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Surveillance de la glycémie chez la progéniture de souris après une injection intracytoplasmique de spermatozoïdes

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DOI :

10.3791/66212

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17 mai 2024

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1Shanghai-MOST Key Laboratory of Health and Disease Genomics, 2NHC Key Lab of Reproduction Regulation, 3Shanghai Institute for Biomedical and Pharmaceutical Technologies, 4International Peace Maternity and Child Health Hospital, 5School of Medicine, Shanghai Jiao Tong University, 6Shanghai Key Laboratory of Embryo Original Diseases

Dans cet article

Résumé

Ici, nous présentons un protocole pour établir un modèle murin d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI)-transfert d’embryon (ET), nous permettant d’observer les changements liés à l’âge dans le métabolisme du glucose qui peuvent être attribués à l’ICSI, donnant ainsi un aperçu de ses impacts potentiels à long terme sur le développement humain.

Résumé

La durée de vie humaine est considérablement longue, tandis que les modèles murins peuvent simuler toute la durée de vie humaine sur une période relativement courte, avec une année de vie de souris à peu près équivalente à 40 années humaines. L’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) est une technologie de procréation assistée couramment utilisée dans la pratique clinique. Cependant, étant donné son émergence relativement récente il y a environ 30 ans, les effets à long terme de cette technique sur le développement humain restent incertains. Dans cette étude, nous avons établi la méthode ICSI combinée à la méthode de transfert d’embryons (TE) à l’aide d’un modèle murin. Les résultats ont démontré que les spermatozoïdes de souris normaux, après avoir subi une culture in vitro et une ICSI ultérieure, présentaient un taux de fécondation de 89,57 % et un taux de 87,38 % sur deux cellules. Après l’ET, le taux de natalité de la progéniture était d’environ 42,50 %. De plus, à mesure que les souris vieillissaient, des fluctuations du métabolisme du glucose ont été observées, ce qui peut être associé à l’application de la technique ICSI. Ces résultats signifient que la technique ICSI-ET de souris fournit une plate-forme précieuse pour évaluer l’impact des anomalies des spermatozoïdes sur le développement de l’embryon et leurs effets à long terme sur la santé de la progéniture, en particulier en ce qui concerne le métabolisme du glucose. Cette étude fournit des informations importantes pour la poursuite des recherches sur les effets potentiels de la technique ICSI sur le développement humain, en soulignant la nécessité d’une enquête approfondie sur les implications à long terme de cette technologie.

Introduction

Les questions de fertilité sont devenues un sujet de préoccupation majeur pour la médecine et la sociologie, en particulier dans la société moderne où la baisse des taux de fécondité et la gravité croissante de la prévalence et de la gravité de l’infertilité ont pris de l’importance. La technologie de procréation assistée (ART) offre un large éventail de possibilités pour relever ces défis, l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) étant couramment utilisée comme intervention thérapeutique.

Depuis que Palerme a signalé la première grossesse réussie obtenue par injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) en 1992, l’ICSI est devenue une technique pivot dans les technologies de procréation assistée (ART)1. Cependant, étant donné que l’ICSI n’est utilisée en milieu clinique que depuis 30 ans, une période relativement courte par rapport à la durée de vie humaine, les effets à long terme de l’ICSI, en particulier sur le développement de la progéniture, n’ont pas été étudiés et élucidés de manière approfondie. À l’heure actuelle, les souris caractérisées par leur patrimoine génétique uniforme et leur durée de vie plus courte sont apparues comme un modèle alternatif largement utilisé dans la recherche médicale. De plus, le modèle murin peut récapituler l’ensemble de la durée de vie humaine dans un laps de temps compressé, où un an chez la souris correspond à peu près à 40 ans chez l’homme2.

