Un système de bocal en verre polyvalent pour le profilage de l’exsudat racinaire semi-hydroponique

Résumé

Nous présentons un protocole pour un système expérimental semi-hydroponique à base de verre supportant la croissance d’une variété de plantes phylogénétiquement distinctes avec ou sans microbes. Le système est compatible avec différents milieux de culture et permet un échantillonnage non destructif de l’exsudat racinaire pour une analyse en aval.

Résumé

Les exsudats racinaires façonnent l’interface plante-sol, sont impliqués dans le cycle des nutriments et modulent les interactions avec les organismes du sol. Les exsudats racinaires sont dynamiques et façonnés par des conditions biologiques, environnementales et expérimentales. En raison de leur grande diversité et de leurs faibles concentrations, les profils d’exsudat précis sont difficiles à déterminer, d’autant plus dans les environnements naturels où d’autres organismes sont présents, retournant des composés d’origine végétale et produisant eux-mêmes des composés supplémentaires. Le système expérimental de bocaux en verre semi-hydroponiques présenté ici permet de contrôler les facteurs biologiques, environnementaux et expérimentaux. Il permet la croissance de diverses espèces végétales phylogénétiquement distinctes jusqu’à plusieurs mois avec ou sans microbes, dans une variété de milieux de culture différents. La conception à base de verre offre un faible fond de métabolites pour une sensibilité élevée et un faible impact sur l’environnement car il peut être réutilisé. Les exsudats peuvent être échantillonnés de manière non destructive et les conditions peuvent être modifiées au cours d’une expérience si vous le souhaitez. La configuration est compatible avec l’analyse par spectrométrie de masse et d’autres procédures analytiques en aval. En résumé, nous présentons un système de croissance polyvalent adapté à l’analyse sensible de l’exsudat racinaire dans une variété de conditions.

Introduction

Dans les sols densément peuplés, la rhizosphère présente une niche riche en carbone. Il est façonné par les racines des plantes via l’exsudation de jusqu’à 20 % de carbone assimilé et abrite des communautés microbiennes distinctes du microbiome du sol^résident 1,2,3,4,5,6. Alors que les chercheurs exploitent les fonctions bénéfiques des microbes associés aux racines et le potentiel d’agriculture durable qui l’accompagne⁷, cette observation, souvent appelée effet de rhizosphère, a fait l’objet d’efforts scientifiques croissants. Cependant, jusqu’à présent, le dialogue chimique entre les micro-organismes et les plantes, qui est proposé comme étant le moteur de l’effet de rhizosphère, reste mal compris et, par conséquent, la compréhension mécaniste pour le développement de solutions microbiennes fiables dans l’agriculture est limitée ^8,9,10.

Il n’est pas simple de déchiffrer les exsudats racinaires dans des environnements de sol où les métabolites sont facilement absorbés par les particules du sol et rapidement retournés par les communautés microbiennes, en particulier pour les espèces végétales à système racinaire fin comme la plante modèle Arabidopsis thaliana¹¹. C’est pourquoi, dans la plupart des études, les exsudats racinaires sont prélevés dans des systèmes hydroponiques. Dans ces microcosmes, les parties aériennes des plantes sont maintenues en place par des porte-plantes personnalisés ou des matériaux plus discrets tels que des mailles, de l’agar et des perles de verre. Les récipients utilisés vont des boîtes de Pétri aux plaques multipuits en passant par les différentes boîtes personnalisées et commerciales avec ou sans filtres d’aération 12,13,14,15,16,17,18,19. Selon le système, les conditions de croissance des plantes varient considérablement et reflètent plus ou moins les conditions naturelles.

Nous présentons ici un système semi-hydroponique à base de verre qui peut être utilisé expérimentalement et qui produit des résultats hautement reproductibles. Il est simple à assembler et à utiliser et est basé sur des matériaux couramment disponibles. Le système est basé sur un bocal en verre rempli de billes de verre, tirant parti de la nature réutilisable et des propriétés à faible liaison de la verrerie (Figure 1). Les billes fournissent un support physique à la plante en croissance et simulent l’impédance mécanique, contribuant à une architecture racinaire plus semblable à celle du sol par rapport aux installations hydroponiques 19,20,21. Si elles sont inoculées avec des microbes, les billes de verre présentent des surfaces sur lesquelles les bactéries peuvent se fixer.

