Aplysia californica neurones de développer des cônes de croissance important dans la culture qui sont excellents pour l'imagerie haute résolution de la motilité du cône de croissance et d'orientation. Ici, nous présentons un protocole pour la dissection et le placage de neurones cellulaires aplysie sac ainsi que pour la mise en place d'une chambre pour l'imagerie de cellules vivantes.
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Article de méthode
Cultures de cellules neuronales de l'aplysie pour l'imagerie haute résolution des cônes de croissance
Dans cet article
Résumé
Résumé
Cônes de croissance neuronale sont les structures très mobiles à la pointe des axones qui peut détecter des signaux de guidage dans l'environnement et transduire cette information dans le mouvement directionnel vers la cellule cible appropriée. Pour bien comprendre comment les informations de guidage est transmis de la surface de la cellule à l'dynamique sous-jacente des réseaux du cytosquelette, on a besoin d'un système modèle approprié pour l'imagerie de cellules vivantes de la dynamique des protéines à résolution temporelle et spatiale élevée. Typiques des cônes de croissance de vertébrés sont trop petits pour analyser quantitativement F-actine et la dynamique des microtubules. Les neurones de la californica lièvre de mer Aplysia sont 5-10 fois plus grandes que les neurones des vertébrés, peuvent facilement être conservés à température ambiante et sont des cellules très robuste pour la micromanipulation et de mesures biophysiques. Leurs cônes de croissance ont de très défini régions cytoplasmiques et d'un système bien décrit cytosquelette. Les corps cellulaires des neurones peut être microinjectés avec une variété de sondes pour étudier la motilité du cône de croissance et d'orientation. Dans le présent protocole, nous démontrons une procédure pour la dissection du ganglion abdominal, la culture cellulaire des neurones sac et mise en place d'une chambre d'imagerie pour l'imagerie de cellules vivantes des cônes de croissance.
Protocole
Solutions
- L15-ASW milieu de culture cellulaire (1L)
- 1 sachet de poudre à L15
- Ajouter 800 ml de H 2 O ultrapure
- NaCl 400 mM
- MgSO 4 27 mM
- MgCl 2 28 mM
- L-Glutamine 4 mM
- Gentamicine 50 pg / ml
- HEPES 5 mM
- Ajuster le pH à 7,9
- Ajouter goutte à goutte CaCl2 9,3 mM (arrêt si précipités)
- Ajouter H 2 O ultrapure à 1 l
- Vérifiez osmolarité (950-1000 mmol / kg) avec osmomètre (pression de vapeur, Wescor # 5520)
- Filtre 0,22 um en utilisant une unité de filtration à pression positive (Filtre....
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Discussion
Aplysie neurones cellulaires sac fournir un milieu sans sérum système neuronal de culture cellulaire avec très peu de cellules non-neuronales. Ces neurones forment des cônes de croissance très grand approprié pour aborder un certain nombre de questions importantes de cellules biologiques. Neurones cellulaires sac peut être facilement manipulé et imagée à la température ambiante pendant plusieurs heures. Utiliser fluorescent chatoiement de microscopie (FSM), on peut analyser quantitativement les différents paramètres de F-actine et la polymé.......
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Remerciements
Nous tenons à remercier Ryan Maneri (Productions Huîtrier, LLC) pour le tournage de notre procédure et Rodney McPhail (Département des sciences biologiques, Université de Purdue) pour l'aide à l'édition de la vidéo de dissection. La recherche dans le laboratoire de Suter est soutenu par des subventions du NIH (R01 NS049233) et le Centre Bindley Bioscience à l'Université Purdue à DMS
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires | |
|---|---|---|---|---|
| Couvre-objets en verre #1 22x22 mm | Outil | VWR international | 48366067 | |
| Couvre-objets en verre #1,5 22x22 mm | Outil | Corning | 2870-22 | |
| Boîtes de Pétri de 35 mm | Outil | Falcon BD | 353001 | |
| Filtres pour la filtration du milieu | Outil | EMD Millipore | SVGV010RS | |
| Graisse à vide haute performance | Outil | Dow Corning | 1597418 | |
| Osmomètre | Outil | Wescor | 5520 | |
| Calages en plastique | Outil | Small Parts, Inc. | SHSP-200 | |
| Chlorure de calcium | Réactif | Fisher Scientific | C79-500 | |
| Gentamicine | Réactif | Invitrogen | 15750-060 | |
| HEPES | Réactif | Sigma-Aldrich | H4030 | |
| Milieu L15 | Réactif | Invitrogen | 41300-039 | |
| L-glutamine | Réactif | Sigma-Aldrich | G8540 | |
| Chlorure de magnésium | Réactif | Mallinckrodt Baker Inc. | 5958-04 | |
| Sulfate de magnésium | Réactif | Mallinckrodt Baker Inc. | 6070-12 | |
| Poly-L-lysine (70-150 kD) | Réactif | Sigma-Aldrich | P6282 | |
| Chlorure de sodium | Réactif | Mallinckrodt Baker Inc. | 7581 | |
| Protéase neutre (Dispase) | Réactif | Worthington Biochemical | LS02111 |
Références
- Forscher, P., Kaczmarek, L. K., Buchanan, J. A., Stephen, S. J. Cyclic AMP induces changes in distribution and transport of organelles within growth cones of Aplysia bag cell neurons. J. Neurosci. 7, 3600-3611 (1987).
- Suter, D. M., Errante, L. D., Belotserkovsky, V., Forscher, P.
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Réimpressions et autorisations
