Surveillance de l’évolution mécanique des tissus lors de la fermeture du tube neural d’un embryon de poussin

Résumé

Ce protocole a été développé pour surveiller longitudinalement les propriétés mécaniques du tissu de la plaque neurale pendant la neurulation de l’embryon de poulet. Il repose sur l’intégration d’un microscope Brillouin et d’un système d’incubation sur scène, permettant l’imagerie mécanique en direct du tissu de la plaque neurale dans des embryons de poussins cultivés ex ovo .

Résumé

La fermeture du tube neural (NTC) est un processus critique au cours du développement embryonnaire. L’échec de ce processus peut entraîner des anomalies du tube neural, provoquant des malformations congénitales ou même la mort. La NTC implique une série de mécanismes aux niveaux génétique, moléculaire et mécanique. Si la régulation mécanique est devenue un sujet de plus en plus attractif ces dernières années, elle reste largement inexplorée en raison du manque de technologie adaptée pour effectuer des tests mécaniques de tissus embryonnaires 3D in situ. En réponse, nous avons développé un protocole pour quantifier les propriétés mécaniques du tissu embryonnaire de poulet de manière non contactable et non invasive. Ceci est réalisé en intégrant un microscope confocal Brillouin à un système d’incubation sur scène. Pour sonder la mécanique tissulaire, un embryon pré-cultivé est prélevé et transféré dans un incubateur sur scène pour une culture ex ovo . Simultanément, les images mécaniques du tissu de la plaque neurale sont acquises par le microscope Brillouin à différents moments du développement. Ce protocole comprend des descriptions détaillées de la préparation des échantillons, de la mise en œuvre des expériences de microscopie Brillouin, ainsi que du post-traitement et de l’analyse des données. En suivant ce protocole, les chercheurs peuvent étudier longitudinalement l’évolution mécanique du tissu embryonnaire au cours du développement.

Introduction

Les anomalies du tube neural (ATN) sont des malformations congénitales graves du système nerveux central causées par des défaillances de la fermeture du tube neural (NTC) au cours du développement embryonnaire¹. L’étiologie des MTN est complexe. Des études ont montré que le NTC implique une séquence de processus morphogénétiques, y compris l’extension convergente, la flexion de la plaque neurale (par exemple, la constriction apicale), l’élévation du pli neural et enfin l’adhésion du pli neural. Ces processus sont régulés par de multiples mécanismes moléculaires et génétiques ^2,3, et tout dysfonctionnement de ces processus peut entraîner des MTN ^4,5,6. Comme de plus en plus de preuves suggèrent que les signaux mécaniques jouent également un rôle crucial au cours du NTC 3,7,8,9,10,11, et que des relations ont été trouvées entre les gènes et les signaux mécaniques 12,13,14, il devient impératif d’étudier la biomécanique tissulaire pendant la neurulation.

Plusieurs techniques ont été développées pour mesurer les propriétés mécaniques des tissus embryonnaires, notamment l’ablation laser (LA)¹⁵, la dissection et la relaxation tissulaire (TDR)^16,17, l’aspiration par micropipette (MA)¹⁸, la nanoindentation basée sur la microscopie à force atomique (AFM)¹⁹, les micro-pénétrateurs (MI) et les microplaques (MP)²⁰, la microrhéologie (IRM) avec pince optique/magnétique 21,22,23et des capteurs à gouttelettes²⁴. Les méthodes existantes permettent de mesurer les propriétés mécaniques à des résolutions spatiales allant de l’échelle subcellulaire à l’échelle tissulaire. Cependant, la plupart de ces méthodes sont invasives car elles nécessitent un contact avec l’échantillon (p. ex., MA, AFM, MI et MP), une injection externe de matière (p. ex., IRM et capteurs à base de gouttelettes) ou une dissection tissulaire (p. ex., LA et TDR). Par conséquent, il est difficile pour les méthodes existantes de surveiller l’évolution mécanique du tissu de la plaque neurale in situ²⁵. Récemment, l’élastographie par cohérence optique réverbérante s’est révélée prometteuse pour la cartographie mécanique sans contact avec une haute résolution spatiale²⁶.

