Visualisation des protéines de faible abondance et des modifications post-traductionnelles dans des embryons de drosophile vivants par injection d’anticorps fluorescents

L’immunofluorescence est une technique fondamentale de la biologie cellulaire moderne développée à l’origine par Albert Coons, qui permet de détecter des molécules dans leurs compartiments cellulaires natifs et de caractériser les compositions moléculaires d’organites ou de machineries subcellulaires¹. Couplée à des manipulations génétiques, l’immunofluorescence permet d’établir le concept désormais bien accepté selon lequel la localisation des protéines est essentielle à leur fonction². Outre les anticorps primaires spécifiques et les colorants fluorescents brillants, le succès de cette technique repose sur un processus préliminaire appelé fixation et perméabilisation, qui préserve les morphologies cellulaires, immobilise les antigènes et augmente l’accessibilité des anticorps dans les compartiments intracellulaires. Inévitablement, le processus de fixation et de perméabilisation tuerait les cellules et mettrait fin à tous les processus biologiques³. Par conséquent, l’immunofluorescence ne fournit que des instantanés du parcours de vie des protéines. Cependant, de nombreux processus biologiques tels que la migration et les divisions cellulaires sont de nature dynamique, ce qui nécessite l’étude des comportements des protéines d’une manière spatio-temporellement résolue ^4,5.

Pour étudier la dynamique des protéines dans les organismes vivants, des méthodes d’imagerie en direct basées sur des protéines fluorescentes génétiquement codées telles que la protéine fluorescente verte (GFP)⁶ et des microscopes confocaux à grande vitesse ont été développées. En bref, la protéine d’intérêt peut être manipulée génétiquement pour être fusionnée avec la GFP⁷, puis exprimée de manière ectopique à partir de promoteurs viraux ou de levure tels que le cytomégalovirus (CMV)⁸ ou la séquence d’activation en amont (UAS)⁹. Étant donné que la GFP est de nature autofluorescente, aucun anticorps couplé à des fluorophores n’est nécessaire pour révéler la localisation des protéines cibles, ce qui contourne la nécessité de processus préliminaires de fixation ou de perméabilisation. Au cours des deux dernières décennies, des marqueurs fluorescents couvrant l’ensemble du spectre des longueurs d’onde ont été^{développés10}, permettant l’imagerie en direct multicolore de plusieurs protéines cibles en même temps. Cependant, par rapport aux colorants fluorescents chimiquement modifiés tels que AlexaFluor ou ATTO, l’autofluorescence de ces protéines fluorescentes génétiquement codées est relativement faible et instable lorsqu’elle est exprimée à partir de promoteurs endogènes, en particulier lors de l’imagerie en direct sur des échelles de temps plus longues¹⁰. Bien que ce déficit puisse être atténué par une surexpression des protéines cibles marquées par fluorescence, beaucoup d’entre elles ayant des activités enzymatiques telles que les kinases et les phosphatases perturbent gravement les processus biologiques normaux si elles ne sont pas exprimées à des niveaux physiologiques.

Ce protocole présente une méthode qui permet l’illumination de la cible photostable à base d’anticorps dans une configuration d’image en direct, permettant essentiellement l’immunofluorescence sans processus de fixation ou de perméabilisation (Figure 1). Grâce à une simple réaction d’amine primaire basée sur le NHS¹¹, on peut conjuguer des colorants fluorescents tels que AlexaFluor 488 ou 594 avec essentiellement n’importe quel anticorps primaire ou GFP/HA/Myc nanobody¹². En tirant parti d’une caractéristique de développement selon laquelle toutes les cellules embryonnaires de la drosophile partagent un cytoplasme commun au stade¹³ du syncytium, il est possible d’obtenir une liaison à l’antigène et une illumination sur des embryons entiers après l’injection d’anticorps conjugués à un colorant. Avec l’expansion des bibliothèques de protéines marquées de manière endogène disponibles chez la drosophile et d’autres systèmes modèles¹⁴, cette méthode peut potentiellement élargir les applications de ces bibliothèques en révélant la dynamique des protéines marquées par fluorescence de faible abondance et d’autres protéines non marquées par fluorescence (marquées HA/Myc) dans les tissus vivants.

