Quantification des propriétés élastiques des biofilms environnementaux à l’aide de l’élastographie par cohérence optique

Summary

Cet article met en évidence l’efficacité de la technique d’élastographie par cohérence optique (OCE) dans la caractérisation rapide et non destructive des propriétés élastiques des biofilms. Nous élucidons les procédures critiques de mise en œuvre des OCE pour des mesures précises et présentons les valeurs du module de Young pour deux biofilms granulaires.

Abstract

Les biofilms sont des biomatériaux complexes comprenant un réseau bien organisé de cellules microbiennes enfermées dans des substances polymères extracellulaires (EPS) autoproduites. Cet article présente un compte rendu détaillé de la mise en œuvre de mesures d’élastographie par cohérence optique (OCE) adaptées à la caractérisation élastique des biofilms. L’OCE est une technique optique non destructive qui permet de cartographier localement la microstructure, la morphologie et les propriétés viscoélastiques de matériaux souples partiellement transparents avec une résolution spatiale et temporelle élevée. Nous fournissons un guide complet détaillant les procédures essentielles pour la mise en œuvre correcte de cette technique, ainsi qu’une méthodologie pour estimer le module de Young en vrac des biofilms granulaires à partir des mesures collectées. Il s’agit de la configuration du système, de l’acquisition des données et du post-traitement. Dans la discussion, nous nous penchons sur la physique sous-jacente des capteurs utilisés dans les OCE et explorons les limites fondamentales concernant les échelles spatiales et temporelles des mesures des OCE. Nous concluons avec des orientations futures potentielles pour faire progresser la technique OCE afin de faciliter les mesures élastiques des biofilms environnementaux.

Introduction

Dans le traitement des eaux usées et la récupération des ressources en eau, les biofilms bénéfiques dans les réacteurs de croissance attachés sont de plus en plus utilisés pour permettre aux microbes de convertir les polluants indésirables, tels que la matière organique, l’azote et le phosphate, en formes stabilisées qui peuvent être facilement éliminées de l’eau¹. Dans ces systèmes, la fonction émergente du biofilm, à savoir les transformations biochimiques, est étroitement associée à la diversité des microbes qui y résident et aux nutriments que ces microbes reçoivent². Par conséquent, la croissance continue du biofilm peut poser un défi pour maintenir une fonctionnalité constante du réacteur, car la croissance du nouveau biofilm peut modifier les processus métaboliques globaux du biofilm, les caractéristiques de transfert de masse et la composition de la communauté. Stabiliser autant que possible l’environnement du biofilm peut protéger contre de tels changements³. Il s’agit notamment d’assurer un flux constant de nutriments et de maintenir la structure du biofilm stable avec une épaisseur constante⁴. La surveillance de la rigidité et de la structure physique du biofilm permettrait aux chercheurs de mieux comprendre la santé et le fonctionnement globaux du biofilm.

Les biofilms présentent des propriétés viscoélastiques ^5,6,7. Cette nature viscoélastique se traduit par une combinaison d’une déformation instantanée et lente, dépendante du temps, en réponse à des forces mécaniques externes. Un aspect unique des biofilms est que, lorsqu’ils sont soumis à une déformation importante, ils réagissent comme des liquides visqueux. À l’inverse, lorsqu’ils sont soumis à une déformation mineure, leur réponse est comparable à celle des solides⁵. De plus, dans cette région de petite déformation, il existe une plage de déformation sous laquelle les biofilms présentent une relation force-déplacement linéaire ^5,6,7. Les déformations dans cette plage linéaire sont optimales pour évaluer les caractéristiques mécaniques des biofilms car elles permettent d’obtenir des mesures reproductibles. Plusieurs techniques permettent de quantifier la réponse élastique dans cette plage. L’élastographie par cohérence optique (OCE) est une technique émergente qui est en cours d’adaptation pour analyser les biofilms dans cette gamme linéaire (déformations de l’ordre de 10-4-10-5)^8,9.

