CA
RRC	Pour : TCA GGA CCA GGA CCA TGT CT
	Rév : CTG GAC CTG TGG CCT CTT AC
PRR	Pour : GAG TAG ACA CTG GAG AGG CTT GG
	Rev : GAA AGC AGT CGT GTC CTG GG
CDS1	Pour : CAT CTG ACA CTG GAG TCG CTT TG
	Rév. : CAA GCA ACA CTC CTT GTC ATC AC
CDS2	Pour : GTG AGC CTT GCA CAC CTA AGC C
	Rev : GTT GCA CTA CAC AGC ATG CCT G
Amplificateur d’IgH	Pour : ACC CTG GGA AGA CCA TAC TTA ATC T
	Rev : CCA TCC ACA CTC GTG CCT TA
Gène désert	Pour : TCC TCC CCA TCT GTG TCA TC
	Rev : GGA TCC ATC ACC ATC AAT AAC C

Tableau 4 : Amorces spécifiques au locus pour tester l’enrichissement en H3K4me1 à différents endroits sur le gène Myod1 .

Discussion

Le nombre spécifique de cellules requis dans une certaine réaction CUT&Tag dépend entièrement de l’enrichissement des marques/variantes d’histones ou des protéines de liaison à la chromatine qui doivent être testées. Normalement, pour des marques d’histones très enrichies telles que H3K4me1, H3K4me3 et H3K27ac, etc., 25 000 à 50 000 myoblastes sont tout à fait suffisants pour une réaction CUT&Tag. Cependant, certaines protéines rares de liaison à la chromatine peuvent nécessiter jusqu’à 250 000 cellules. Le numéro de cellule utilisé dans les tests CUT&Tag est critique, ce qui, s’il n’est pas bien géré, entraîne normalement l’échec du test. L’utilisation d’un nombre excessif de cellules dans une réaction CUT&Tag est préjudiciable, en particulier lors du test de marques d’histones très enrichies. Commencer avec trop de cellules signifie un nombre insuffisant d’anticorps alloués à chaque cellule. CUT&Tag ne fonctionne pas seulement avec un très petit nombre de cellules, il peut en fait être appliqué au niveau¹ d’une seule cellule.

Par-dessus tout, l’utilisation d’un anticorps fiable et validé avec une affinité et une spécificité élevées est toujours la clé du succès d’un test CUT&Tag. Comme pour les tests ChIP, Immunoprécipitation (IP) et IF, CUT&Tag nécessite également le type d’anticorps capables de reconnaître les antigènes naturellement repliés¹. En revanche, les anticorps qui ne reconnaissent que les peptides relâchés dans le Western blot doivent être strictement évités dans le CUT&Tag.

Si l’optimisation du nombre de cellules ou l’utilisation d’un anticorps validé par immunofluorescence ou bien cité ne peut toujours pas résoudre le problème du signal faible dans un test CUT&Tag, vérifiez si la protéine d’intérêt est une protéine associée à la chromatine qui se lie faiblement ou ne se lie même pas directement à l’ADN. Dans ce cas, comme mentionné précédemment, passez à l’utilisation de CUT&RUN au lieu de CUT&Tag. Alternativement, une légère fixation, telle que 5 minutes dans du paraformaldéhyde à 0,5 % (suivie d’une trempe de 10 minutes dans de la glycine à 0,1 M), pourrait être une méthode qui mérite d’être testée. Cependant, comme nous n’avons jamais pratiqué la fixation dans aucun test CUT&Tag, ni même rencontré la nécessité de fixer les cellules avant d’effectuer CUT&Tag, nous ne pouvons pas faire d’autres commentaires concernant la réticulation.

Nous comprenons que certaines versions des protocoles CUT&Tag peuvent affirmer que la RT (2 h) et la 4 °C (pendant la nuit) pour l’étape d’incubation primaire de l’anticorps peuvent générer des résultats décents²¹. Nous recommandons toutefois fortement d’utiliser 4 °C (toute la nuit) plutôt que RT pendant 2 h. D’autre part, il n’est pas non plus recommandé de prolonger le temps d’incubation au-delà d’une nuit.

En ce qui concerne la sensibilité, le contrôle du bruit de fond et le degré de complexité à gérer pour les chercheurs, CUT&Tag est supérieur aux tests ChIP. Si certains inconvénients doivent être mis en avant pour CUT&Tag par rapport à ChIP, alors le seul est que les protocoles CUT&Tag n’incluent pas de méthode de normalisation interne telle que l’utilisation de « Input » dans un test ChIP¹. Par conséquent, lorsqu’ils comparent les hauteurs de pic entre les échantillons à l’aide de CUT&Tag, les chercheurs doivent d’abord égaliser le nombre de cellules entre les échantillons. De plus, il est essentiel d’inclure des répliques techniques.

Ce protocole présente tous les détails de la réalisation de CUT&Tag dans les myoblastes de souris en fournissant un exemple réussi de H3K4me1 CUT&Tag dans ce type de cellule. La méthode décrite ici peut être appliquée directement à des MuSC fraîchement isolés sans aucune modification. De plus, des expériences CUT&Tag sur des marques d’histones, des variants d’histones ou des facteurs de transcription dans d’autres types de cellules peuvent également être réalisées selon ce protocole. Pour les myotubes ou les myofibres, les noyaux peuvent être isolés en premier, et CUT&Tag peut ensuite être réalisé sur les myonoyaux. Ce faisant, on peut traiter les noyaux de la même manière que les cellules sont traitées dans ce protocole CUT&Tag. Les myotubes et les myofibres sont des cellules multinucléées, et nous n’avons pas testé si les myotubes ou les myofibres peuvent être directement liés aux billes de Concanavalin-A, bien que cela puisse être faisable.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
bFGF	R& D Systems	233-FB-025
Collagène	Corning	354236
Collagénase II	Worthington	LS004177
Concanavalin-A	Sigma-Aldrich	C5275
Perles Concanavalin-A	Bangs Laboratories	BP531
Digitonin	Sigma-Aldrich	300410
Dispase II	Thermo Fisher Scientific	17105041
Sérum fœtal bovin	Hyclone	SH30396.03
H3K4me1 anticorps  ;	abcam	ab8895
Média de jambon F10	Thermo Fisher Scientific	11550043
Hyperactive Universal CUT& Kit de dosage d’étiquettes pour Illumina	Vazyme	TD903	Ce kit a été testé par nos soins pour son bon fonctionnement
Rack magnétique pour tubes EP de 1,5 mL	Qualityard	QYM06
Rack magnétique pour bandes de tubes 8-PCR	Anosun Magnetic	CLJ16/21-021
NEBNext High-Fidelity 2x PCR Master Mix	NEB	M0541L	Pour la création de bibliothèques de réactions PCR
pA-Tn5	Vazyme	S603-01	Doit être monté avec des adaptateurs avant utilisation
Cocktail d’inhibiteurs de protéase	Sigma-Aldrich	5056489001
Proteinase K	Beyotime	ST535-100mg
RPMI-1640 média	Thermo Fisher Scientific	C11875500BT
Anticorps secondaire (IgG anti-lapin de cobaye)	Anticorps-en ligne	ABIN101961
Spermidine	Sigma-Aldrich	S2626
TruePrep Index Kit V2 pour Illumina  ;	Vazyme	TD202	Ce kit fournit des amorces Illumina N7XX et N5XX
Perles propres d’ADN VAHTS  ;	Vazyme	N411	Peut remplacer les billes Ampure XP. Peut purifier CUT& Étiquetez les bibliothèques et sélectionnez les fragments d’ADN par taille