Le bocal en verre peut être fermé pour maintenir la stérilité et le système est conçu pour permettre un espace libre et une circulation d’air suffisants, évitant ainsi un environnement saturé d’humidité. Les bocaux conviennent à la croissance prolongée de différentes espèces végétales et peuvent être agrandis et réduits à l’aide de bocaux de différentes tailles. Ici, les applications de six espèces végétales sont présentées, couvrant les graminées C3 et C4, les dicotylédones et les légumineuses. Parmi eux, on trouve les espèces modèles A. thaliana (dicotylédone), Brachypodium distachyon (monocotylédones C3), Medicago truncatula (légumineuses), ainsi que des espèces cultivées telles que Solanum lycopersicum (tomate, dicotylédone), Triticum aestivum (blé, monocotylédones C3) et Sorghum bicolor (sorgho, monocotylédones C4). Le protocole présenté comprend la configuration expérimentale du système, la stérilisation et la germination des semences de six espèces végétales, la transplantation de semis dans des bocaux, différents milieux de croissance, l’inoculation des microbes, l’échantillonnage de l’exsudat racinaire et le traitement de l’exsudat pour l’analyse.

Protocole

1. Préparation des semis : Stérilisation de surface des graines

REMARQUE : La stérilisation de surface des semences et toutes les étapes suivantes doivent être effectuées dans des conditions stériles, sauf indication contraire. Les étapes 1.1 à 1.4 sont spécifiques à la stérilisation de surface des graines d’A. thaliana . D’autres espèces végétales présentent d’autres variations dans la taille des tubes (en fonction du nombre de graines et de la taille des graines), du temps passé dans les solutions et des solutions de stérilisation (tableau 1).

1. Ajouter les graines dans un tube de microcentrifugation (maximum 20 mg de graines) et recouvrir les graines de 70% d’éthanol.
   ATTENTION : L’éthanol est inflammable. Ne pas utiliser à proximité d’une flamme nue.
2. Déplacez les tubes fermés de la microcentrifugeuse dans un agitateur pendant 15 minutes et réglez la rotation de manière à ce que les graines soient doucement agitées.
3. Retirez délicatement l’éthanol à 70 % à l’aide d’une pipette et remplacez-le par de l’éthanol à 100 %. Répétez l’étape 1.2.
4. Retirez l’éthanol à 100 % et séchez les graines en laissant les couvercles des tubes de la microcentrifugeuse ouverts dans un flux d’air stérile.
5. Une fois que les graines sont sèches, étalez-les uniformément sur un milieu 0,5x Murashige et Skoog (MS) avec 0,7 % de gélose phyto en effleurant le tube ou en utilisant une pince stérile. Fermez les plaques de gélose et scellez-les avec du ruban microporeux de 1,25 cm.
6. Placez les plaques horizontalement sur une étagère dans la chambre de culture (16 h lumière/8 h obscurité, 22 °C jour/18 °C nuit, 150-160 μmol ^{m-2 s-1}).

2. Préparation des semis : Transfert des graines germées dans des assiettes fraîches

REMARQUE : Les étapes suivantes sont spécifiques à A. thaliana et ne sont pas nécessaires pour d’autres espèces.

1. Après la germination, transférer 5 à 6 plantules dans de nouvelles plaques de gélose phyto à 0,7 % avec un milieu MS 0,5x en plaçant les plantules linéairement, à environ 3 cm du sommet (voir la position de la rosette sur la figure 2D).
2. Sceller les plaques de gélose avec du ruban adhésif microporeux de 1,25 cm et les faire pousser verticalement dans la chambre de croissance (figure 2D) jusqu’à ce que les plantules soient prêtes à être transférées dans des bocaux 15 à 18 jours après la germination (tableau 2).

3. Préparation du système hydroponique : Installation du bocal

1. Ajouter 150 ml de billes de verre propres de 5 mm dans chaque bocal propre et fermer avec le couvercle (figure 1A).
   REMARQUE : Dans ce protocole, les perles de verre de 5 mm conviennent à la plupart des espèces²², mais la taille des perles peut être ajustée si vous le souhaitez.
2. Placez suffisamment de papier d’aluminium sur les bocaux fermés pour couvrir la jonction couvercle-bocal et autoclaver (121 °C pendant 20 min) (Figure 1B).
3. Gardez les bocaux préparés couverts jusqu’à ce que les plantes soient prêtes à être transférées (tableau 2).