L’application la plus établie d’OCE jusqu’à présent est dans le domaine biomédical, où la technique a été appliquée pour caractériser des tissus biologiques qui ne nécessitent qu’un accès optique superficiel. Par exemple, Li et al. ont utilisé l’OCE pour caractériser les propriétés élastiques du tissu cutané¹⁰. D’autres auteurs ont caractérisé les propriétés élastiques anisotropes des tissus cornéens porcins et humains et comment ils sont affectés par la pression intraoculaire 11,12,13,14,15,16. Certains avantages de la méthode OCE pour l’étude des biofilms sont qu’elle est non destructive et fournit une résolution spatiale à méso-échelle, qu’elle ne nécessite aucune préparation d’échantillon et que la méthode elle-même est rapide ; Il fournit des mesures co-enregistrées de la structure physique et des propriétés élastiques (par exemple, porosité, rugosité de surface et morphologie)8,9,17,18.

La méthode OCE mesure le déplacement local des ondes élastiques se propageant dans un échantillon à l’aide de la tomographie par cohérence optique (OCT) sensible à la phase. L’OCT est un interféromètre optique à faible cohérence qui transforme les changements locaux dans le déplacement de l’échantillon en un changement d’intensité qui est enregistré avec un spectromètre optique. La technique OCT a également été utilisée dans la recherche sur les biofilms pour la caractérisation de la structure à méso-échelle, de la distribution de la porosité en trois dimensions et de la déformation du biofilm 17,19,20,21. De plus, Picioreanu et al. ont estimé les propriétés mécaniques du biofilm en utilisant la modélisation inverse de l’interaction fluide-structure d’images de déformation en coupe transversale OCT²².

D’autre part, les mesures OCE, couplées à la modélisation des ondes élastodynamiques inverses, donnent la vitesse d’onde des ondes élastiques dans l’échantillon, ce qui permet de caractériser les propriétés élastiques et viscoélastiques de l’échantillon. Notre groupe a adapté la technique OCE pour la mesure quantitative des propriétés élastiques et viscoélastiques du biofilm ^8,9,18 et a validé la technique par rapport aux mesures de rhéométrie de cisaillement dans des échantillons de plaques de gel d’agarose¹⁸. L’approche OCE fournit des estimations précises et fiables des propriétés du biofilm puisque la vitesse d’onde élastique mesurée est corrélée aux propriétés élastiques de l’échantillon. De plus, la décroissance spatiale de l’amplitude de l’onde élastique peut être directement corrélée aux propriétés viscoélastiques dues aux effets visqueux dans le matériau. Nous avons rapporté des mesures OCE des propriétés viscoélastiques de biofilms bactériens de culture mixte cultivés sur des coupons dans un réacteur annulaire rotatif (RAR) et de biofilms granulaires à géométries complexes en utilisant des modèles d’ondes élastodynamiques¹⁸.

La technique OCE est également une alternative puissante à la rhéométrie^{traditionnelle 18}qui est utilisée pour la caractérisation viscoélastique. Les méthodes rhéométriques sont les mieux adaptées aux échantillons à géométrie plane. Ainsi, les biofilms granulaires, qui ont des formes et des morphologies de surface arbitraires, ne peuvent pas être caractérisés avec précision sur un rhéomètre ^8,23. De plus, contrairement à l’OCE, les méthodes de rhéométrie peuvent être difficiles à adapter pour les mesures en temps réel, par exemple, pendant la croissance du biofilm dans les cellules d’écoulement^24,25.

Dans cet article, nous montrons que les mesures OCE de la vitesse d’onde indépendante de la fréquence des ondes de surface peuvent être utilisées pour caractériser les propriétés élastiques du biofilm sans avoir besoin de modèles compliqués. Ce développement rendra l’approche des CEO plus accessible à l’ensemble de la communauté des biofilms pour l’étude des propriétés mécaniques des biofilms.

