Ici, nous présentons un protocole pour la création d’un défaut de cavité en boîte dans le tissu de diaphyse fémorale du rat. Ce modèle permet d’évaluer les performances des biomatériaux sous stress biomécanique et d’explorer les mécanismes de régénération osseuse liés à l’ostéogenèse intramembraneuse.
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Article de méthode
Création d’un modèle de défaut de cavité en boîte dans l’os cortical du fémora de rat
Dans cet article
Résumé
Résumé
De graves défauts osseux ou des fractures complexes peuvent entraîner de graves complications telles que l’absence de consolidation ou une cicatrisation osseuse insuffisante. L’ingénierie tissulaire, qui implique l’application de cellules, d’échafaudages et de cytokines, est considérée comme une solution prometteuse pour la régénération osseuse. Par conséquent, divers modèles animaux qui simulent des défauts osseux jouent un rôle crucial dans l’exploration du potentiel thérapeutique de l’ingénierie tissulaire pour la cicatrisation osseuse. Dans cette étude, nous avons établi un modèle de défaut osseux cortical en forme de boîte dans le milieu du fémur de rats, qui pourrait servir de modèle idéal pour évaluer la fonction des biomatériaux dans la promotion de la cicatrisation osseuse. Ce défaut osseux cortical en forme de boîte a été percé à l’aide d’une pièce à main orale à basse vitesse et façonné à l’aide d’une aiguille de tour. Une analyse micro-TDM postopératoire a été immédiatement effectuée pour confirmer l’établissement réussi de l’anomalie osseuse corticale de la cavité carrée. Les fémurs du côté opéré des rats ont ensuite été récoltés à plusieurs moments après la chirurgie (0 jour, 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines). Le processus de cicatrisation de la zone défectueuse de chaque échantillon a été évalué à l’aide d’une micro-tomodensitométrie, d’une coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et d’une coloration au trichrome Masson. Ces résultats ont démontré un schéma de cicatrisation compatible avec une ossification intramembraneuse, la cicatrisation étant essentiellement terminée à 6 semaines. La catégorisation du processus de cicatrisation de ce modèle animal fournit une méthode in vivo efficace pour étudier de nouveaux biomatériaux et médicaments qui ciblent l’ossification intramembraneuse pendant la cicatrisation des défauts du tissu osseux.
Introduction
Les fractures et les défauts osseux résultent souvent de traumatismes, de tumeurs, d’inflammations et de malformations congénitales 1,2. Bien que le tissu osseux chez les jeunes individus en bonne santé possède généralement des capacités de régénération robustes3, des défauts dépassant une taille critique ou des obstacles à la guérison dus à des maladies systémiques (par exemple, le diabète, l’ostéoporose et les infections) peuvent toujours entraîner des complications telles qu’une discontinuité osseuse ou une altération de la cicatrisation4. Pour relever ce défi clinique, la greffe osseuse ou les biomatériaux sont couramment utilisés pour remplacer des os gravement défectueux ou pour reconstruire de gros segments osseux. Cependant, ces traitements ont des limites. Par exemple, bien qu’elle soit considérée comme l’étalon-or, la greffe osseuse autologue souffre d’un approvisionnement limité en donneurs et de complications potentielles sur le site donneur 5,6. Les allogreffes présentent également certains risques, tels que le rejet à médiation immunitaire, la transmission potentielle de maladies et des impacts négatifs sur les propriétés biomécaniques et biologiques du greffon7.
Ces dernières années ont vu une augmentation de la recherche axée sur les mécanismes de guérison des défauts osseux. L’utilisation de biomatériaux alternatifs et les progrès de l’ingénierie tissulaire sont devenus des sujets importants dans le domaine de la régénération osseuse8. Avant que ces biomatériaux puissent être appliqués à la thérapie humaine, ils doivent être testés in vitro et in vivo pour garantir leur efficacité et leur sécurité. Cependant, la complexité réduite des environnements in vitro et l’absence de réponses immunitaires et inflammatoires limitent l’évaluation de divers biomatériaux in vitro. Par conséquent, l’établissement de modèles animaux pour divers types de défauts du tissu osseux est nécessaire9. Les modèles animaux permettent d’évaluer les biomatériaux dans différentes conditions de charge, facilitent la compréhension des caractéristiques osseuses spécifiques à l’espèce et donnent un aperçu de la similitude entre les modèles animaux et les situations cliniques humaines. Ces avantages sont essentiels pour étudier les interactions os-échafaudage et traduire les résultats de la recherche en pratique clinique 9,10.
