Le protocole décrit une méthode efficace et fiable pour quantifier la longueur poly(A) du gène d’intérêt du système nerveux de la drosophile , qui peut être facilement adaptée aux tissus ou aux types de cellules d’autres espèces.
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Article de méthode
Mesure de la longueur de la queue Poly A à partir du cerveau et de la lignée cellulaire des larves de drosophile
Dans cet article
Résumé
Résumé
La polyadénylation est une modification post-transcriptionnelle cruciale qui ajoute des queues poly(A) à l’extrémité 3' des molécules d’ARNm. La longueur de la queue poly(A) est étroitement régulée par les processus cellulaires. La dérégulation de la polyadénylation de l’ARNm a été associée à une expression génique anormale et à diverses maladies, notamment le cancer, les troubles neurologiques et les anomalies du développement. Par conséquent, la compréhension de la dynamique de la polyadénylation est essentielle pour démêler les complexités du traitement de l’ARNm et de la régulation post-transcriptionnelle des gènes.
Cet article présente une méthode de mesure de la longueur de la queue poly(A) dans des échantillons d’ARN isolés à partir de cerveaux larvaires de drosophile et de cellules S2 de Drosophila Schneider. Nous avons utilisé l’approche de guanosine/inosine (G/I), qui implique l’ajout enzymatique de résidus G/I à l’extrémité 3' de l’ARNm à l’aide de la poly(A) polymérase de levure. Cette modification protège l’extrémité 3' de l’ARN de la dégradation enzymatique. Les queues de poly(A) protégées sur toute la longueur sont ensuite transcrites à l’envers à l’aide d’une amorce antisens universelle. Par la suite, l’amplification par PCR est réalisée à l’aide d’un oligo spécifique au gène qui cible le gène d’intérêt, ainsi que d’un oligo de séquence universel utilisé pour la transcription inverse.
Cela génère des produits de PCR englobant les queues poly(A) du gène d’intérêt. Étant donné que la polyadénylation n’est pas une modification uniforme et qu’elle donne des queues de longueurs variables, les produits PCR présentent une gamme de tailles, ce qui conduit à un motif de frottis sur le gel d’agarose. Enfin, les produits PCR sont soumis à une électrophorèse sur gel capillaire à haute résolution, suivie d’une quantification à l’aide des tailles des produits de PCR poly(A) et du produit PCR spécifique au gène. Cette technique offre un outil simple et fiable pour analyser les longueurs de queue poly(A), ce qui nous permet de mieux comprendre les mécanismes complexes régissant la régulation de l’ARNm.
Introduction
La plupart des ARNm eucaryotes sont polyadénylés post-transcriptionnel à leur extrémité 3′ dans le noyau par l’ajout d’adénosines non matricielles par des poly(A) polymérases canoniques. Une queue poly(A) intacte est essentielle tout au long du cycle de vie de l’ARNm, car elle est essentielle à l’exportation nucléaire de l’ARNm1, facilite l’interaction avec les protéines de liaison poly(A) pour améliorer l’efficacité de la traduction2 et confère une résistance à la dégradation3. Dans certains cas, la queue poly(A) peut également subir une extension dans le cytoplasme, facilitée par des poly(A) pol....
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Protocole
1. Élevage et sélection des larves de drosophile
- Maintenir/cultiver la souche de mouche (w1118, type sauvage) sur un milieu alimentaire standard à 25 °C dans un incubateur humidifié.
- Sélectionnez 10 larves errantes du 3e stade 72 h après la ponte.
- Placez les larves dans une boîte de Pétri vide de 35 mm et lavez-les délicatement en transférant les larves dans la nouvelle boîte contenant l’eau du robinet à l’aide d’une pince. Faites-le 2 fois pour enlever toute nourriture restante.