Au cours de la dernière décennie, plusieurs études à petite échelle ont révélé que les personnes conçues par ICSI pourraient présenter un risque accru de développer des syndromes métaboliques, tels que des taux de sucre dans le sang anormaux, plus tarddans la vie3,4. Bien que les preuves ne soient pas définitives, cette découverte a néanmoins soulevé de sérieuses inquiétudes au sein de la communauté scientifique quant aux implications à long terme de l’ICSI sur la santé. Cette situation souligne le besoin urgent d’évaluations plus rigoureuses du TAR et de ses conséquences à long terme sur la santé. En particulier à la lumière des limites et des considérations éthiques des études humaines, il est devenu de plus en plus crucial de développer des modèles animaux capables de récapituler précisément le développement de la progéniture humaine après l’ICSI. Dans ce contexte, le modèle ICSI-ET (Intracytoplasmic Sperm Injection-Embryo Transfer) de souris, en raison de sa capacité à imiter l’ICSI humaine et à faciliter le suivi à long terme des résultats de santé de la progéniture, est devenu un outil efficace pour évaluer les risques potentiels pour la santé de la technologie ICSI pour la progéniture5.

Cette étude vise à étudier l’impact de la technologie ICSI-ET sur un phénotype métabolique prévalent, à savoir la santé métabolique du glucose de la progéniture, en utilisant la surveillance aléatoire de la glycémie, les tests de glycémie à jeun et les tests de tolérance au glucose pour évaluer l’état métabolique du glucose chez la souris. La surveillance aléatoire de la glycémie est utilisée pour capturer les fluctuations naturelles du métabolisme du glucose pendant les activités physiologiques normales, tandis que les tests de glycémie à jeun et de tolérance au glucose sont utilisés pour évaluer les états prédiabétiques potentiels.

Protocole

Le protocole de l’ICSI-ET décrit ci-dessous suit les directives et a été approuvé par l’examen éthique des animaux de l’Institut de recherche de Shanghai sur la planification familiale. Procédures de sécurité : Portez toujours un équipement de protection individuelle (EPI) approprié lorsque vous manipulez des produits chimiques ou des matières biologiques. Utilisation des hottes : Effectuer toutes les procédures impliquant la génération de produits chimiques volatils ou d’aérosols dans une hotte ou une enceinte de biosécurité certifiée. Utilisez des souris femelles (souche B6D2F1 âgée de 6 à 8 semaines) pour la procédure de superovulation.