À l’heure actuelle, les modèles animaux de défauts osseux mécaniques sont largement utilisés pour valider les performances des biomatériaux, les modèles de défauts osseux crâniens et les modèles de défauts osseux segmentaires étant les méthodes les plus couramment appliquées11. Les modèles de défauts osseux segmentaires, souvent utilisés pour imiter de graves traumatismes osseux longs ou tibiaux se terminant par une non-consolidation osseuse, sont avantageux en raison de leurs dimensions uniformes et de leurs positions anatomiques définies, simplifiant les évaluations radiologiques ou histologiques de la formation et de la revascularisation de nouveaux os. Cependant, ces modèles nécessitent des implants métalliques pour stabiliser les segments de fracture bilatérale et nécessitent un processus de cicatrisation complexe impliquant à la fois une ossification endochondrale et intramembraneuse12. D’autre part, les modèles de défauts osseux calvaires sont devenus un outil de dépistage primaire pour l’évaluation des biomatériaux en raison de leurs diamètres de défaut standardisés, de leur accès chirurgical pratique et de la fonction de soutien de la dure-mère et des tissus mous13. Bien qu’ils soient largement utilisés pour modéliser la formation osseuse intramembraneuse dans des scénarios cliniquement pertinents, ils ne conviennent pas à l’évaluation de la cicatrisation osseuse dans des conditions de charge biomécanique en raison de leur nature non porteuse pendant le processus de cicatrisation14.
Pour remédier à ces limitations, nous avons établi un modèle de défaut osseux cortical dans le tissu de diaphyse fémorale de rats. À l’aide de la microtomodensitométrie (TDM), de la reconstruction tridimensionnelle (3D) et de la coloration histopathologique (hématoxyline et éosine [HE] et Masson), nous avons analysé le processus de cicatrisation de ce modèle dans des conditions d’hémostase. Notre objectif est d’offrir de nouvelles perspectives pour l’évaluation des performances des biomatériaux dans des conditions de charge biomécanique et pour l’étude de la bio-ingénierie et du mécanisme de la régénération osseuse vis-à-vis de l’ossification intramembraneuse.
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Protocole
Toutes les procédures animales de cette étude ont été examinées et approuvées par le comité d’éthique de l’École de stomatologie de l’Ouest de la Chine de l’Université du Sichuan (WCHSIRB-D-2021-597). Des rats Sprague-Dawley (mâles, poids corporel de 300 g) ont été utilisés pour la présente étude.
1. Préparation préopératoire
- Préparation de l’instrument
- Reportez-vous à la figure 1A pour les instruments chirurgicaux utilisés dans cette étude : rasoir électrique, ciseaux tissulaires, ciseaux ophtalmiques, pinces ophtalmiques, scalpel jetable, séparateur périosté, pièce à main orale à basse vitesse, sonde buccale, aspirateur d’irrigation jetable, porte-aiguille, suture 3.0.
- Préparez une sonde buccale et marquez la grande extrémité incurvée de la sonde à l’aide d’un marqueur en fonction du diamètre du défaut (Figure 1B). Utilisez-le pour déterminer la taille du défaut pendant la chirurgie.
- Stérilisez tout le matériel et les instruments chirurgicaux utilisés pour effectuer la procédure avant de les utiliser. Emballez les matériaux souhaités dans un chiffon plié ou du papier d’emballage et scellez-les avec du ruban adhésif autoclave pour la stérilisation à la vapeur (125-135°C pendant 20-25 min).
- Préparation de la zone chirurgicale : Désinfectez la table d’opération et l’environnement autour de la table en pulvérisant de l’alcool à 75 %. Créez une zone stérile d’environ 60 cm x 90 cm avec des champs autoclavés sur la table d’opération.