4. Préparation du système hydroponique : Ajout de semis

1. Lorsque les plants sont prêts à être transférés dans des bocaux (tableau 2), retirez le papier d’aluminium et les couvercles des bocaux dans la paillasse stérile.
2. Si les bocaux doivent être inoculés avec des bactéries, effectuez les étapes suivantes avant de passer à l’étape 4.3 ; sinon, ignorez l’étape 4.2.
   1. À l’aide d’une boucle d’inoculation stérile, prélever des colonies individuelles à partir de cultures bactériennes pures sur des plaques de gélose et les suspendre dans 750 μL de 10 mM MgCl₂ stériles. Répétez l’opération jusqu’à ce que la solution soit trouble.
   2. Facultatif : Laver la suspension 3 fois avec 750 μL de 10 mM MgCl stérile₂ par centrifugation de 5 min à 1 000 × g et à température ambiante, puis retirer le surnageant et remettre en suspension la pastille dans 750 μL de 10 mM MgCl₂.
   3. Facultatif : En cas d’inoculation de plusieurs espèces bactériennes différentes, mélanger les suspensions de souches individuelles préparées aux étapes 4.2.1 à 4.2.2 dans des proportions égales avant de continuer.
   4. Ajustez la densité optique à la longueur d’onde de 600 nm (OD₆₀₀) à 0,2-0,4 dans un milieu MS 0,5x (pH 5,7 à 5,9, ajusté avec KOH) ou un autre milieu de culture de votre choix (voir étape 4.3). Mesurez à nouveau le diamètre extérieur₆₀₀ pour vérifier si la solution a été correctement diluée.
      ATTENTION : Le KOH est corrosif ; Portez des gants et une blouse de laboratoire.
   5. Diluer la suspension jusqu’à OD₆₀₀ 0,002-0,004 dans le même milieu (dilution 1 :100).
      REMARQUE : Les densités cellulaires finales dépendent de la souche bactérienne utilisée, mais d’après notre expérience, cet inoculum correspond à environ 3-6 × 10^{5 cellules mL-1}.
   6. Ajouter 35 mL de la dilution finale par pot. Ajouter 35 mL de milieu de culture stérile pour contrôler les bocaux. Remuez les perles pour les enrober uniformément de substrat MS 0,5x avant le transfert de la plante afin que les racines ne sèchent pas. Passez à l’étape 4.4.
3. Ajouter 35 mL de milieu 0,5x MS dans chaque pot (pH 5,7 à 5,9, ajuster avec KOH). Remuez les perles pour les enrober uniformément de substrat MS 0,5x avant le transfert de la plante afin que les racines ne sèchent pas.
   REMARQUE : Le milieu de culture peut être modifié, par exemple, par l’élimination des nutriments, l’ajout d’osmolytes pour induire un stress salin ou l’utilisation de différentes valeurs de pH ou de milieux de croissance. ATTENTION : Le KOH est corrosif ; Portez des gants et une blouse de laboratoire.
4. Placez 3 à 5 plantes d’A. thaliana dans un bocal en plaçant les systèmes racinaires entre les billes de verre.
   REMARQUE : Le nombre de plants par bocal est différent pour les autres espèces (tableau 2).
5. Déplacez les billes à l’aide d’une pince ou d’une cuillère stérile pour couvrir les racines et soulever les feuilles hors du substrat (figure 1C).
   REMARQUE : Déplacez soigneusement les plantes et les perles pour éviter de casser les racines et de stresser les plantes.
6. Ajoutez 2 bandes de ruban adhésif microporeux de 1,25 cm sur le dessus des bocaux et placez délicatement le couvercle sur le dessus (Figure 1D-F).
   REMARQUE : N’appuyez pas sur le couvercle pour éviter d’obstruer l’échange d’air.
7. Couvrez l’espace entre le couvercle et le bocal avec du ruban adhésif microporeux de 2,5 cm pour maintenir la stérilité tout en permettant l’échange d’air, et placez les bocaux dans une chambre de culture (Figure 1G,H).
8. Mettre en place 4 à 8 bocaux par condition expérimentale, en fonction de la question biologique et de la variabilité attendue.
9. Assurez-vous d’inclure des témoins biologiques négatifs (p. ex., des bocaux sans plantes) pour tenir compte du fond métabolitique du système expérimental. Établir le même nombre de répétitions pour les témoins négatifs que pour les traitements expérimentaux (p. ex., quadruplicés).
10. Pour les périodes de croissance prolongées, remplacez le milieu de culture chaque semaine : retirez le reste du milieu de culture à l’aide d’une pipette jaugée de 25 mL et ajoutez 35 mL de milieu frais.