1. ICSI chez la souris

  1. Superovulation de souris
    1. Administrer une injection intrapéritonéale de gonadotrophine sérique de jument gestante (PMSG) à une dose de 7,5 UI par souris vers 20h00 le premier jour.
    2. Administrer une injection intrapéritonéale de gonadotrophine chorionique humaine (HCG) à une dose de 7,5 UI par souris vers 20h00 (48 heures après l’injection de PMSG) le troisième jour.
  2. Préparez le milieu de FASS en aliquotes de 1 mL et laissez-les à découvert pour une équilibrage nocturne à 37 °C dans un incubateur à 5 % de CO2 le même jour que l’injection d’HCG chez les souris femelles.
  3. Préparation des gouttelettes de fécondation ICSI
    1. Le même jour que l’injection d’HCG chez les souris femelles, divisez le couvercle d’une boîte de culture cellulaire de 50 x 9 mm en moitiés supérieure et inférieure. Utilisez la moitié supérieure pour créer 4 à 6 gouttelettes de 5 μL chacune, en utilisant 10 % de polyvinylpyrrolidone (PVP) pour le placement des spermatozoïdes. Utilisez la moitié inférieure pour créer 8 à 10 gouttelettes de 5 μL chacune, en utilisant un milieu M2 pour la procédure ICSI.
    2. Couvrez les gouttelettes PVP et M2 moyennes avec environ 3 ml d’huile minérale (Figure 1).
  4. Préparation des plats de culture
    1. Le même jour que l’injection de HCG chez les souris femelles, distribuer uniformément 12 gouttes de milieu KSOM (MR-020P-D) de 20 μL dans une boîte de culture cellulaire de 35 x 10 mm. Couvrez les gouttes d’environ 3 ml d’huile minérale.
  5. Prélèvement de spermatozoïdes :
    1. Euthanasier les souris mâles par luxation cervicale vers 9h00 le quatrième jour (13 h après l’injection d’HCG).
    2. Isolez la queue de l’épididyme et nettoyez-la soigneusement pour éliminer tout tissu adipeux et restes de sang en épongeant doucement avec de la gaze stérile et en rinçant dans un milieu HTF préchauffé.
    3. Ouvrez la queue de l’épididyme pour permettre aux spermatozoïdes de nager librement dans le milieu HTF. Pressez doucement la queue de la queue à l’aide d’une pince pour libérer les spermatozoïdes, rassemblez-les dans des tubes HTF pré-équilibrés et gardez-les à découvert dans un incubateur à 37 °C, 5 % de CO2 pour la capacitation des spermatozoïdes pour une utilisation ultérieure.
  6. Prélèvement d’ovocytes
    1. Euthanasier des souris femelles stimulées pour le prélèvement d’ovocytes par luxation cervicale vers 9h30 le quatrième jour. Faites soigneusement une incision le long de la ligne médiane de la peau abdominale et de la couche musculaire pour exposer la cavité abdominale.
    2. À l’aide d’une pince fine, isolez délicatement les tissus des deux côtés des oviductes, en particulier les régions d’ampoule enflées, et transférez-les dans un milieu M2 dans une boîte de culture stérilisée. Répétez cette procédure jusqu’à ce que les oviductes de toutes les souris désignées soient recueillis.
    3. À l’aide d’un microscope à dissection, à l’aide d’une aiguille de seringue de 1 ml, perforer doucement la section transparente de l’ampoule gonflée de l’oviducte, facilitant ainsi la libération des complexes cumulus-ovocytes (COC) dans le milieu.
    4. À l’aide de la même seringue, prélevez et transférez soigneusement les COC dans une nouvelle boîte contenant 100 μL de milieu frais M2. Répétez cette étape jusqu’à ce que tous les COC soient transférés avec succès à partir des segments d’oviducte d’origine.
    5. Essuyez le sang et les liquides tissulaires et, à l’aide d’un microscope à dissection, déchirez l’ampoule de l’oviducte à l’aide d’une aiguille de 25 G, ce qui entraîne la libération de nombreux COC.
    6. Retirez l’oviducte et les fragments de tissu, transférez les COC dans des gouttelettes de milieu M2 contenant de l’hyaluronidase (HY) et préchauffez-les à 37 °C.
    7. Après une incubation d’environ 5 min, effectuer un pipetage doux pour faciliter la séparation des cellules des cumulus et des ovocytes. Transférer les ovocytes de la métaphase II (MII) de la solution contenant du HY dans un milieu M2 frais ; ensuite, effectuez le transfert séquentiel dans plusieurs gouttelettes de milieu M2.