- Préparation à l’anesthésie
- Anesthésier les rats par voie intrapéritonéale avec du chlorhydrate de kétamine à 10 % (50-100 mg/kg) et de la xylazine à 2 % (2 mg/kg). Utiliser l’injection sous-cutanée de carprofène (5 mg/kg) pour l’analgésie préopératoire et peropératoire. Examinez la profondeur de l’anesthésie par un test de pincement des orteils. Après l’anesthésie, appliquez une pommade oculaire stérile sur les yeux pour prévenir la sécheresse oculaire et les lésions cornéennes.
2. Intervention chirurgicale
- Placez le rat en position couchée latérale sur la table chirurgicale stérile et retirez les poils des membres inférieurs avec un rasoir électrique.
- Utilisez une solution d’iodophore à 5 % et d’alcool à 75 % pour désinfecter les tissus cutanés dans la zone chirurgicale.
- Localisez le fémur proximal et distal et faites une incision de 2,5 cm le long de l’axe long du fémur pour couper le tissu cutané du rat.
- Séparez la couche cutanée du fascia à l’aide d’une pince ophtalmique et de ciseaux tissulaires, et exposez l’approche latérale du fémur à travers le biceps fémoral et les muscles fémoraux latéraux.
- Localisez l’intersection des deux septa musculaires (une ligne de tissu blanc) et séparez-les soigneusement avec une lame chirurgicale jetable le long de la bordure musculaire jusqu’à ce que la surface fémorale soit atteinte.
REMARQUE : Lorsque vous utilisez une lame jetable pour séparer le muscle, il est important de séparer le long de la cloison musculaire et de faire attention à ne pas causer de lésions vasculaires dans les tissus mous. Les débutants et ceux qui ne connaissent pas l’anatomie doivent utiliser des pinces ophtalmiques et des séparateurs périostés pour la dissection contondante entre les deux masses musculaires.
- Appliquez un séparateur périosté pour séparer brutalement les muscles de la surface fémorale et exposer le milieu de la diaphyse fémorale.
- À l’aide d’un marqueur stérile, marquez la zone du site du défaut sur la surface médiane de la diaphyse fémorale, située au sommet de la crête oblique latérale 1/3 de la tête fémorale.
- À l’aide d’une perceuse à bille à mouvement lent de 1,2 mm de diamètre, utilisez la pièce à main orale à basse vitesse pour percer un petit trou perpendiculaire à la surface de l’os au site marqué, détruisant le périoste et le cortex osseux à une profondeur suffisante pour atteindre la cavité de la moelle osseuse. À ce niveau de profondeur de forage, augmentez la taille du trou parallèlement à cette profondeur dans toutes les directions, en taillant pour obtenir une forme de cavité en boîte.
- À l’aide d’une sonde buccale étiquetée parallèle au bord du défaut, déterminer le diamètre et la morphologie du défaut pendant et après la préparation.
- Fermez les couches musculaires et cutanées avec des sutures résorbables en monofilaments 3-0, respectivement, et désinfectez la zone chirurgicale avec de l’iodophore à 5 % de l’intérieur vers l’extérieur.
3. Soins postopératoires
- Après la chirurgie, administrez du carprofène (5 mg/kg) par voie sous-cutanée et placez le rat sur un coussin chauffant à température constante jusqu’à ce qu’il se remette de l’anesthésie. Lorsque le rat reprend conscience, déplacez-le doucement dans une cage contenant une litière sèche et autoclave.
- Poursuivre l’analgésie pendant 24 h et la surveillance postopératoire pendant 1 semaine après l’intervention.
4. Prélèvement et analyse de l’échantillon
- Euthanasier humainement le rat après l’opération en injectant du pentobarbital sodique 100-200 mg/kg par voie intrapéritonéale. Séparez soigneusement le muscle et le tissu fascial à la surface du fémur et retirez complètement le fémur du côté opéré. Prélever les échantillons à 0 jour (Figure 2A, B), 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines après l’opération.
- Fixer les échantillons fémoraux dans du paraformaldéhyde à 4 % pendant 24 h. Analyser la structure des fémurs à l’aide de la microtomographie par ordinateur. Réglez les paramètres de balayage comme suit : potentiel du tube à rayons X, 70 kVp ; filtre, AL 0,5 mm ; Intensité des rayons X, 0,2 mA ; taille du voxel, 17 μm ; et temps d’intégration, 1 × 300 ms. Reconstruisez des images de modèle 3D à l’aide de données bitmap.