Les expériences ont été menées conformément aux directives et à l’approbation de l’École des sciences de la vie de l’Université SUSTech. L’organisme utilisé est Drosophila melanogaster, et les génotypes sont Notch-Knockin-GFP (chromosome X) et Sqh-sqh-GFP (chromosome II), généreusement fournis par les laboratoires du Dr François Schweisguth (Institut Pasteur) et du Dr Jennifer Zallen (Institut Sloan Kettering), respectivement. Bien que ce protocole se concentre principalement sur les aspects du marquage des anticorps et de l’imagerie en direct, veuillez vous référer aux rapports publiés pour des descriptions plus détaillées de la collecte et de l’injection d’embryons de drosophile ^15,16.

1. Marquage fluorescent des anticorps

1. De préférence, utilisez des anticorps monoclonaux ou des nanocorps pour la protéine d’intérêt. Préparer la concentration mère d’anticorps à 1 mg/mL ou plus.
   NOTA : Dans cette étude, le nanocorps GFP (voir le tableau des matériaux) est utilisé à titre d’exemple. Le nanocorps GFP disponible dans le commerce est conditionné à une concentration de 1,0 mg/mL et à un volume de 250 μL. De plus, un kit de marquage d’anticorps disponible dans le commerce (voir le tableau des matériaux) est utilisé, qui conjugue Alexa Fluor 594 aux amines primaires des protéines par une réaction d’ester de succinimidyle¹¹. Il est important de noter que ce processus de marquage ne modifie pas de manière significative la concentration d’anticorps.
2. Préparez une solution de bicarbonate de sodium de 1 M en remettant en suspension le composant B (fourni dans la trousse d’étiquetage des anticorps) dans 1 mL d’eau déminéralisée.
3. Ajustez la concentration d’anticorps à 1,0 mg/mL, puis ajoutez 1/10^ème volume (10 μL pour 100 μL de nanocorps GFP) de la solution de bicarbonate de sodium 1 M.
4. Ajouter 110 μL du mélange d’anticorps (à partir de l’étape 1.3) directement dans le tube contenant le colorant Alexa Fluor 594. Retourner pour mélanger (ne pas vortex) et incuber sur un rotateur pendant 1 h à température ambiante.
5. Assemblez la colonne de purification à partir du kit de conjugaison (voir Tableau des matériaux). Préparez un lit de résine de 1,5 mL (fourni dans la trousse d’étiquetage des anticorps) et centrifugez la colonne à 1100 x g pendant 3 min à température ambiante (RT) pour éliminer l’excès de liquide de la résine.
6. Ajouter le mélange réactionnel (à partir de l’étape 1.4) goutte à goutte vers le haut de la colonne de résine et centrifuger à 1100 x g pendant 5 min à 4 °C pour recueillir l’anticorps marqué. L’anticorps prélevé doit être de couleur rose et le volume doit être légèrement inférieur à 100 μL. Conserver dans des tubes enveloppés dans du papier d’aluminium ou de couleur foncée à 4 °C.