2. Isolement du cerveau des
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Résultats
Ici, nous avons analysé la longueur de la queue poly(A) de Dscam1 et GAPDH à partir de cerveaux larvaires de drosophile (Figure 4). Des ARN isolés ont été visualisés sur un gel d’agarose pour le contrôle de la qualité. Une seule bande d’ARN d’une taille d’environ 600 nucléotides indique une préparation d’ARN intacte (Figure 2A). Les ARN ont été soumis à la queue G/I et à l’électrophorèse capillaire à haute résolution à l’aide d’un bioa.......
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Discussion
Dans ce protocole, nous décrivons la technique de dissection du cerveau larvaire de la drosophile au stade du 3e stade errant ainsi que la préparation de l’échantillon à partir de cellules S2 de la drosophile. En raison de la nature labile des ARNm, le prélèvement d’échantillons nécessite une prudence accrue. Pour la dissection cérébrale larvaire, les cerveaux ne doivent pas être endommagés pendant l’isolement et ne doivent pas être maintenus en solution pendant une durée prolongée. Il est es.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.
Remerciements
Cette étude a été financée par la subvention de l’Institut national des troubles neurologiques et des accidents vasculaires cérébraux R01NS116463 à J.K., et par la plateforme d’imagerie cellulaire et moléculaire de l’Université du Nevada, à Reno, qui a été soutenue par la subvention des National Institutes of Health P20GM103650 et utilisée pour la recherche rapportée dans cette étude.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Acide 3-(N-morpholino)propanesulfonique (MOPS) | Recherche sur l’internation des produits (RPI) | M92020 | |
| Kit d’ADN haute sensibilité | Agilent Technologies | ; 5067-4626 | |
| Agilent software 2100 expert téléchargement gratuit démo | Agilent Technologies | https://www.agilent.com/en/product/automated-electrophoresis/bioanalyzer-systems/bioanalyzer-software/2100-expert-software-228259 | |
| Apex 100 bp-Low DNA Ladder | Genesee Scientific | 19-109 | |
| Bioanalyseur | Agilent 2100 Bioanalyzer G2938C | ||
| Pyrocarbonate de diéthyle (DEPC) | Recherche internationale de produits (RPI) ; | D43060 | |
| Colorant ADN (Gel Loading Dye, Violet (6x) | New England biolabs ; | B7024S | |
| Drosophila S2 lignée cellulaire | Drosophila Genomics Resource Center stock #181 | ||
| Drosophila Schneider' s Medium | Thermo Fisher Scientific | 21720024 | |
| Bromure d’Ehidium | Genesee scientific ; | 20-276 | |
| Sérum fœtal bovin (FBS) | Sigma-Aldrich | F4135 | |
| Pince Dumont 5 ; ; | Outils de science fine ; | 11254-20 | |
| Eau sans nucléase | Thermo Fisher Scientific ; | AM9932 | |
| PBS 10x | Research Product Internation (RPI) ; | P32200 | |
| Poly(A) Kit de dosage de la longueur de la queue | Thermo Fisher Scientific ; | 764551KT | |
| RiboRuler Échelle d’ARN à gamme basse | Thermo Fisher Scientific ; | SM1833 | |
| Colorant de chargement de gel d’ARN (2x) | Thermo Fisher Scientific ; | R0641 | |
| Kit de micropréparation d’ARN | Zymoresearch ; | R1050° | |
| Kit de mini-préparation de l’ARN | Zymoresearch ; | R1055 | |
| Ciseaux-Ciseaux à ressort Vannas - Outils de haute technologie de 2,5 mm | pour les sciences fines. | 15000-08 | |
| TopVision Agarose Comprimés | Thermo Fisher Scientific | R2802 | |
| Tris-Acétate-EDTA (TAE) | Thermo Fisher Scientific | B49 |
Références
- Stewart, M. Polyadenylation and nuclear export of mRNAs. Journal of Biological Chemistry. 294 (9), 2977-2987 (2019).
- Machida, K., et al. Dynamic interaction of poly(A)-binding protein with the ribosome. Scientific Reports. 8 (1), 17435(2018).....
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Réimpressions et autorisations