- Détartrez les échantillons dans de l’EDTA à 10 % pendant 8 semaines avant de déshydrater les échantillons fémoraux dans une série graduée de dilutions à l’éthanol. Ensuite, incorporez les échantillons dans de la cire de paraffine15.
- Coupez les échantillons noyés en sections de paraffine de 5 μm à partir du plan sagittal.
- Coupes de teinture avec un kit de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine (H&E) et un kit de coloration Masson. Observer la cicatrisation de la zone du défaut par histopathologie.
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Résultats
Dans ce protocole, nous réussissons à établir un modèle de défaut de boîte fémorale-cavité de rat avec des dimensions de 4,5 mm x 1,5 mm par forage. Afin d’analyser le processus de guérison, nous avons collecté le tissu fémoral du côté opéré à 0 jour, 2 semaines, 4 semaines et 6 semaines après la chirurgie, qui sont les points clés de l’ossification endochondrale, de l’ossification intramembraneuse et du remodelage osseux au cours du processus de guérison des traumatismes fémoraux chez le...
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Discussion
Les modèles animaux précliniques sont essentiels pour examiner la cicatrisation osseuse et l’influence des biomatériaux sur la régénération osseuse. Ce protocole illustre un modèle de défaut de la boîte fémorale-cavité reproduisant le processus de formation osseuse intramembraneuse associé à la régénération osseuse clinique. La zone du défaut a été normalisée en peropératoire à l’aide d’une sonde buccale pré-marquée. Les résultats de la micro-tomodensitométrie et de la coloration histopathologique ont montré une cicatris...
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Déclarations de divulgation
Toutes les données et images originales sont incluses dans cet article. Les auteurs ne déclarent aucun conflit d’intérêts
Remerciements
Cette étude a été financée par des subventions de la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine 82101000 (H. W.), U21A20368 (L. Y.) et 82100982 (F. L.), et soutenue par le Sichuan Science and Technology Program 2023NSFSC1499 (H. W.).
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Perceuse à bille à vitesse lente de 1,2 mm | Dreybird Medical Equipment Co., Ltd. | RA3-012 | Pour la préparation des défauts de la cavité de la boîte |
| 3.0 suture | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Aucun | Pour suturer les plaies |
| 4 % de paraformaldéhyde | Biosharp | BL539A | Pour fixer les échantillons fémoraux |
| Boules de coton | Haishi Hainuo Group Co., ; Ltd. | 20120047 | Pour la stérilisation de la peau et le nettoyage du champ chirurgical |
| Bâtonnets de coton | Lakong Medical Devices Co., Ltd. | M6500R | Pour la désinfection de la peau |
| Rectifieuse de prothésiste dentaire | Marathon | N3-140232 | Pour la préparation des défauts de cavité de la boîte |
| Scalpel jetable | Hangzhou Huawei Medical Supplies Co., Ltd. | 20100227 | Pour la création d’incisions cutanées ainsi que pour la séparation nette du tissu musculaire |
| Rasoir électrique | JASE BM320210 | Élimination du tissu pileux de la zone chirurgicale | |
| Kit de coloration à l’hématoxyline et à l’éosine | Biosharp | C1005 | Pour l’analyse histologique des échantillons |
| Masson' s Kit de coloration trichrome | Solarbio | G1340 | Pour l’analyse histologique des échantillons |
| Micro CT | Scanco medical ag | µ ; CT 45 | Pour l’analyse de la cicatrisation des défauts dans les échantillons fémoraux |
| Porte-aiguille | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Aucun | Pour les aiguilles de maintien de suture |
| Olympus Research Grade Whole Slide Scanning System VS200 | Chengdu Knowledge Technology Co. | VS200 | Pour l’analyse des résultats de la coloration HE et de la coloration Masson |
| Pince ophtalmique | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Aucun | Pour le clampage de la peau, du tissu musculaire |
| Ciseaux ophtalmiques | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Aucun | Pour la formation d’une incision cutanée |
| approche Pièce à main orale à basse vitesse | Marathon | Y221101003 | Pour la préparation des défauts de cavité de la boîte |
| Sonde buccale | Shanghai Sangda Medical Insurance Co., Ltd. | 20000143 | Pour mesurer le diamètre des défauts |
| Séparateur périosté | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Aucun | Pour la séparation brutale du tissu musculaire |
| Sprague&ndash ; Rats Dawley | Byrness Weil Biotech Ltd | Aucun | Pour l’établissement de l’os fémoral boy-cavitaire |
| Ciseaux à tissus | Chengdu Shifeng Co., Ltd. | Aucun | Pour former une approche d’incision cutanée |
Références
- Einhorn, T. A., Gerstenfeld, L. C. Fracture healing: mechanisms and interventions. Nat Rev Rheumatol. 11 (1), 45-54 (2015).