2. Préparation des embryons de drosophile

1. Placez 200 drosophiles adultes nouvellement écloses dans une cage en plastique en forme de cylindre (diamètre = 5 cm, hauteur = 8 cm) avec un rapport mâle/femelle de 1 : 10. Scellez un côté avec un treillis métallique poreux pour la ventilation et l’autre côté avec une plaque de gélose à base de jus de fruits/pâte de levure.
2. Changez la plaque toutes les 12 h pendant trois jours avant le prélèvement d’embryons. Cela permet de synchroniser la ponte des œufs de la drosophile et d’améliorer l’efficacité de la collecte.
3. Le jour de l’injection, remplacer la cage par une assiette de jus de fruits avec un minimum de pâte de levure et prélever les embryons à 25 °C pendant 1 h. Si le premier cycle de collecte ne donne pas suffisamment d’embryons (<50 embryons), jetez la première plaque et répétez cette étape pour un deuxième cycle de collecte jusqu’à ce que plus de 100 embryons soient pondus en 1 h.
4. Retirez la plaque de la cage pour arrêter la ponte et incubez à 25 °C pendant encore 2 h pour obtenir des embryons âgés de 2 à 3 h. Le bon stade des embryons est essentiel pour le succès de l’injection d’anticorps.
5. Pour enlever la coquille d’œuf des embryons, ajouter 2 mL d’eau de Javel à 50 % dans l’assiette de jus de fruits et déloger délicatement les embryons de l’assiette à l’aide d’un pinceau (figure 2A-4). Souvent, les embryons seront déposés directement sur la pâte de levure. Dans ce cas, il est acceptable de badigeonner la pâte de levure dans la solution d’eau de Javel pour recueillir tous les embryons.
6. Incubez les embryons flottants dans de l’eau de Javel à 50 % pendant 2 min et faites tourner l’assiette de jus de fruits toutes les 30 s pour améliorer l’efficacité de l’élimination de la coquille d’œuf.
7. Transférez le mélange embryon/eau de Javel en le versant dans une crépine en nylon de 70 μm (figure 2A-7). Lavez soigneusement les embryons à l’aide d’une bouteille d’eau pour éliminer tout résidu d’eau de Javel et de pâte de levure. Séchez complètement la crépine cellulaire avec des serviettes en papier, en veillant à ce que tout excès d’eau autour des embryons soit éliminé.

3. Alignement et dessiccation de l’embryon

1. Préparez un gel d’agarose à 4 % de 5 cm x 5 cm x 0,5 cm (largeur, longueur, hauteur) (figure 2A-9) et laissez-le refroidir à température ambiante. Coupez un bloc d’agarose de 1 cm x 3 cm x 0,5 cm (largeur, longueur, hauteur) à l’aide d’une lame de rasoir propre et placez-le sur une lame de verre (figure 2A-2). Examinez le bloc de gel sous la lunette de dissection pour vous assurer que les bords sont coupés droits et que la surface est plane et sèche.
2. Transférez les embryons de la passoire sur le bloc de gel à l’aide d’un pinceau. Répartissez les embryons uniformément le long de la ligne médiane du bloc en brossant doucement. Idéalement, les grappes d’embryons sont séparées en embryons simples ou en doublets sans se toucher.
3. Préparez une pince à épiler avec deux pattes collées l’une à l’autre pour créer une seule pointe fine (figure 2A-5). Sous une lunette de dissection, prélevez des embryons individuels à l’aide de la pince à épiler et placez-les le long du bord long du bloc de gel. Alignez 20 à 30 embryons en vous assurant que leur axe antéro-postérieur est parallèle au bord (figure 2C).
4. Pipeter 10 μL de colle heptane (voir Tableau des matériaux) au centre d’une lamelle de 24 mm x 50 mm (figure 2A-1) et étaler la colle dans une zone rectangulaire de 0,5 cm x 3 cm à l’aide d’une pointe de pipette. Attendez que la colle sèche complètement avant de l’utiliser.
5. Placez la lame de verre avec le bloc de gel sur le bord du bureau, avec les embryons tournés vers l’extérieur. Soulevez la lamelle avec de la colle à l’aide d’une pince à épiler plate (Figure 2A-6) et maintenez-la immobile sur les embryons, le côté de la colle étant orienté vers les embryons à un angle incliné d’environ 45 degrés.
   REMARQUE : Appuyez doucement la lamelle contre le bloc de gel afin que les embryons soient en contact avec la colle, puis relâchez rapidement la pression et soulevez la lamelle. La quantité de tension appliquée est essentielle pour que les embryons puissent être fixés de manière stable à la colle sans être pressés trop fort et éclater.
6. Pipeter 10 μL d’eau au centre d’une nouvelle lame de verre et placer la lamelle avec les embryons dessus, avec le côté de l’embryon vers le haut (Figure 2B). Assurez-vous d’utiliser de l’eau au lieu du vernis à ongles ou d’une autre colle adhésive pour fixer la lamelle à la lame de verre, car ce côté de la lamelle sera placé directement sur le dessus de la lentille confocale pour l’imagerie en direct.
7. Séchez les embryons dans une chambre de dessiccation (figure 2A-3) (voir tableau des matériaux) pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce que la membrane vitelline se froisse (figure 2E). Le temps requis peut varier en fonction de l’humidité de la pièce et doit être testé expérimentalement pour chaque condition de laboratoire.
8. Pipeter 40 μL d’huile halocarbonée (un mélange de type 27 et de type 700 dans un rapport de volume de 1 :1, voir le tableau des matériaux) à une extrémité de la bandelette embryonnaire. Inclinez la lame jusqu’à ce que l’huile halocarbonée recouvre toute la surface des embryons.