La microscopie confocale Brillouin est une modalité optique émergente qui permet la quantification sans contact de la biomécanique tissulaire avec une résolution subcellulaire 27,28,29,30. La microscopie Brillouin est basée sur le principe de la diffusion spontanée de la lumière Brillouin, qui est l’interaction entre la lumière laser incidente et l’onde acoustique induite par les fluctuations thermiques au sein du matériau. Par conséquent, la lumière diffusée subit un décalage de fréquence, connu sous le nom de décalage de Brillouin ω_R, suivant l’équation³¹ :

(1)

Ici, est l’indice de réfraction du matériau, λ est la longueur d’onde de la lumière incidente, M’est le module longitudinal, ρ est la densité de masse et θ est l’angle entre la lumière incidente et la lumière diffusée. Pour le même type de matériel biologique, le rapport entre l’indice de réfraction et la densité est approximativement constant 28,32,33,34,35,36. Ainsi, le décalage de Brillouin peut être directement utilisé pour estimer les changements mécaniques relatifs dans les processus physiologiques. La faisabilité de la microscopie Brillouin a été validée dans divers échantillons biologiques 29,37,38. Récemment, l’imagerie mécanique en accéléré d’un embryon de poussin vivant a été démontrée en combinant un microscope Brillouin avec un système d’incubation sur scène³⁹. Ce protocole fournit des descriptions détaillées de la préparation des échantillons, de la mise en œuvre de l’expérience, du post-traitement et de l’analyse des données. Nous espérons que cet effort facilitera l’adoption généralisée de la technologie Brillouin sans contact pour étudier la régulation biomécanique du développement embryonnaire et des malformations congénitales.

Protocole

Le protocole a été approuvé par le comité institutionnel de soins et d’utilisation des animaux de l’Université d’État de Wayne.

1. Préparation expérimentale

1. Utilisez une solution d’éthanol à 70 % pour nettoyer et stériliser les ciseaux et la pince à épiler. Préparez également des pipettes jetables et une seringue.
2. Préparez un milieu de lavage en ajoutant 3,595 g de NaCl à 495 mL d’eau désionisée. Ajoutez ensuite 5 ml de pénicilline-streptomycine (5 U/mL) au milieu. Remplissez une boîte de Pétri de 100 mm avec le produit de lavage et réchauffez-la à 37 °C.
3. Préparez les plats de culture selon la figure 1, qui illustre la configuration globale.
   1. Préparez un morceau de papier filtre, coupez-le en une forme rectangulaire d’environ 17 mm × 20 mm et retirez les quatre coins. Créez un centre creux dans le papier filtre, d’environ 7 mm × 10 mm pour fixer l’embryon (Figure 1, à gauche).
      REMARQUE : Le prélèvement d’embryons est décrit à l’étape 2.
   2. Fixez un anneau disponible dans le commerce (Φ = 1 pouce, voir le tableau des matériaux) avec une couche de film flexible (c’est-à-dire un film de paraffine), en veillant à ce que le film flexible ait également un centre creux. Cet anneau avec le film sera utilisé pour maintenir le papier filtre avec l’embryon.
   3. Enfin, placez l’anneau préparé dans une boîte de Pétri de 35 mm (Figure 1, à droite).
      REMARQUE : Le papier filtre sert à fixer et à maintenir l’embryon extrait en plaçant le papier filtre sur la membrane et en laissant l’embryon dans la zone creuse centrale (qui sera détaillée à l’étape 2). Les quatre coins ont été coupés pour s’adapter à la taille de l’anneau extérieur (pas nécessaire s’il est déjà monté). Une boîte de culture à fond de verre de 35 mm est utilisée pour une meilleure propagation du faisceau laser. La boîte a un puits intérieur (Φ = 23 mm), qui peut être rempli d’albumine pour la culture ex ovo . Le diamètre de l’anneau doit être plus grand que le diamètre du puits intérieur afin que le puits puisse être recouvert par le film flexible sur l’anneau (figure 1, encadré). La taille du papier filtre n’est pas restreinte et peut être modifiée en fonction de la taille de l’anneau choisi et de la boîte de culture. Alternativement, le fond du plat peut être pré-enduit d’une couche d’agarose (épaisseur : ~1 mm). En enlevant l’agarose du centre de la couche à l’aide d’une lame, un puits de forme similaire au centre creux du film flexible peut être créé pour le chargement de l’albumen. Un point critique est que les quatre côtés du papier filtre creux doivent avoir une largeur suffisante (> 5 mm) pour assurer la fixation de l’embryon.

2. Extraction et culture ex ovo de l’embryon de poulet

REMARQUE : Cette étape est modifiée par rapport aux rapports^40,41 publiés précédemment.