    8. Après 2-3 cycles de lavage, transférez les ovocytes dans des gouttelettes de milieu de culture KSOM et conservez-les dans un incubateur à 37 °C et 5 % de CO2 pour une utilisation ultérieure.
  7. Vers 10h00 le quatrième jour, sonicez 100 μL des spermatozoïdes capacités (voir étape 1.5.2.) pendant 5 s pour séparer les têtes des queues à une fréquence de 46 kHz, avec un réglage de puissance de 50 watts.
    REMARQUE : Lorsque vous sonicez des spermatozoïdes pour tronquer la queue, soyez prudent pour contrôler le temps, qui ne doit pas dépasser 5 s. Quelques secondes après la sonication, les spermatozoïdes peuvent être observés au microscope inversé ; Arrêtez de sonicer lorsqu’environ la moitié des spermatozoïdes présentent des queues tronquées.
  8. Procédure ICSI
    1. Pour l’injection, utilisez une aiguille de micromanipulation disponible dans le commerce avec une pointe plate et un diamètre intérieur de 6 μm, réglée à un angle de 25°. Remplissez l’aiguille avec le liquide opératoire avec la partie remplie mesurant une longueur de 0,5 cm à l’intérieur de l’aiguille. Assurez-vous que le niveau du liquide atteint ~0,5 cm.
      REMARQUE : Maintenir la température ambiante à 19 °C pendant l’injection pour éviter les températures élevées qui peuvent réduire le taux de survie des ovocytes fécondés. La précision avec laquelle le niveau de liquide atteint 0,5 cm est cruciale pour maintenir l’intégrité du processus d’injection et assurer la viabilité des ovocytes.
    2. Installez l’aiguille d’injection sur le bras droit du micromanipulateur, solidement fixée en serrant le capuchon de maintien. Installez une pipette de retenue de micromanipulation à pointe plate disponible dans le commerce, conçue pour les ovocytes de souris, sur le bras gauche du micromanipulateur, et positionnez l’aiguille d’injection et la pipette de maintien dans le champ de vision du microscope.
    3. Ajoutez 1 μL de spermatozoïdes soniqués à une gouttelette de solution PVP à l’aide d’une pipette.
    4. Placez 20 ovocytes MII dans une gouttelette de milieu M2.
    5. Utilisez l’aiguille d’injection pour aspirer 10 à 20 têtes de spermatozoïdes dans une solution PVP. Ensuite, déplacez l’aiguille d’injection dans la gouttelette contenant les ovocytes.
    6. Déterminez directement la position du fuseau de métaphase dans l’ovocyte à l’aide d’un microscope à polarisation pour vous assurer que l’appareil du fuseau n’est pas du côté de l’injection, le corps polaire étant généralement situé à la position 12 heures ou 6 heures par rapport à l’orientation de l’ovocyte.
    7. Gardez l’ovocyte en contact avec le fond de la boîte de culture. Ajustez le plan focal de manière à ce que la zone pellucide de l’ovocyte et l’aiguille d’injection soient dans le même plan.
    8. Au contact de l’aiguille d’injection avec la zone pellucide, appliquez une légère pression négative sur l’aiguille d’injection, en aspirant une partie de la zone pellucide.
    9. Activez simultanément des impulsions piézoélectriques d’une intensité de 5 et d’une fréquence de 1, créant ainsi une perforation dans la zone pellucide et permettant à l’aiguille d’injection de passer à travers.
    10. Faites avancer l’aiguille d’injection dans l’espace périvitellin, en poussant la tête du spermatozoïde vers la pointe de l’aiguille. Insérez l’aiguille d’injection dans l’ovocyte jusqu’à ce qu’elle atteigne le côté opposé de la zone pellucide.
    11. Utilisez des impulsions piézoélectriques réglées sur une intensité de 1 et une fréquence de 1 pour créer un petit pore dans la membrane plasmique, en veillant à ce que la tête du spermatozoïde soit injectée dans l’ovoplasme avec une entrée minimale de PVP et une préservation optimale de l’intégrité de l’ovocyte.
    12. Répéter l’étape 1.8.11 jusqu’à ce que les 20 ovocytes soient injectés, suivis d’une incubation de 15 minutes à 19 °C.
    13. Transférez les ovocytes survivants dans le milieu KSOM et placez-les dans l’incubateur. Observez les taux de formation de 2 cellules, de 4 cellules, de morula et de blastocystes.
      REMARQUE : Le moment de l’injection intracytoplasmique d’un seul spermatozoïde (ICSI) dans l’ovocyte doit être contrôlé, dans le but de terminer la procédure dans les 14 à 18 heures suivant l’injection d’HCG.