5. Collecte d’exsudats racinaires

1. Lorsque les plantes atteignent l’âge souhaité, retirez le ruban microporeux de 2,5 cm et le couvercle dans la paillasse stérile.
   NOTE : Dans nos conditions de croissance, 21 jours après la germination représentent un stade végétatif mature avant le début de la floraison. Le stade de développement végétatif est spécifique à l’espèce végétale et le moment de la période de croissance change avec les espèces végétales ; Ce délai peut être modifié en fonction de la question de recherche.
2. Pour les tests de stérilité, aliquote 20 μL de milieu de culture et pipeter sur des plaques de gélose LB.
   1. Pour les bocaux inoculés, aliquote 100 μL de milieu de culture à utiliser pour le dénombrement des unités formant colonie (UFC) (p. ex., dans une série de dilution²³).
      REMARQUE : D’après notre expérience, les densités bactériennes varient entre 10^{5 et 8} cellules vivantes ^mL-1 du milieu de culture.
3. Retirer le plus de milieu de culture possible à l’aide d’une pipette jaugée de 25 mL, en évitant d’endommager les racines.
4. Ajouter 50 mL de milieu collecteur (p. ex., 20 mM d’acétate d’ammonium ; pH 5,7-5,9 ajusté avec HCl) en pipetant le long des parois du bocal pour éviter de mouiller les feuilles. Fermez les bocaux avec des couvercles et incubez-les dans des conditions stériles pendant le temps souhaité de collecte de l’exsudat. Pour les expériences sensibles au temps, 2 h est une bonne fenêtre de collecte.
   ATTENTION : Le HCl est corrosif ; Portez des gants et une blouse de laboratoire. Pour des temps de collecte de l’exsudat racinaire plus longs, enveloppez à nouveau les couvercles avec du ruban adhésif et déplacez les bocaux dans la chambre de croissance.
5. Après 2 h, prélever la quantité désirée de milieu de collecte dans des tubes (p. ex., 50 mL pour les dosages ou les analyses utilisant des exsudats concentrés, ou 2 mL pour une utilisation directe). Conservez les exsudats racinaires collectés à -80 °C jusqu’à ce qu’ils soient traités ou analysés ultérieurement.
   1. Lorsque vous travaillez avec des bocaux inoculés, centrifugez les exsudats collectés pendant 10 min à 5 000 × g et 4 °C et n’utilisez que des surnageants pour l’analyse. Vous pouvez également filtrer les exsudats à l’aide d’un filtre de 0,22 μm ou de 0,45 μm.
6. Si l’expérience fait partie d’une série chronologique, retirer tout le milieu de collecte restant des bocaux et ajouter 35 mL de milieu MS 0,5x. Replacez le couvercle et le ruban adhésif de 2,5 cm avant de remettre les bocaux dans la chambre de culture.
7. Mesurez le poids frais des racines et des pousses de toutes les plantes dans un bocal pour normaliser ultérieurement les exsudats racinaires en fonction du poids de la plante.
   REMARQUE : Des tissus végétaux peuvent être échantillonnés en plus si vous le souhaitez.

6. Traitement des exsudats racinaires pour la spectrométrie de masse

1. Selon la méthode d’analyse, lyophiliser les exsudats racinaires pour les concentrer et éliminer le milieu collecteur (-80 °C à 0,37 mbar jusqu’à ce qu’il n’y ait plus de liquide). Conserver à -80 °C jusqu’au moment de l’analyse.
   NOTE : Les données présentées ici ont été générées à l’aide d’une analyse TOF-MS par injection de flux sur un instrument de mesure du temps de vol quadripolaire de masse précise.
2. Avant l’injection dans l’instrument d’analyse, reconstituer les exsudats lyophilisés ou diluer les exsudats racinaires non traités avec un milieu de collecte en fonction du poids frais de la racine.
   REMARQUE : Le milieu de collecte a été choisi pour être compatible avec le spectromètre de masse. Cependant, selon la méthode d’analyse, des étapes de dessalage peuvent être nécessaires avant l’injection.

Résultats

Le système expérimental présenté ici permet de contrôler les facteurs expérimentaux et environnementaux modifiant les profils d’exsudation racinaire. Nous avons comparé la croissance d’A. thaliana dans différentes conditions d’éclairage, l’âge et la densité des plantes dans deux laboratoires différents (Figure 3). Les plantes semblaient en bonne santé dans tous les laboratoires (figures 3A, B). Les conditions de jours courts (10 h de lumière contre 16 h de lumière, figure 3) ont entraîné une masse racinaire plus élevée que les conditions de jours longs (figure 3C,D). De même, la masse racinaire totale de tous les végétaux cultivés en jours longs était plus faible qu’en jours courts (figure 3C). Dans l’ensemble, la variabilité de la croissance à l’intérieur et entre les bocaux était faible d’un laboratoire à l’autre.

Le système de bocaux en verre est compatible avec une variété d’espèces végétales et de stades de développement. Le critère d’évaluation de l’analyse de l’exsudat racinaire est généralement de 21 jours, car dans nos conditions expérimentales, de nombreuses espèces végétales sont au stade végétatif mature avant de passer au stade de reproduction (figure 4A-E). Les plantes peuvent facilement être retirées du système expérimental sans endommager visiblement le système racinaire. Ainsi, il est facile de déterminer le poids des tissus ou d’utiliser les tissus pour l’analyse en aval. Les poids de pousses les plus élevés ont été observés pour le blé, suivi du sorgho et de la tomate. Les poids de racines les plus élevés ont été observés pour le sorgho, suivi du blé et de M. truncatula. Le rapport racine/pousse diffère d’une espèce à l’autre. Dans l’ensemble, le poids des tissus variait entre 100 mg et 800 mg.