La figure 1 montre une illustration schématique du système OCT utilisé dans cette étude. Le système intègre plusieurs instruments, dont un système OCT commercial sensible à la phase dans le domaine spectral, un générateur de retard, un générateur de fonctions et un transducteur piézoélectrique. Le système OCT fonctionne sur le principe de l’interférométrie en utilisant une source lumineuse à large bande avec une longueur d’onde centrale de 930 nm. L’intensité lumineuse collectée, qui est corrélée aux détails structurels complexes de l’échantillon, est analysée dans l’unité de post-traitement, puis convertie en une image en coupe transversale de l’échantillon - communément appelée image OCT. La profondeur d’imagerie OCT dépend de la gravité de la diffusion optique dans l’échantillon qui provient de la variation locale de l’indice de réfraction et est limitée à 1 à 3 mm dans les tissus biologiques et les biofilms. Comme la phase optique dans l’échantillon et l’intensité de l’interférence sont modulées par le mouvement, l’OCT peut être utilisé pour détecter le déplacement local de l’échantillon. Nous exploitons la sensibilité au déplacement de l’OCT dans la méthode OCE pour suivre le champ de déplacement en régime permanent des ondes élastiques dans l’échantillon. Plus précisément, le générateur de fonctions émet une tension sinusoïdale pour piloter le transducteur piézoélectrique. Le transducteur, à son tour, s’étire et se contracte avec un historique temporel oscillatoire. Le déplacement oscillatoire de la sonde confère une force sinusoïdale à la surface de l’échantillon par le biais d’une pointe cunéiforme imprimée en 3D au sommet de la sonde, ce qui entraîne la génération d’ondes élastiques harmoniques dans l’échantillon. La pointe du coin établit un léger contact avec l’échantillon, de sorte que l’échantillon reste intact après que l’actionneur soit rétracté de la surface de l’échantillon. Pour enregistrer le déplacement local dans l’échantillon, des balayages en profondeur adjacents séparés par un délai fixe sont acquis à chaque pixel de l’échantillon. La différence de phase optique entre les balayages consécutifs à chaque point de pixel est proportionnelle au déplacement vertical local au même point. La synchronisation entre le déplacement du transducteur et l’optique de balayage dans le système OCT est réalisée par une impulsion de déclenchement qui provient du générateur de fonctions et est retardée dans le générateur de retard. Cette étape de synchronisation facilite l’acquisition d’images transversales cohérentes de la distribution de phase optique locale dans l’échantillon. Ces images sont directement proportionnelles au déplacement harmonique vertical local dans l’échantillon et sont connues sous le nom d’image OCE. Les images OCE sont acquises à différentes fréquences d’actionnement du transducteur pour obtenir la longueur d’onde élastique et la vitesse d’onde en fonction de la fréquence. Les vitesses d’onde mesurées sont analysées avec un modèle élastodynamique pour déterminer les propriétés élastiques de l’échantillon.

Protocol

1. Configuration du système

1. Rassemblez les composants du système, notamment le système OCT commercial (unité de base, support, tête d’imagerie et ordinateur), le générateur de formes d’onde, le transducteur, le générateur de retard/impulsions, un commutateur avec connexions BNC, des câbles et adaptateurs BNC, des bornes optiques et des pinces.
2. Connectez le signal de synchronisation du générateur de fonctions à un interrupteur. Connectez l’autre port du commutateur au générateur de retard.
3. Connectez la sortie du générateur de fonctions aux fils du transducteur.
4. Connectez les sorties du générateur de retard au canal de déclenchement à l’arrière de l’unité de base OCT. Le signal de sortie du générateur de retard est une impulsion de déclenchement pour initier le mouvement de l’optique de balayage dans le système OCT.
5. Mettez sous tension les composants du système (unité de base OCT, ordinateur, générateur de fonctions et générateur de retard) et lancez le logiciel OCT.
6. Configurez le générateur de retard pour envoyer un signal de déclenchement logique transistor-transistor à l’unité de base OCT. Reportez-vous au manuel du système OCT pour connaître les exigences relatives aux signaux de déclenchement.
7. Placez la sonde sous la lentille OCT. Le transducteur a une pointe de coin imprimée en 3D collée sur l’une de ses extrémités qui sert de source de ligne pour les ondes élastiques.