4. Injection d’anticorps et imagerie

1. Préparez quelques aiguilles de verre d’injection à l’aide d’un extracteur de micropipette (voir le tableau des matériaux pour les paramètres) et chargez chaque aiguille avec 5 μL de solution d’anticorps marquée à AlexaFluor (à partir de l’étape 1.6).
2. Placez une lamelle de 25 mm x 25 mm sur le dessus d’une lame de verre. Pipeter 40 μL d’huile halocarbonée et l’étaler le long du bord de la lamelle.
3. Sous l’endoscope d’injection, alignez la pointe de l’aiguille contre le bord de la lamelle sous l’huile. Ajustez la pression d’air d’injection de la picopompe (voir Tableau des matériaux) de manière à ce qu’une pompe génère une bulle remplie d’anticorps. Le diamètre de la bulle doit être limité à 20-50 μm (Figure 2F).
4. Remplacez la lame de verre vide par une lame contenant des embryons sous huile. Alignez la pointe de l’aiguille d’injection perpendiculairement à l’axe antéro-postérieur des embryons (Figure 2D,G).
5. Vérifier le stade des embryons pour s’assurer que la plupart ont commencé la cellularisation mais n’ont pas encore commencé la gastrulation (stade 4 et stade 5), restant sous forme de syncytium (Figure 2F,G).
   REMARQUE : La caractéristique de cette étape est l’absence de rainures ou de plis et la présence d’un sac vitellin de forme ovale de couleur foncée visible au centre de l’embryon. La caractérisation morphologique du stade embryonnaire sous huile est basée sur le chapitre du livre « Stages de l’embryogenèse de la drosophile » de Volker Hartenstein¹⁷.
6. Utilisez le manipulateur de stade X-Y pour déplacer les embryons vers l’aiguille jusqu’à ce que la pointe arrive au centre du jaune. Pompez deux à trois fois pour injecter des anticorps dans le jaune. La réussite de l’injection est indiquée par la disparition rapide de la ride de la membrane vitelline à mesure que les embryons gagnent en volume à partir de la solution d’anticorps (Figure 2G).
7. Utilisez le manipulateur de stade X-Y pour éloigner les embryons de l’aiguille après l’injection et les déplacer vers le bas jusqu’à l’embryon suivant. Répétez l’étape 6 jusqu’à ce que tous les embryons de la lame soient injectés.
8. Transférez la lame de verre contenant les embryons injectés dans une chambre humide (figure 2A-8). Incuber à 25 °C jusqu’à ce que le stade souhaité de développement embryonnaire soit atteint.
9. Soulevez la lamelle de 24 mm x 50 mm de la lame de verre et placez-la directement dans le porte-lames du microscope. L’équipe sans embryons sera confrontée aux objectifs. Localisez les embryons à l’aide d’une lentille à faible grossissement sous un éclairage à fond vif et passez à une lentille 40x ou 63x pour une imagerie fluorescente haute résolution en direct.