Un aspect central des systèmes expérimentaux permettant la collecte d’exsudat racinaire est l’inoculation contrôlée avec des microbes pour étudier les interactions plantes-microbes dans un environnement défini. Le système expérimental présenté peut être maintenu stérile même avec des manipulations répétées (voir la condition « témoin » dans la figure 5), et des bactéries peuvent être ajoutées et maintenues pendant de longues périodes. Lorsque des plants d’A. thaliana âgés de 33 jours ont été inoculés avec un mélange de bactéries commensales à OD₆₀₀ 0,004, les bactéries ont persisté pendant 12 jours, ce qui était la durée totale de l’expérience (figure 5). Le nombre d’unités formant des colonies a même été multiplié par 100 dans le milieu de culture et a également colonisé les racines (figure 5C). Les phénotypes des plantes inoculées étaient impossibles à distinguer de ceux des plantes stériles (figure 5A,B).

Le système expérimental présenté permet de recueillir l’exsudat dans de nombreuses conditions expérimentales. Nous présentons ici les profils d’exsudation d’A. thaliana Col-0 prélevés soit dans l’acétate d’ammonium, soit dans l’eau des mêmes plantes consécutivement (Figure 6A). Les exsudats ont été stockés à -80 °C jusqu’à l’analyse, normalisés par le poids des racines et analysés par spectrométrie de masse. Des échantillons de bocaux contenant des plantes ont été filtrés par rapport à des témoins expérimentaux (bocaux sans plantes). Sur 2 163 métabolites, 436 présentaient un signal supérieur au bruit de fond (20,16 %) et ont été retenus pour analyse. Parmi ceux-ci, 416 ou 95 % des composés ont montré une abondance distincte entre les conditions expérimentales. Cependant, 26 métabolites n’ont pu être attribués à aucun type de composé et ne sont donc pas définis. La plupart des métabolites (406 ou 98 %) étaient plus abondants dans les exsudats recueillis dans l’eau. L’accumulation consécutive d’exsudats d’abord dans l’acétate d’ammonium et plus tard dans l’eau pourrait avoir un impact sur le profil d’exsudation, car les signaux métaboliques pourraient se diluer avec le temps. Cependant, le signal d’exsudation presque exclusivement plus élevé dans l’eau recueillie comme deuxième point temporel ne soutient pas cette hypothèse : la collecte d’exsudat dans l’eau pure crée probablement un choc osmotique pour les plantes, ce qui provoque l’augmentation de l’abondance des métabolites par rapport à un solvant de collecte équimolaire à la solution de croissance (20 mM d’acétate d’ammonium est équimolaire à 0,5x MS milieu). L’étude des classes chimiques de composés identifiés dans les deux conditions de croissance a montré que la majorité des composés sont des acides organiques et des dérivés (28,6 %), suivis des composés organiques oxygénés (18 %), des composés organohétérocycliques (14,2 %) et des lipides (13,2 %). Seul un petit sous-ensemble de métabolites appartient aux phénylpropanoïdes et polycétides (8,7 %) et aux benzénoïdes (6 %). Les composés organiques azotés, les nucléosides, les composés organosulfurés, les alcaloïdes, les lignanes et les composés apparentés représentent entre 2 % et 0,5 % des composés classés (figure 6B). La distribution des métabolites décrite ici correspond à des données déjà publiées à l’aide d’autres types de systèmes de collecte d’exsudats racinaires²⁴.