2. Acquisition d’images

1. Sur le logiciel OCT, sélectionnez le mode d’acquisition Doppler et activez le déclencheur externe.
2. Placez le biofilm granulaire sous l’objectif dans un porte-échantillon et déplacez-le vers l’extrémité du transducteur à l’aide d’une platine de translation. Assurez-vous que la sonde est en contact doux avec la surface de l’échantillon, comme illustré à la figure 2. Nous avons utilisé deux biofilms granulaires (également appelés boues granulaires) de diamètres nominaux différents (4,3 mm et 3,3 mm). Cette sélection a été faite pour étudier l’impact de la taille du biofilm sur ses propriétés mécaniques. Ceux-ci ont été obtenus dans le commerce.
   REMARQUE : Le porte-échantillon utilisé dans cette étude est constitué d’une plaque en plastique imprimée en 3D avec de multiples indentations hémisphériques. Ce support ne permet pas de mesurer dans des conditions natives. Nous avons donc introduit de l’eau du milieu naturel lors des mesures pour éviter que l’échantillon ne sèche.
3. Spécifiez la région de balayage en cliquant sur les points de départ et d’extrémité de la ligne d’intérêt (chemin de propagation des ondes) dans la fenêtre du moniteur d’échantillon. Centrez cette ligne par rapport à l’extrémité de la sonde et assurez-vous qu’elle est perpendiculaire au bord de l’extrémité.
4. Spécifiez le nombre de pixels le long de la zone de balayage et la profondeur de l’échantillon et augmentez le nombre de B-scans (images en coupe 2D) à enregistrer pour améliorer le rapport signal/bruit des images OCE. Les résultats présentés ont été obtenus en utilisant 1523 pixels le long de la trajectoire de balayage et 1024 pixels le long de la profondeur. Au total, 50 B-scans ont été effectués.
5. Cliquez sur le bouton Analyser et activez le commutateur. Les images de l’OCT et de l’OCE devraient apparaître à l’écran. Activez le commutateur pendant le délai de déclenchement et le temps de préparation de l’analyse.
6. Assurez-vous que l’intensité de référence se situe dans la plage optimale et positionnez l’échantillon dans la zone focale de l’objectif du microscope OCT. Un échantillon correctement mis au point doit avoir son bord supérieur proche du haut de l’image.
7. Ajustez le contour de phase dans l’image OCE dans la barre d’outils d’affichage en augmentant la valeur supérieure de la barre de couleur de gauche et en diminuant la valeur inférieure de la barre de couleur de droite. Cela augmentera le contraste des franges.
8. Configurez le générateur de fonctions pour produire une tension sinusoïdale à fréquence unique en appuyant sur le bouton sinusoïdal du panneau avant et spécifiez la fréquence d’excitation de départ pour les mesures. Les mesures de cette étude commencent à 4 kHz et se terminent à 9,6 kHz. Activez le connecteur de sortie en appuyant sur la touche Sortie.
9. Réglez une tension acceptable pour la mesure. Cette valeur doit maximiser la visibilité des franges mais aussi éviter l’enroulement de phase. Pour les biofilms de cette étude et la gamme de fréquences des mesures, une tension comprise entre 5 et 10 V donne généralement une carte de phase avec un bon contraste.
10. Acquérez les images OCT et OCE en cliquant sur le bouton Enregistrer .
11. Répétez les mesures à différentes fréquences pour obtenir des images en coupe transversale du champ d’ondes élastiques avec différentes longueurs d’onde (ou périodes de frange).

3. Analyse d’images

1. Obtenez la taille physique des pixels. La taille physique des pixels en x est obtenue en divisant le champ de vision dans la direction x par la taille de l’image dans la direction x, puis en multipliant par un facteur de deux. La taille physique des pixels en z est obtenue en divisant le champ de vision dans la direction z par la taille de l’image dans la direction z. Les valeurs du champ de vision et de la taille de l’image sont stockées dans le tableau de structure avec les informations d’image accessibles avec la fonction OCTFileOpen fournie dans le SDK MATLAB dans le package ThorImageOCT.
2. Obtenez les matrices OCT et OCE à l’aide des fonctions OCTFileGetIntensity et OCTFileGetPhase, respectivement, et prenez la moyenne des images enregistrées. Ces fonctions sont fournies dans le SDK MATLAB dans le package ThorImageOCT.
3. Obtenez l’emplacement des pixels du bord supérieur de l’échantillon en binarisant l’image et en détectant les pixels blancs de haut en bas pour chaque colonne.
4. Extrayez la distribution de phase de l’image OCE le long de cette arête à l’aide de la fonction d’improfil et calculez la longueur d’arc cumulée en dimensions réelles. Calculez la longueur de l’arc en prenant la somme cumulée de la norme des différences d’échelle entre des points consécutifs dans les directions x et z.
5. Calculer la transformée de Fourier spatiale rapide de la distribution de phase OCT mesurée (c’est-à-dire à partir des images OCE) par rapport à la longueur d’arc cumulée à l’aide de la fonction plomb.
6. Déterminez l’emplacement du pic dans le spectre. Cet emplacement représente la fréquence spatiale de l’onde. Calculer la vitesse de l’onde (ou vitesse de phase) à partir du rapport entre la fréquence d’excitation du transducteur (unités de Hz) et la fréquence spatiale (unité de longueur inverse).