- Claes, L., Recknagel, S., Ignatius, A. Fracture healing under healthy and inflammatory conditions. Nat Rev Rheumatol. 8 (3), 133-143 (2012).
- Holmes, D. Nonunion bone fracture: a quicker fix. Nature. 550 (7677), S193(2017).
- Dimitriou, R., Jones, E., McGonagle, D., Giannoudis, P. V. Bone regeneration: current concepts and future directions. BMC Med. 9, 66(2011).
- Schmidt, A. H. Autologous bone graft: Is it still the gold standard? Injury. 52 (Suppl 2). , S18-S22 (2021).
- Baldwin, P., et al. Autograft, allograft, and bone graft substitutes: Clinical evidence and indications for use in the setting of orthopaedic trauma surgery. J Orthop Trauma. 33 (4), 203-213 (2019).
- Muscolo, D. L., Ayerza, M. A., Aponte-Tinao, L. A. Massive allograft use in orthopedic oncology. Orthop Clin North Am. 37 (1), 65-74 (2006).
- Yu, Y., et al. Biomimetic periosteum-bone substitute composed of preosteoblast-derived matrix and hydrogel for large segmental bone defect repair. Acta Biomater. 113, 317-327 (2020).
- Pearce, A. I., Richards, R. G., Milz, S., Schneider, E., Pearce, S. G. Animal models for implant biomaterial research in bone: a review. Eur Cell Mater. 13, 1-10 (2007).
- McGovern, J. A., Griffin, M., Hutmacher, D. W. Animal models for bone tissue engineering and modelling disease. Dis Model Mech. 11 (4), dmm033084(2018).
- Bigham-Sadegh, A., Oryan, A. Selection of animal models for preclinical strategies in evaluating the fracture healing, bone graft substitutes and bone tissue regeneration and engineering. Connect Tissue Res. 56 (3), 175-194 (2015).
- Horner, E. A., et al. Long bone defect models for tissue engineering applications: criteria for choice. Tissue Eng Part B Rev. 16 (2), 263-271 (2010).
- Vajgel, A., et al. A systematic review on the critical size defect model. Clin Oral Implants Res. 25 (8), 879-893 (2014).
- Samsonraj, R. M., et al. A versatile protocol for studying calvarial bone defect healing in a mouse model. Tissue Eng Part C Methods. 23 (11), 686-693 (2017).
- Yu, F., Li, F., Zheng, L., Ye, L. Epigenetic controls of Sonic hedgehog guarantee fidelity of epithelial adult stem cells trajectory in regeneration. Sci Adv. 8 (29), eabn4977(2022).
- Colnot, C. Skeletal cell fate decisions within periosteum and bone marrow during bone regeneration. J Bone Miner Res. 24 (2), 274-282 (2009).
- Bhandari, M., Shaughnessy, S. A minimally invasive percutaneous technique of intramedullary nail insertion in an animal model of fracture healing. Arch Orthop Trauma Surg. 121 (10), 591-593 (2001).
- Muschler, G. F., Raut, V. P., Patterson, T. E., Wenke, J. C., Hollinger, J. O. The design and use of animal models for translational research in bone tissue engineering and regenerative medicine. Tissue Eng Part B Rev. 16 (1), 123-145 (2010).
- Primer on the Metabolic Bone Diseases and Disorders of Mineral Metabolism. Clifford, J., Rosen, M. D. , Wiley-Blackwell, UK. (2019).
- Wong, R. M. Y., et al. A systematic review of current osteoporotic metaphyseal fracture animal models. Bone Joint Res. 7 (1), 6-11 (2018).
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Réimpressions et autorisations