2. Transplantation utérine de blastocystes de souris

  1. Préparation de souris mâles vasectomisées
    REMARQUE : Utilisez des souris mâles ICR âgées de 6 à 8 semaines pour l’étude.
    1. Induire l’anesthésie par injection intrapéritonéale de 1,25 % de 2,2,2-tribromoéthanol à une dose de 0,2 mL/10 g de poids corporel. L’absence de réponse à la douleur indique une anesthésie réussie.
      REMARQUE : Bien que le protocole actuel n’inclue pas l’application d’une pommade vétérinaire sur les yeux des animaux anesthésiés, il est recommandé comme pratique exemplaire pour prévenir la sécheresse oculaire et assurer la santé et le confort des animaux pendant les procédures. Tout au long du processus chirurgical et de récupération, tous les instruments chirurgicaux ont été stérilisés avant d’être utilisés, et la zone chirurgicale a été préparée à l’aide de solutions antiseptiques pour assurer un environnement opératoire propre.
    2. Pour vous protéger contre le stress ou les blessures potentiels, hébergez les souris qui ont subi une intervention chirurgicale individuellement pendant la phase de récupération initiale.
    3. Administrer la buprénorphine à une dose de 0,05 mg/kg de poids corporel pour assurer un soulagement optimal de la douleur.
      REMARQUE : Pour assurer le bien-être des souris, surveillez de près les souris pendant la période de récupération et ne les laissez pas sans surveillance jusqu’à ce qu’elles retrouvent une conscience suffisante pour maintenir la décubitus sternal.
    4. Préparez le site chirurgical au niveau de la région abdominale inférieure, au-dessus des testicules. Retirez la fourrure et désinfectez-la avec de la povidone iodée. À l’aide de ciseaux stériles, faites une incision longitudinale de 1 cm le long de la linea alba. Prélevez délicatement tout sang avec du papier stérile et sans poussière et procédez à la dissection brutale des muscles abdominaux le long de la linea alba et accédez à la cavité abdominale.
    5. À l’aide d’une pince incurvée, saisissez et exposez doucement le testicule gauche et son coussinet adipeux associé. Identifiez le canal déférent et isolez-le soigneusement à l’aide d’une pince pointue, en créant un segment de 10 mm pour la manipulation.
    6. Stérilisez les pinces incurvées en les maintenant dans la flamme extérieure d’une lampe à alcool pendant plusieurs secondes. Saisissez doucement le canal déférent, ce qui le fait s’aplatir et blanchir en raison de la cautérisation. Créez un deuxième point de cautérisation distal de 3 à 5 mm par rapport au premier. À l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles, exciser le segment du canal déférent entre les deux points de cautérisation.
    7. Inspectez soigneusement les extrémités cautérisées du canal déférent, en vous assurant qu’il reste un segment court, aplati et blanchi. À l’aide d’une pince incurvée, ramenez doucement le testicule et son coussinet adipeux associé dans la cavité abdominale.
    8. Répétez la procédure décrite à l’étape 2.1.6 sur le côté controlatéral (droit).
    9. Fermez le site chirurgical à l’aide de sutures, en plaçant généralement un point de suture dans la couche musculaire et trois points de suture dans la peau. Assurez-vous d’un bon alignement de l’incision chirurgicale et désinfectez avec de la povidone iodée. Transférez l’animal dans un coussin chauffant pour observation, en le surveillant pendant 10 à 15 minutes jusqu’à ce que l’animal reprenne conscience. Une fois rétabli, retournez l’animal dans sa cage d’hébergement.
      REMARQUE : Après une chirurgie de vasectomie, les souris ont besoin d’une période de récupération de 14 jours, suivie d’une expérience d’accouplement d’essai d’une semaine.
    10. Au cours de cette semaine, accouplez continuellement les mâles vasectomisés avec les femelles et observez l’état de gestation de toutes les femelles se présentant avec des bouchons copulateurs. La réussite de l’accouplement est indiquée par la présence d’un bouchon vaginal en bloc blanc jaunâtre au niveau de l’orifice vaginal de la souris femelle.
      1. Associez les souris entre 16h00 et 18h00 le premier jour et vérifiez les bouchons vaginaux entre 7h00 et 9h00 le deuxième jour. Considérez que les femelles avec des bouchons vaginaux sont dans un état pseudo-enceinte à 0,5 jour et utilisez-les pour des expériences ultérieures de transfert d’embryons. Renvoyez les femelles sans bouchons vaginaux dans le groupe récepteur.
        REMARQUE : Ces femelles sans bouchons vaginaux peuvent continuer à être utilisées pour l’accouplement afin de préparer les femelles pseudo-enceintes. S’assurer que toutes les femelles branchées ne tombent pas enceintes ; Ce n’est qu’alors que les mâles vasectomisés peuvent être utilisés pour des expériences formelles.
      2. Bien que les mâles vasectomisés puissent s’accoupler quotidiennement, prévoyez 1 jour de repos entre les séances d’accouplement.
        REMARQUE : D’après notre expérience, les mâles vasectomisés peuvent maintenir un taux de plug copulatoire élevé pendant plus d’un an. Cependant, les mâles vasectomisés qui ne produisent pas de bouchons copulatoires chez les femelles mâles pendant 4 à 6 tentatives consécutives doivent être retirés de l’étude.
  2. Préparation de femelles pseudo-gestantes
    1. Générer des souris femelles pseudo-enceintes en accouplant des souris femelles ICR (âgées de 7 à 10 semaines, pesant plus de 25 g) avec des souris mâles vasectomisées (âgées de 3 à 6 mois) dans un rapport de 1:1.
      REMARQUE : Les mâles vasectomisés ont été utilisés pour stimuler le col utérin des souris femelles, entraînant l’activation des corps jaunes.
  3. Préparation de la pipette pour le transfert des blastocystes
    1. Sortez les embryons à transplanter de l’incubateur et transférez-les dans une gouttelette de milieu M2 à une température de 37 °C.
    2. Utilisez une pipette de transfert pour aspirer un petit volume de liquide, aspirer une petite quantité d’air et aspirer 6 à 10 embryons. Enfin, aspirez un autre petit volume d’air pour sceller la pipette.
      REMARQUE : La longueur du fluide dans la pipette de transfert ne doit pas dépasser 0,5 cm.
  4. Transplantation utérine (blastocystes)
    1. Peser les souris femelles pseudo-enceintes (2,5 jours après l’accouplement) et les anesthésier par injection intrapéritonéale de 1,25 % de 2,2,2-tribromoéthanol à une dose de 0,2 mL/10 g de poids corporel. Appuyez doucement sur l’oreille avec une pince.
    2. Après avoir administré l’anesthésie aux souris et assuré l’asepsie par désinfection à l’alcool, faites une incision longitudinale médiane sur l’abdomen ventral. En profitant du tissu sous-cutané lâche, déplacez l’incision vers le côté gauche ou droit selon les besoins de la greffe. À l’aide de petits ciseaux, effectuez une dissection contondante de la couche musculaire de la paroi abdominale à ~0,5 cm latéralement de la colonne lombaire pour accéder à la cavité péritonéale.
    3. À l’aide d’une pince atraumatique, extériorisez soigneusement les ovaires, les oviductes et l’utérus.
    4. À l’aide de la pointe d’une aiguille de seringue, faites une petite incision inclinée vers le haut sur la paroi utérine sous la jonction utéro-tubaire, en évitant les vaisseaux sanguins. Cette incision permet d’accéder à la cavité utérine ; Insérez doucement l’oviducte de 2-3 mm à travers le petit trou.
    5. Expulsez avec précaution la petite bulle d’air à l’extrémité de la pipette de transfert tout en surveillant attentivement la pipette de transfert pendant l’injection lente des embryons. Une fois qu’il est confirmé que la partie centrale du milieu de culture a été expulsée, arrêtez la procédure et retirez délicatement la pipette de transfert.
    6. Repositionnez les ovaires, les oviductes et l’utérus dans la cavité abdominale. Suturez la couche musculaire et la peau séparément. Placez les souris sur un coussin chauffant jusqu’à ce qu’elles se remettent de l’anesthésie. Pour assurer le bien-être des souris, surveillez de près les souris pendant la période de récupération et ne les laissez pas sans surveillance jusqu’à ce qu’elles retrouvent une conscience suffisante pour maintenir la décubitus sternal.
  5. Observation de la grossesse
    1. Après la chirurgie, observez les souris pendant 18 à 21 jours pour surveiller le nombre de naissances. En cas de dystocie (accouchement difficile), effectuez une césarienne. Permettez aux souris nouveau-nées d’être nourries par des mères allaitantes du même groupe d’âge.