Results

Dans cette étude, nous avons utilisé des biofilms granulaires (également appelés boues granulaires), qui ont été obtenus commercialement. Les granulés sont des biofilms sphériques qui se forment par auto-agrégation, ce qui signifie qu’ils n’ont pas besoin d’un support ou d’une surface sur laquelle se développer²⁶. La figure 3A montre une image OCT en coupe transversale représentative qui résulte de la variation spatiale de l’indice de réfraction local dans un biofilm granulaire. Le biofilm a un diamètre nominal de 3 mm. Certaines des caractéristiques internes, y compris les pores et les vides proches de la surface de l’échantillon, sont visibles sur l’image. Une diffusion optique accrue le long de la profondeur de l’échantillon empêche la source lumineuse OCT d’atteindre le centre de l’échantillon, rendant ainsi la région centrale dépourvue de toute information discernable. La figure 3B montre l’image OCE en coupe transversale de l’échantillon pour une fréquence d’excitation du transducteur de 5,1 kHz. Le contraste local dans l’image est corrélé au déplacement vertical local induit par l’onde élastique se propageant dans l’échantillon. L’espacement physique des franges le long du trajet de propagation correspond à la longueur d’onde de l’onde de surface élastique. L’onde de surface se propage près de la surface de l’échantillon et a une profondeur de pénétration proche de la longueur d’onde. L’étendue spatiale du déplacement des ondes de surface n’est pas visible sur l’image en raison de la pénétration optique limitée de la source lumineuse OCT dans l’échantillon. La distribution optique de la phase le long du trajet de propagation de l’onde élastique (Figure 4A) est utilisée pour déterminer la fréquence spatiale de l’onde de surface. La fréquence spatiale est obtenue en prenant la transformée de Fourier rapide (FFT ; Figure 4B) des données et en sélectionnant la fréquence à laquelle l’amplitude du spectre FFT est la plus grande.

Il est crucial de sélectionner une tension de générateur de fonction d’une amplitude suffisante pour produire un motif de franges qui présente un contraste optimal dans l’image OCE. Cependant, les tensions excessivement élevées doivent être évitées car cela peut entraîner un enroulement de phase dans l’image OCE, comme illustré à la figure 5A. L’enroulement de phase se produit parce que la différence de phase optique dans la mesure est limitée à l’intervalle entre -π et π. Lorsque la phase dépasse l’une de ces limites, elle est pliée à la limite opposée, créant une distribution de phase discontinue. Par conséquent, la nécessité d’un déballage de phase se fait sentir, ce qui pose des défis et peut introduire des inexactitudes potentielles. Un autre facteur à prendre en compte pour des mesures précises des vagues est le nombre de franges présentes dans l’image de l’OCE. Aux basses fréquences des transducteurs, illustrées à la figure 5B, un cycle d’oscillation complet de l’onde de surface peut ne pas être entièrement capturé en raison de la petite taille du granule, et le spectre FFT peut donner des estimations erronées de la fréquence spatiale (ou de la longueur d’onde inverse). Une autre source d’erreur dans l’estimation de la fréquence spatiale est la présence de modes d’ondes élastiques qui se chevauchent spatialement, tels que les ondes de surface et les ondes de cisaillement en vrac, dans l’image OCT. Ces modes d’onde se mélangent, créant des modèles d’interférence complexes qui peuvent être difficiles à analyser. La présence de différents modes d’onde au-delà des ondes de surface peut introduire des effets d’interférence près du transducteur, en fonction de l’échantillon, de la fréquence d’excitation et de l’amplitude spécifiques. La figure 6 est un exemple d’image OCE obtenue avec une fréquence d’excitation de 5,5 kHz, dans laquelle une onde de cisaillement en vrac près du point d’excitation local interfère avec le champ d’onde de surface. La figure 7A représente une distribution de phase qui diverge du modèle d’onde sinusoïdale décroissante observé dans la figure 4A, attribué à la combinaison des modes d’onde. Par conséquent, la FFT résultante présente un pic plus large, comme le montre la figure 7B. Le même phénomène peut se produire à proximité de défauts tels que des vides ou des régions présentant des variations marquées des propriétés élastiques/viscoélastiques. Dans ces zones, le champ de déplacement local est modifié en raison de l’interférence de l’onde incidente ou de surface et des ondes diffusées par le défaut.