Figure 1 : Configuration du bocal en verre. (A) Pot avec des perles de verre. (B) Bocal avec des billes de verre prêtes à être autoclavées. (C) Semis en bocaux (vue de dessus). (D) Semis dans un bocal (vue de dessus) avec du ruban microporeux de 1,25 cm. (E) Semis en bocaux (vue de côté) avec ruban microporeux de 1,25 cm. (F) Semis en bocaux (vue latérale) avec ruban microporeux de 1,25 cm et couvercle. (G) Configuration complète du bocal avec les semis dans des bocaux (vue latérale) avec ruban microporeux de 1,25 cm, couvercle et ruban microporeux de 2,5 cm. (H) Terminez la configuration du bocal (vue de dessus). (I) Plantes âgées de 21 jours et prêtes à être récoltées (vue de dessus). Taille du pot 147 mm de hauteur x 100 mm de diamètre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Plantules stérilisées en surface sur des plaques de gélose moyenne 0,5x Murashige et Skoog dans une chambre de croissance. (A) Arabidopsis thaliana (6 jours), (B) Brachypodium distachyon (6 jours), (C) Medicago truncatula (6 jours), (D) A. thaliana (18 jours). Taille de la plaque de gélose 120 mm x 120 mm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Plants d’Arabidopsis thaliana Col-0 cultivés en bocaux dans des conditions de lumière de jours courts et longs. (A) Pot contenant trois plants âgés de 33 jours cultivés en jours courts (10 h de lumière/14 h d’obscurité, 220 μmol ^{m-2 s-1} d’intensité lumineuse, 21 °C le jour/18 °C nuit) et (B) bocal contenant cinq plants de 21 jours cultivés en jours longs (16 h de lumière/8 h d’obscurité, 150-160 μmol ^{m-2 s-1} intensité lumineuse, 22 °C jour/18 °C nuit). Poids racinaire de (C) de toutes les plantes d’un pot et (D) de plantes individuelles. ** représentent les valeurs de signification du test t (p < 0,05). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Cinq espèces phylogénétiquement distinctes au jour 21 dans le système de bocaux en verre stérile. (A) monocotylédones modèle Brachypodium distachyon, (B) légumineuse modèle Medicago truncatula, (C) dicotylédones Solanum lycopersicum (tomate), (D) dicotylédones Sorghum bicolor, (E) monocotylédones Triticum aestivum (blé). (F) Poids frais des racines et des pousses de l’espèce cultivées dans des bocaux en verre. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Arabidopsis thaliana Col-0 (33 jours) cultivé dans des conditions de jours courts. (A) Dans une configuration stérile ou (B) inoculé pendant 12 jours avec un consortium de bactéries commensales. (C) Unités formant des colonies pour bocaux stériles (témoins) et inoculés du substrat de croissance (à gauche) et de la racine (à droite). N = 4 bocaux pour la condition de contrôle stérile, et n = 8 bocaux pour la condition inoculée. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Profils distincts de l’exsudat racinaire d’A. thaliana Col-0 âgé de 21 jours. Les exsudats ont été prélevés pendant 2 h dans de l’acétate d’ammonium stérile de 20 mM (pH 5,7), suivis de 2 h dans de l’eau déminéralisée filtrée stérile. Les métabolites ont été détectés par spectrométrie de masse par injection directe. (A) Analyse en composantes principales de 436 métabolites détectés au-dessus du niveau de fond (comparaison de bocaux avec plantes et de bocaux sans plantes). PC : composante principale avec explication de la quantité de variance. Bleu : exsudats collectés par l’eau, jaune : exsudats collectés par l’acétate d’ammonium. (B) Diagramme circulaire de 416 métabolites significativement différents selon les conditions expérimentales (test de Tukey) colorés selon la superclasse (https://cfb.fiehnlab.ucdavis.edu/). Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Espèce		Préparation des semences	Temps dans de l’éthanol à 70% (min)	Concentration d’hypochlorite de sodium (NaClO) (v/v % d’eau de Javel)		Temps d’utilisation de l’eau de Javel (min)
Arabidopsis thaliana			15	Aucun; 100% éthanol		15
Brachypodium distachyon*		Décortiquer	0.5	6		5
Medicago truncatula*a			30	6		30
Solanum lycopersicum*			0.5	6		5
Sorgho bicolore*		Décortiquer	0.5	6		30
Triticum aestivum*		Décortiquer	0.5	12		20

Tableau 1 : Méthodes de stérilisation des semences de surface pour plusieurs espèces. *Lavé 4 à 5 fois avec de l’eau déminéralisée filtrée entre l’éthanol et l’eau de Javel et à la fin ; ^uneincubation de 3 à 6 h après l’eau de Javel, en remplaçant par de l’eau déminéralisée filtrée toutes les 30 min.

Espèce	Jour aux bocaux	Nombre de plantes
Brachypodium distachyon	4 à 5	3
Sorgho bicolore	4 à 5	3
Triticum aestivum	4 à 5	2
Medicago truncatula	5 à 6	3
Solanum lycopersicum	7 à 8	3
Arabidopsis thaliana	17	3 à 5

Tableau 2 : Âge des semis en jours pour le transfert dans des bocaux et nombre de plants par pot pour diverses espèces végétales.

Discussion

Le système expérimental présenté ici est basé sur des bocaux en verre et des billes de verre et fournit ainsi un système semi-hydroponique simple, nécessitant peu d’entretien et polyvalent pour étudier l’exsudation racinaire dans divers contextes. Il a été utilisé dans des études portant sur les profils d’exsudation de différentes espèces végétales²⁵, les réponses de l’exsudation à différentes conditions de croissance²⁵, ainsi que l’influence des propriétés physico-chimiques du sol sur l’exsudation²². Le système convient à toutes les espèces végétales testées ici pour des périodes de croissance prolongées, allant de quelques semaines à plusieurs mois. Le maintien des conditions stériles est simple, tout comme l’inoculation de bactéries, qui persistent pendant la période de croissance de 2 semaines analysée. Ainsi, le système expérimental permet non seulement une collecte contrôlée des exsudats racinaires dans des conditions stériles, mais il peut également être utilisé pour étudier les interactions plantes-microbes. De plus, les milieux de croissance des plantes peuvent être modifiés pour étudier les réponses métaboliques à différents niveaux de nutriments, et les périodes de croissance peuvent être ajustées en adaptant les conditions d’éclairage ou en utilisant des bocaux de différentes tailles.