Pour démontrer les avantages de la méthode d’injection d’anticorps par rapport à l’imagerie en direct ou à l’immunofluorescence à base de marqueurs fluorescents, deux études de cas sont fournies qui caractérisent la localisation dynamique d’un récepteur transmembranaire de faible abondance, Notch, et un type de modification post-traductionnelle appelée phosphorylation de la tyrosine dans des embryons vivants.

L’activité de signalisation de l’encoche joue un rôle majeur dans la détermination du destin cellulaire au cours de l’embryogenèse et de l’homéostasie des organes adultes18,19. Lors de l’activation par ses ligands Delta/Jagged20, le domaine intracellulaire du récepteur transmembranaire Notch est clivé et libéré dans le noyau21, initiant des programmes transcriptionnels en aval pour entraîner des changements de destin cellulaire22. La localisation statique du récepteur Notch a été bien caractérisée par immunofluorescence dans les tissus fixés au formaldéhyde. Cependant, la localisation dynamique de Notch au cours de la liaison au ligand ou du processus de clivage intracellulaire reste largement inconnue23, en raison de l’absence d’une méthode permettant d’imager en direct cette protéine relativement peu abondante à grande vitesse. Ici, nous avons injecté du nanocorps GFP conjugué AlexaFluor à des embryons exprimant Notch marqué GFP à partir du locus20 endogène. Sans injection, Notch-GFP est à peine détectable dans des conditions d’imagerie en direct standard, et le signal fluorescent blanchit rapidement pendant l’imagerie en accéléré. Après injection, le rapport signal/bruit du récepteur Notch s’améliore significativement, comparable à la qualité du signal de l’immunofluorescence (Figure 3A). De plus, l’injection d’anticorps permet de caractériser temporellement la localisation de Notch à des intervalles de 45 s, sans perte apparente de l’intensité du signal sur une fenêtre d’imagerie de 5 min (Figure 3B).

La phosphorylation de la tyrosine est un type majeur de modification post-traductionnelle des protéines qui intervient dans la transduction du signal dans de nombreuses voies biologiques24. Des anticorps monoclonaux hautement spécifiques (tels que PY20 et 4G10) dirigés contre la phosphotyrosine (p-Tyr) ont été développés pour caractériser la localisation et les niveaux de phosphorylation globale de la tyrosine à l’aide de l’immunofluorescence et des western blots25. Bien qu’aucune balise fluorescente ne puisse suivre les changements de phosphorylation, les tissus ou les cellules doivent être fixés et colorés ou lysés et effacés à différents moments pour fournir des instantanés de l’état de la phosphorylation au fil du temps, pour étudier la cinétique de la phosphorylation de la tyrosine lors de l’activation du signal26 (par exemple, le traitement du facteur de croissance). L’intervalle de temps de cette approche est d’au moins quelques minutes et intrinsèquement imprécis en raison du temps variable requis pour des procédures telles que la fixation ou la lyse cellulaire.