Nous avons calculé la vitesse d’onde pour l’onde de surface à des fréquences comprises entre 4,0 et 9,6 kHz pour deux biofilms granulaires de diamètres nominaux différents (4,3 mm et 3,3 mm). Les graphiques de vitesse des vagues sont appelés courbes de dispersion. Pour les réglages utilisés, chaque mesure de dispersion a pris environ 15 min. Dans l’intervalle de fréquence sélectionné, plusieurs cycles du profil de déplacement sinusoïdal sont présents dans les images OCE, permettant une détermination précise de la fréquence spatiale avec un contraste de phase notable. La figure 8 illustre les courbes de dispersion obtenues. Ces courbes représentent les courbes de dispersion moyennes pour trois emplacements dans chaque échantillon. Les vitesses d’onde de surface approchent d’une valeur constante, appelée vitesse d’onde de Rayleigh, c_R, qui est liée au module de cisaillement de l’échantillon par la relation,

c_R = ((0,862 + 1,14ν)/ (1 + ν)) x (G/r)^1/2

où, G est le module de cisaillement, r est la masse volumique et ν est le coefficient de Poisson^27,28. Elle est constante car la profondeur de pénétration de l’onde élastique est plus courte que le diamètre de l’échantillon. Essentiellement, l’onde élastique se déplace près de la surface de l’échantillon avec une vitesse d’onde directement proportionnelle au carré du module de Young²⁸. Cependant, en raison du bruit de mesure, la vitesse des vagues n’est pas entièrement constante dans cette gamme de fréquences. Nous prenons la moyenne des vitesses d’onde pour des fréquences comprises entre 6,0 et 9,6 kHz pour le plus petit échantillon et entre 4,0 et 9,6 kHz pour le plus grand échantillon. Cette vitesse d’onde moyenne est ensuite utilisée pour estimer le module de Young de l’échantillon.

Nous supposons que l’échantillon est incompressible en raison de sa forte teneur en eau. En tant que tel, ν = 0,5. Ainsi, c_R est directement lié à E = 3G pour un solide incompressible, où E est le module de Young de l’échantillon^27,28. Les lignes pointillées de la figure 8 représentent les vitesses des ondes de Rayleigh pour les différents échantillons. Nous supposons une composition de biofilm composée principalement d’eau, donnant une densité de 1000 kg/m³. Par conséquent, le module de Young calculé des biofilms granulaires est de 85 kPa et de 205 kPa pour les biofilms granulaires d’un diamètre nominal de 4,3 mm et 3,3 mm, respectivement. Cette mesure confirme la capacité de la technique à discerner les différences de propriétés mécaniques entre les biofilms.

Figure 1 : Configuration de l’élastographie par cohérence optique. Le schéma du système utilisé ici est illustré dans la figure. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Échantillon monté. Le biofilm granulaire est positionné sur le porte-échantillon tandis que le transducteur entre en contact doux avec celui-ci. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Images OCT et OCT d’un biofilm granulaire. (A) Image OCT. (B) Image OCE pour une onde de surface se propageant à 5,1 kHz montrant un bon contraste de franges. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 4 : Distribution de phase et FFT. Pour l’image de la figure 3B, (A) la distribution de la différence de phase le long du bord supérieur de l’échantillon et (B) la FFT de la distribution de la différence de phase montrant un pic étroit. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 5 : Images OCT et OCT d’un biofilm granulaire. (A) Image OCE pour une onde de surface se propageant à 5,1 kHz montrant l’enroulement de phase. (B) Image OCE pour une onde de surface se propageant à 1,3 kHz sans cycle complet. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 6 : Image des CEO montrant une combinaison de modes. Cette image provient d’un autre endroit de l’échantillon et illustre la combinaison des modes d’une onde se propageant à 5,5 kHz. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 7 : Distribution de phase et FFT. Pour l’image de la figure 6, (A) la distribution de la différence de phase le long du bord supérieur de l’échantillon et (B) la FFT de la distribution de la différence de phase montrant un pic plus large. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 8 : Courbes de dispersion. La vitesse d’onde dans deux échantillons de tailles différentes est indiquée à des fréquences différentes avec des barres d’écart-type. La vitesse de l’onde de Rayleigh correspondante pour la partie plate des courbes est tracée en haut. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