L’étude des exsudats racinaires dans des conditions hydroponiques ou semi-hydroponiques reste la norme sur le terrain, principalement en raison de la résolution accrue des métabolites à faible concentration¹¹. De nombreuses approches hydroponiques reposent sur des boîtes de Pétri, des plaques multipuits ou d’autres petits récipients permettant la stérilité et un débit élevé, mais limitant l’expérimentation à de petites plantes ou à des semis cultivés dans des environnements très humides 17,18,26,27. Dans la configuration de bocaux en verre présentée, un espace de tête suffisant est fourni par les bocaux de taille comparable, ce qui permet des périodes de croissance prolongées. Les bandes de ruban microporeux assurent l’échange d’air tout en maintenant la stérilité. Ainsi, même les grandes monocotylédones telles que l’orge et le maïs peuvent être cultivées dans le bocal en verre pendant plusieurs semaines. Les petites plantes telles que A. thaliana et le trèfle peuvent être étudiées pendant 4 à 5 semaines après la germination, y compris les stades végétatif et reproducteur.

Des installations hydroponiques alternatives sont également disponibles pour les plantes plus grandes, mais celles-ci nécessitent souvent des boîtes et des entrées sur mesure en treillis, des panneaux de mousse et des paniers de greffe pour le support des plantes 15,28,29,30. De plus, ces dispositifs ne sont généralement pas configurés pour être stériles, ou ils nécessitent des procédures d’installation et d’entretien difficiles pour les garder exempts de contaminations microbiennes et/ou chimiques. L’installation et le maintien de la stérilité dans le système expérimental présenté sont simples. De plus, l’utilisation du verre pour les bocaux et les billes réduit la présence de contaminants lessivés par les plastiques et permet d’économiser des ressources car il peut facilement être lavé et réutilisé.

Des billes de verre ont déjà été appliquées pour imiter les particules du sol. Ils induisent le développement naturel des racines dans les dispositifs d’échantillonnage de l’exsudation racinaire tels que les pièges à exsudation³¹ ou d’autres systèmes semi-hydroponiques¹⁹. La configuration du bocal en verre tire parti de ce développement et introduit les billes comme surface de colonisation pour les microbes. Dans le sol, le microbiome autour des racines des plantes évolue dans un environnement semi-solide, avec des particules compactes et des espaces remplis d’air ou d’eau. Même si la configuration du bocal en verre n’inclut pas d’aération active du milieu de culture, ce qui fait que la phase liquide inférieure ne contient probablement pas des niveaux optimaux d’oxygène, la combinaison d’un plus grand volume de billes avec un volume de milieu de croissance plus petit crée une phase supérieure humide mais aérée où les microbes peuvent se développer dans des conditions oxiques. D’autres ont proposé de secouer des récipients de croissance^26,28 ou d’utiliser des tubes couplés à des pompes à air^19,29 pour maintenir l’alimentation en air dans les systèmes de culture hydroponique. Cependant, ces systèmes sont soit configurés pour ne pas être stériles, soit nécessitent du matériel spécialisé et une surveillance constante pour maintenir la stérilité. De plus, en cas de secousses, faites très attention à éviter l’immersion des pousses dans les solutions de croissance et les dommages aux systèmes racinaires. Néanmoins, si l’on le souhaite, le dispositif expérimental présenté peut être adapté avec du matériel supplémentaire pour l’aération.

Un aspect crucial à prendre en compte dans toutes les études d’interaction plantes-microbes portant sur le métabolisme est que les microbes dégradent les composés d’origine végétale et produisent des métabolites par eux-mêmes. En l’absence d’un dispositif expérimental stérile spécialisé, il n’est pas possible de faire la distinction entre les métabolites dérivés des plantes et des microbes. Pour inhiber l’activité microbienne et enrichir les composés d’origine végétale, Oburger et al. ont proposé de stériliser chimiquement la solution d’échantillonnage d’exsudat racinaire pour inhiber la dégradation bactérienne³². L’effet des inhibiteurs chimiques a pu être étudié dans le système expérimental présenté, en comparant les profils d’exsudation des plantes stériles et non stériles traitées avec ou sans l’inhibiteur.