1. Après la pré-culture, récupérez l’œuf de l’incubateur et placez-le sur son axe long sur le plateau de la boîte à œufs. Nettoyez la coquille d’œuf avec de l’éthanol à 70 % en veillant à couvrir toute la surface, puis laissez-la reposer pendant 15 minutes.
2. Tenez l’œuf sur son axe court et cassez-le en bas. Ouvrez l’œuf au-dessus d’une boîte de Pétri propre de 100 mm pour en extraire le contenu, comme illustré à la figure 2. Assurez-vous de ne pas faire pivoter l’œuf en le tenant et en le cassant
3. À l’aide d’une pipette, transférer et prélever environ 10 mL d’albumen mince (c.-à-d. l’albumen^{liquide 42}) dans un tube de 15 mL pour une utilisation ex ovo culture. Remplissez le puits central de la boîte de culture avec l’albumen mince recueilli (environ 0,9 ml), comme le montre la figure 3. Le processus de remplissage doit être lent, en évitant la formation de bulles à l’intérieur du puits. Veillez à ce que la boîte de culture contenant de l’albumen soit chauffée à 37 °C.
   REMARQUE : Ce plat sera utilisé pour la culture de l’embryon ex ovo. De nouvelles boîtes de culture remplies de milieu de lavage seront utilisées lors de l’imagerie Brillouin (voir étape 3).
4. À l’aide de papier de soie, retirer délicatement l’albumen épais (c’est-à-dire l’albumen visqueux) attaché à l’embryon en séparant soigneusement l’albumen de la membrane vitelline, comme le montre la figure 4. Évitez tout contact direct avec la membrane vitelline.
5. Après avoir retiré toute l’albumine épaisse, fixez soigneusement le papier filtre sur la membrane vitelline. Assurez-vous que l’axe du corps de l’embryon est aligné avec l’axe long du rectangle central sur le papier filtre. Utilisez des ciseaux pour couper la membrane entourant le papier filtre.
6. À l’aide d’une pince à épiler, retirez doucement le papier filtre isolé du jaune dans une direction oblique. Retournez le papier filtre pour positionner l’embryon avec sa face dorsale vers le bas (pour une configuration de microscope inversé). Plongez soigneusement l’ensemble du papier filtre d’un côté de l’axe long dans la boîte de Pétri de 100 mm avec le produit de lavage de manière oblique.
7. Lavez le jaune restant en vaporisant doucement le produit de lavage parallèlement au papier filtre à l’aide d’une pipette propre. Évitez de pulvériser directement le produit de lavage sur la membrane.
8. Après avoir nettoyé tout le jaune, retirez délicatement le papier filtre du milieu de lavage et utilisez du papier de soie pour absorber tout excès de médium des bords. Ensuite, placez le papier filtre avec l’embryon sur la boîte de culture, en veillant à ce que la face dorsale de l’embryon soit orientée vers le bas, comme illustré à la figure 5. Pour maintenir l’humidité, placez un papier de soie humidifié dans le plat.
9. Transférer la boîte de culture dans l’incubateur sur scène pour la culture ex ovo .

3. Mesure de Brillouin de l’embryon

1. Préparez un autre ensemble de plats de culture et remplissez-les de milieu de lavage. Assurez-vous que le produit de lavage est chauffé à 37 °C.
2. Lorsque l’embryon atteint le stade de développement souhaité, transférez le papier filtre avec l’embryon dans le plat de culture rempli de milieu de lavage. Placer la boîte de culture dans l’incubateur de la platine du microscope Brillouin (voir tableau des matériaux).
   1. Avant d’effectuer la mesure de Brillouin, enregistrez une image en fond clair de l’embryon entier pour référence. La configuration détaillée du microscope Brillouin a été décrite précédemment³⁰ et est résumée dans la section Résultats (Figure 6).
3. Mesurez le signal Brillouin de l’eau et du méthanol, qui sera utilisé à l’étape 4 pour le processus d’étalonnage.
4. Ajustez la puissance laser incidente et le temps d’exposition de la caméra du dispositif à couplage de charge multiplicateur d’électrons (EMCCD, voir Tableau des matériaux) pour obtenir au moins 10 000 comptes de signal Brillouin. En utilisant l’image en fond clair comme guide, configurez la plage de numérisation et la taille du pas. Acquérir une image Brillouin de la région d’intérêt en scannant l’embryon à l’aide d’une étape translationnelle 2D.
   REMARQUE : La plage de balayage horizontale peut être déterminée en fonction de l’image en fond clair, et la plage de balayage verticale (c’est-à-dire en profondeur) peut être déterminée en fonction de l’intensité du signal obtenue à partir d’un balayage rapide et grossier. Pour éviter tout photodommage à l’embryon, limitez la puissance incidente à 25 mW et réglez le temps d’exposition de la caméra EMCCD à 50 ms. Choisissez une taille de pas de 2 μm dans le sens horizontal et de 1 μm dans le sens vertical pour équilibrer la qualité de l’image et le temps d’acquisition.
5. Une fois l’échographie terminée, retirez délicatement le papier filtre avec l’embryon et utilisez du papier de soie pour absorber tout excès de produit de lavage. Ensuite, replacez le papier filtre dans la boîte de culture remplie d’albumine fine pour une culture continue dans l’incubateur sur scène.
6. Répétez les étapes 3.2 à 3.5 à intervalles réguliers (par exemple, 1,5 h) pour capturer des images de Brillouin en accéléré au fur et à mesure que l’embryon se développe.
7. Reconstruisez l’image 2D de Brillouin en suivant l’étape 4.