Ici, il est prouvé que la méthode d’injection d’anticorps permet de visualiser directement l’état de phosphorylation dans les embryons vivants, en suivant la localisation et les changements d’intensité de la phosphorylation de la tyrosine à des intervalles de temps réguliers, de l’ordre de quelques secondes. L’anticorps PY20 conjugué AlexaFluor a été injecté dans des embryons exprimant la chaîne légère de myosine marquée à la GFP et a effectué une imagerie en direct bicolore à des intervalles de 45 s. Comme il a été montré précédemment, la phosphorylation de la tyrosine est fortement enrichie au niveau des jonctions tricellulaires27, un schéma qui est également récapitulé par immunofluorescence (Figure 4A). Il est intéressant de noter que l’imagerie en direct a également révélé une nouvelle et deuxième population de signal p-Tyr sous le centre de la membrane apicale, qui n’est pas observée à l’aide de l’immunofluorescence (Figure 4B). Grâce à l’imagerie bicolore, il a été constaté que cette population de signal p-Tyr est à proximité immédiate de la myosine médiale (Figure 4B, gros plans), une sous-population de myosine28 qui n’est également prononcée que dans des conditions d’imagerie en direct mais à peine détectable par immunofluorescence. De plus, la population médiane de p-Tyr présente des schémas de coalescence et de dissipation pulsatiles similaires (Figure 4C), comme l’a montré précédemment la myosinemédiale 28. L’identité et la fonction d’une sous-population médiane de p-Tyr sont encore inconnues. Ensemble, ces résultats démontrent que la méthode d’injection d’anticorps pourrait grandement compléter les approches traditionnelles pour caractériser les comportements des protéines de faible abondance et révéler de nouveaux modèles de localisation qui auraient pu être perturbés au cours du processus d’immunofluorescence.

Figure 1 : Flux de travail pour l’injection d’anticorps. Flux de travail schématique illustrant les étapes impliquées dans la méthode d’injection d’anticorps. L’ensemble du processus, de la collecte d’embryons à l’injection d’anticorps, prend généralement environ 4 à 5 heures. Après l’injection d’anticorps, les embryons peuvent être incubés dans une chambre humide jusqu’au stade de développement souhaité avant l’imagerie en direct. AEL, après la ponte ; RT, température ambiante ; Ab, anticorps. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Alignement et injection de l’embryon. (A) Vue d’ensemble des éléments requis avant l’injection, y compris une lamelle, une lame de verre, une boîte de dessiccation, un pinceau, une pince à épiler, une crépine à cellules, une chambre d’humidité et du gel d’agarose. (B) Embryons alignés attachés à de la colle heptane au centre de la lamelle et placés sur des billes de dessiccation. (C) Alignement de l’axe antéro-postérieur des embryons parallèlement au bord du gel d’agarose. (D) Vue d’ensemble de la configuration de l’injection. (E) Comparaison de la morphologie de l’embryon avant et après le processus de dessiccation, en mettant l’accent sur la ride de la membrane vitelline après dessiccation. (F) Taille de la bulle d’injection après une seule pression sur la picopompe. (G) Comparaison de la morphologie embryonnaire avant et après injection d’anticorps, mettant en évidence la disparition des rides membranaires après l’injection. (E-G) ont été capturés sous un objectif à grossissement 10x à l’aide de la microscopie à fond clair. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Imagerie en direct du récepteur Notch chez les embryons précoces. (A) Localisation du récepteur Notch marqué par GFP endogène par immunofluorescence (à gauche), imagerie directe en direct basée sur l’autofluorescence GFP (au milieu) et injection de nanocorps GFP conjugué AlexaFluor 594 (à droite). (B) Localisation dynamique de Notch-GFP imagée à des intervalles de 45 s après l’injection d’anticorps. Toutes les images ont été acquises avec l’avant des embryons à gauche et la face ventrale vers le bas. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Imagerie en direct des profils de phosphotyrosine embryonnaire. (A) Localisation de la tyrosine phosphorylée (p-Tyr) dans les embryons fixés par immunofluorescence. (B) Localisation de p-Tyr (magenta) dans des embryons vivants exprimant la chaîne légère de myosine marquée à la GFP (vert). La boîte blanche en pointillés indique des vues rapprochées de la population médiale de phosphotyrosine et de myosine sous la membrane apicale. Barres d’échelle = 10 μm. (C) Localisation de la p-Tyr et de la GFP-myosine imagées toutes les 45 s chez des embryons vivants. Les flèches blanches indiquent la population médiane de p-Tyr et de myosine. Toutes les images ont été capturées avec l’avant des embryons à gauche et la face ventrale vers le bas. Barres d’échelle = 10 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à déclarer.