La profondeur d’imagerie réalisable dans le système OCT est déterminée par le degré de pénétration de la lumière de la source lumineuse, qui dépend de la longueur d’onde de la source. De plus, la longueur d’onde détermine la résolution axiale. Les longueurs d’onde plus longues peuvent pénétrer plus profondément dans l’échantillon, mais au détriment d’une résolution axiale réduite par rapport aux longueurs d’onde plus courtes. La résolution transversale, en revanche, dépend à la fois de l’ouverture numérique du système et de la longueur d’onde, les longueurs d’onde plus courtes offrant une résolution plus élevée. L’augmentation de l’ouverture numérique introduit un compromis en limitant la profondeur de champ²⁹. La résolution spatiale est limitée à la longueur d’onde élastique la plus courte pouvant être détectée avec un rapport signal/bruit suffisant. La méthodologie actuelle de l’OCE est limitée à 0,5 mm ^9,30. Bien que cette technique soit limitée par la taille de l’échantillon, elle devrait être applicable à divers types de biofilms. La forme du biofilm, granuleux ou plat, n’inhibera pas la technique. La transparence de l’échantillon joue également un rôle dans la détermination de la profondeur de pénétration. Les matériaux à haute transparence permettent à la lumière de traverser tout l’échantillon, le rendant imperceptible à l’observation, tandis que les échantillons opaques empêchent la pénétration de la lumière, produisant un minimum de détails sur leur structure interne ^9,28. Dans le cadre de cette étude, une profondeur de pénétration de l’ordre du millimètre suffit.

Un autre problème possible pour ces mesures est que dans les échantillons plus grands, dans lesquels la taille ne limite pas le nombre de cycles d’ondes élastiques, le champ de vision (FOV) du microscope OCT peut être le facteur limitant du nombre de cycles mesurés. Pour les mesures ici, le champ de vision est limité à 9 mm par 9 mm ; ainsi, les longueurs d’onde élastiques supérieures à 9 mm ne peuvent pas être résolues dans ce microscope OCT. L’utilisation d’une lentille avec un champ de vision plus large permettrait d’imager des échantillons plus grands, produisant plus de franges à ces basses fréquences. Des défis surgissent également à des fréquences plus élevées. Pour les échantillons de cette étude, au-delà de 10 kHz, l’onde subit une atténuation significative, diminuant l’amplitude de la distribution de la différence de phase et compliquant la détermination de la fréquence spatiale. Ce problème peut être atténué en augmentant la tension du générateur de fonctions, augmentant ainsi le déplacement du transducteur. Cependant, augmenter le déplacement n’est utile que jusqu’à un certain point, car cela finira par se terminer par un enroulement de phase⁹. Alternativement, l’amélioration de la sensibilité du système par la mise en œuvre d’une source lumineuse de puissance plus élevée peut contrecarrer l’enroulement de phase causé par des déplacements plus importants et faciliter la détection de la réponse dynamique à des excitations plus petites. Une sensibilité plus élevée facilite la mise en œuvre de méthodes acoustiques OCE qui offrent l’avantage d’une charge sans contact mais qui sont plus profondément affectées par la forte atténuation³¹.

Lors de la réalisation de ces mesures sur des biofilms, il est crucial de garder les échantillons hydratés. Le séchage entraîne une augmentation indésirable de la rigidité, ce qui n’est pas pertinent puisque l’accent est mis sur l’évaluation des propriétés de l’échantillon dans son environnement d’origine. Nous n’avons pas étudié l’assèchement induit par l’éclairage. Cependant, nous remarquons que de l’eau de l’environnement naturel a été ajoutée périodiquement tout au long de la mesure, et pendant ce temps, la morphologie de l’échantillon a été surveillée à l’aide des images OCT, et aucun changement perceptible dans la morphologie n’a été observé. De plus, lors du positionnement de la sonde et de la capture d’images OCE, il est essentiel de tenir compte des caractéristiques discernées dans l’image OCT. Les hétérogénéités le long du trajet de propagation des ondes peuvent fausser le champ d’ondes et doivent donc être évitées⁹. De plus, le maintien d’un contact doux avec le biofilm est crucial, car une pression excessive sur l’échantillon, en plus de modifier potentiellement ses caractéristiques mécaniques, pourrait également entraîner une distorsion du champ d’ondes. Enfin, la région de balayage doit être perpendiculaire aux fronts d’onde pour garantir que la fréquence spatiale de l’onde harmonique est déterminée avec précision à partir de la mesure.