4. Reconstruction d’image Brillouin

1. Calibrez le spectromètre Brillouin à l’aide des signaux Brillouin de l’eau et du méthanol pour calculer la gamme spectrale libre (FSR) et le rapport de conversion pixel/fréquence (PR) du spectromètre³⁰. Les valeurs calibrées de FSR et PR seront utilisées pour calculer le décalage de Brillouin de l’embryon à chaque pixel.
   REMARQUE : La figure 7A montre un spectre Brillouin brut capturé par la caméra EMCCD. En additionnant verticalement le spectre puis en effectuant un ajustement lorentzien, la distance de crête Δd des deux points peut être obtenue (Figure 7B). En obtenant la distance maximale de l’eau Δd_{de l’eau} et du méthanol Δd_méthanol, le FSR et le PR peuvent être calculés sur la base des équations³⁰ : PR = 2· (ω_{méthanol-ω eau})/(Δd_eau-_{Δd méthanol}), et FSR = 2·ω_eau + PR·Δd_eau, avec le décalage de Brillouin connu de l’eau ω_eau = 6,01 GHz et méthanol ω_méthanol = 4,49 GHz à 660 nm.
2. Obtenir la distance de crête du signal Brillouin à chaque pixel de l’échantillon. Calculez le décalage de Brillouin en fonction du FSR et du PR calibrés :_{ω échantillon} = 0,5 (FSR - PR x_échantillon Δd)³⁰, où ω_échantillon est le décalage de Brillouin de l’échantillon, et Δd_{échantillon est} la distance de crête du signal de Brillouin.
3. Reconstruisez l’image Brillouin 2D en fonction des décalages Brillouin de tous les pixels.
   NOTE : Pour effectuer une analyse locale, on peut sélectionner une région d’intérêt (par exemple, la plaque neurale) à partir de l’image de Brillouin acquise et quantifier ses propriétés mécaniques. Une approche courante consiste à calculer le décalage de Brillouin moyen de la région sélectionnée.

Résultats

La figure 6 montre le schéma du microscope Brillouin. Le système utilise un laser de 660 nm comme source lumineuse. Un isolateur est placé juste après la tête laser pour rejeter toute lumière réfléchie par le retour, et un filtre à densité neutre (ND) est utilisé pour ajuster la puissance du laser. Une paire de lentilles, L1 et L2, avec des distances focales de f1 = 16 mm et f2 = 100 mm, respectivement, est utilisée pour étendre le faisceau laser. Une plaque demi-onde (HWP) et un polariseur ...

Discussion

Le développement précoce de l’embryon peut être facilement affecté par des perturbations externes. Par conséquent, la plus grande prudence est requise lors de l’extraction et du transfert de l’échantillon. Un problème potentiel est le détachement de l’embryon du papier filtre, ce qui peut entraîner le rétrécissement de la membrane vitelline et entraîner un artefact incliné de la plaque neurale dans l’imagerie Brillouin. De plus, ce rétrécissement peut arrêter le développement de l’embryon. Une attention particulière doit...

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Boîte de Pétri de 100 mm  ;	Fisherbrand	FB0875713
platine motorisée 2D  ;	Prior Scientific	H117E2
	World Precision Instruments	FD35-100
Microscope Brillouin avec incubateur sur scène	N/A N	/A	Il s’agit d’un système de microscope Brillouin sur mesure basé sur la réf. 30
Oeufs de poule	Université du Connecticut	N/A
Caméra CMOS	Thorlabs	CS2100M-USB
Caméra EMCCD	Andor	iXon
Ethanol	Decon Laboratories, Inc.	#2701
Papier filtre	Whatman	1004-070
Incubateur pour culture in ovo	GQF Manufacturing Company Inc.	GQF 1502  ;
Anneau	Thorlabs	SM1RR
Corps de microscope	Olympus	IX73
NaCl	Sigma-Aldrich	S9888
Incubateur sur scène	Oko labs	OKO-H301-PRIOR-H117
Parafilm	Bemis	PM-996
Pénicilline-Streptomycine	Gibco	15070-063
Pipettes	Fisherbrand	13-711-6M
Ciseaux	Artman instruments	N/A	3pc Micro Ciseaux 5
Seringues	BD	305482
Papier de soie	Kimwipes	N/A
Tube	Corning	430052
Pince à épiler	DR Instruments	N/A	Microdissection Forceps Set  ;