L’une des principales limites de la configuration du bocal en verre présentée est que les conditions de croissance restent très artificielles par rapport au sol. Les exsudats des plantes cultivées au sol sont souvent collectés soit à partir de systèmes de percolation¹³, où les flux de solvants sont recueillis à la base de récipients de croissance, soit de systèmes hybrides sol-hydroponie, où les plantes sont d’abord cultivées dans le sol, puis transférées dans des conditions hydroponiques ^16,33. Contrairement à la configuration du bocal en verre, ces procédures sont généralement destructrices, ne permettant pas de multiples collectes au fil du temps dans des environnements de croissance changeants. De plus, alors que dans les systèmes de percolation, le fond du sol est échantillonné avec les exsudats, dans les systèmes hybrides sol-hydroponie, le problème du fond métabolique élevé du sol est contourné par le transfert dans des conditions hydroponiques pour la collecte de l’exsudat. Bien que des temps de récupération aient été mis en place pour réduire les fuites de métabolites via les racines blessées¹¹, le transfert de la plante est très perturbateur et les plaies sont susceptibles de persister, et le métabolisme de la plante peut changer en réponse au transfert dans des conditions hydroponiques. De plus, dans de nombreux cas, un choc osmotique est induit par le transfert des plantes dans l’eau au lieu d’une solution de croissance appropriée^16,33. Dans le protocole présenté, la solution de croissance est échangée avec une solution équimolaire pour maintenir l’équilibre osmotique, tout en permettant de capturer l’exsudation dans une fenêtre de temps courte et définie. Le changement de solution de croissance est une pratique courante dans de nombreuses études publiées et peut facilement être réalisé dans des installations hydroponiques sans blessure des racines 12,16,26,34. En raison de sa polyvalence, le système expérimental présenté peut facilement être adapté pour imiter des conditions plus naturelles, par exemple, en utilisant un extrait de sol stérile ou non stérile comme solution de croissance avec ou sans présence de particules solides du sol. Le passage progressif aux conditions naturelles permet d’étudier l’impact des différentes propriétés physico-chimiques du sol et de la présence microbienne sur le métabolisme et la physiologie des plantes. Avant que la communauté scientifique n’ait une bonne compréhension de l’exsudation dans divers environnements, il est souhaitable d’utiliser des systèmes à base de sol et hydroponiques en parallèle, car les deux configurations ont leurs avantages et leurs limites¹³.

En conclusion, le dispositif expérimental semi-hydroponique à base de verre présenté se distingue par sa simplicité combinée à une grande polyvalence d’applications. Il s’agit d’un moyen accessible et peu coûteux de collecter et d’étudier l’exsudation dans des conditions stériles, ou en combinaison avec des microbes et des interactions plantes-microbes.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Poudre de gélose pour bactériologie	VWR	20767.298
Feuille d’aluminium	FORA GmbH
Acétate d’ammonium	Sigma-Aldrich	32301-1KG	Réactif ACS, Eur >- 98 %
Autoclave VX-150	Systec	1150
Balance	Sartorius	QUINTIX64-1S
Centrifugeuse	Hermle Labortechnik GmbH	305.00 V05
Cuvettes	Greiner Bio-One	613101
Difco LB Broth, Lennox	BD	240210
Ethanol	Reuss-Chemie AG	RC-A15-A-005L
Eau déminéralisée filtrée	Merck	Millipore Milli-Q IQ7000
Perles de verre	Carl Roth	HH56.1	5 mm
Acide chlorhydrique	Merk	1.00317.1000
Boucle d’inoculation	Karl Hammacher GmbH	HWO_070-21
Bocaux	Weck	105741	850 mL
Lyophilisateur	Christ	Alpha 2-4 LSCplus
Chlorure de magnésium hexahydraté	Carl Roth	2189.1
Agitateur thermique Matrix Orbital	IKA	10006248
Tube de microcentrifugation	Sarstedt AG & Co. KG	72.695.500	Tube de réaction SafeSeal, 2 mL,
PP Ruban micropore  ;	3M	1530-0	1,25 cm x 9,1 m
Ruban microporeux	3M	1530-1	2,5 cm x 9,1 m
Murashige & Skoog Medium (MS)	Duchefa Biochemie	M0221.0050
Chambre de croissance	Percival	SE41-TLCU4	16 heures clair/8 foncé. 22 ° ; C jour/18 nuit
Phyto agar	Duchefa Biochemie	P1003.1000
Hydroxyde de potassium	Sigma-Aldrich	8.14353.0100
Spectrophotomètre SmartSpec Plus Bio-Rad	170-2525		d’hypochlorite
de sodium, 12 %	Cl Carl Roth	9062.4
Boîte de Pétri carrée	Greiner Bio-One	688102	120x120x17 mm, avec évents
Stericup Quick release	Millipore	S2GPU05RE	0,22 & micro ; m PES, 500 mL
Banc stérile	FASTER S.r.l.	FlowFast H 18