Pour certaines fréquences, des variations significatives de la vitesse des ondes ont été observées dans les deux échantillons, ce qui peut être attribué à leurs hétérogénéités inhérentes, au champ d’onde à cette fréquence spécifique et à la morphologie des chemins de propagation. Nous avons précédemment montré que le profil de vitesse d’onde mesuré à travers un biofilm granulaire sectionné n’est pas uniforme en raison de la microstructure hétérogène⁹. Par conséquent, lors de l’utilisation de cette technique sur des biofilms granulaires, il est impératif d’effectuer des mesures à plusieurs endroits de l’échantillon pour obtenir une représentation moyenne.

Une observation importante concernant les courbes de dispersion est qu’elles présentent des comportements distincts pour différentes tailles d’échantillon. Dans le cas d’un échantillon plus grand, la courbe reste relativement constante sur toute la plage mesurée. Cependant, pour le plus petit échantillon, il y a une tendance à la hausse de la vitesse des vagues avec l’augmentation de la fréquence, en particulier dans la partie inférieure de la gamme. Ce phénomène peut être attribué à la présence d’effets viscoélastiques aux basses fréquences et à la génération de modes de guides d’ondes élastiques. Nous avons pris en compte ces effets dans nos travaux précédents en utilisant des modèles inverses plus sophistiqués ^8,9,18.

Il est important de noter que dans les systèmes granulaires aérobies, la biomasse n’est pas répartie uniformément sur toute la hauteur du réacteur. Pendant les phases de non-aération, les granulés plus gros ont tendance à se déposer au fond du réacteur. Cette répartition inégale fait que des agrégats de différentes tailles ont accès à des quantités variables de substrat. Par conséquent, les agrégats de différentes tailles présentent une composition communautaire distincte. De plus, comme l’excès de boue est éliminé de manière sélective, les granulés plus gros ont tendance à être retenus dans le réacteur pendant de plus longues périodes, tandis que les plus petits sont plus faciles à éliminer³². La différence notable dans le module de Young suggère un lien potentiel entre la composition du biofilm, l’âge et les propriétés mécaniques.

En résumé, la méthode d’élastographie par cohérence optique (OCE) offre un moyen rapide et non destructif d’évaluer la vitesse des ondes élastiques dans les biofilms. Cette méthode surmonte les contraintes des mesures rhéologiques et présente des attributs améliorés par rapport aux autres techniques d’élastographie ^8,18. De plus, son applicabilité s’étend au-delà des biofilms granulaires pour englober tout échantillon partiellement transparent avec une profondeur de pénétration optique appropriée et une taille suffisamment grande pour être résolue par le système, y compris des exemples comme les hydrogels³³, la cornée³⁴ et la peau³⁵. Les progrès futurs de la méthode englobent plusieurs aspects clés. Tout d’abord, l’augmentation de la fréquence des ondes élastiques harmoniques dans la gamme des centaines de kHz permettra d’obtenir des longueurs d’onde de quelques micromètres, atteignant ainsi une résolution spatiale à une échelle similaire. Deuxièmement, le rapport signal/bruit du système de détection optique sera amélioré en augmentant la puissance optique du système OCT de 2 mW (courant) à 20 mW. Enfin, nous remplacerons l’actionneur harmonique de contact par une source de pression de rayonnement acoustique sans contact. Cet ajout facilitera le fonctionnement non invasif et non destructif et permettra d’interroger des échantillons de biofilm dans leur environnement d’origine.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Porte-échantillon
3D Pointe			de 3 mm de largeur
	N’importe quelle marque
Générateur de retard	Stanford Research Systems	DG535	DG535 Générateur numérique de retard/d’impulsions  ;
Générateur de fonctions	Agilent Technologies		33250A 80 MHz Générateur de fonctions / formes d’onde arbitraires
Biofilm granulaire	Systèmes		obtenus à partir d’un réacteur à boues granulaires aérobies (Aqua-Aerobic Systems, Inc.)
MATLAB	MathWorks		Release 2022a (MATLAB 9.12)
Sonde piézoélectrique	Thorlabs	PK2JUP1	Discrete Piezo Stack, 75 V, 30.0 & micro ; m Déplacement
Système SD-OCT	Thorlabs		Ganymede II, LSM03 objectif de balayage
ThorImageOCT	Thorlabs		Version : 5.5.5