3. Test aléatoire de glycémie, de glycémie à jeun et de tolérance au glucose

  1. Suivi de la glycémie aléatoire pendant la croissance de la souris
    1. Depuis la naissance des souris, surveillez le taux de glucose sanguin aléatoire toutes les 4 semaines à 9 heures du matin après une bonne nuit de repas et de plaisir.
      1. Percez le bout de la queue de la souris pour obtenir du sang dans la veine de la queue.
      2. La première goutte de sang a une valeur de mesure de sucre plus élevée en raison de la présence du liquide tissulaire mélangé à celle-ci. Par conséquent, essuyez doucement la première goutte de sang à l’aide d’un papier absorbant propre.
      3. Mesurez la glycémie à partir de la deuxième goutte (~4 μL) de la veine de la queue à l’aide d’un glucomètre portatif.
  2. Suivi des changements de la glycémie à jeun et de la tolérance au glucose au cours du développement des souris
    REMARQUE : Étant donné que le premier point de prélèvement sanguin est de 15 minutes, toutes les souris doivent être injectées dans les 15 minutes. Étant donné que chaque injection chez la souris a duré 20 à 30 secondes, pour s’assurer que les injections sont terminées dans ce délai, le nombre maximum de souris pouvant être utilisées dans chaque test ne peut pas dépasser 30.
    1. Effectuez les tests de glycémie à jeun et de tolérance au glucose toutes les 4 semaines après la naissance chez les souris à jeun de nuit.
      1. Le premier jour, préparez de la litière fraîche en copeaux irradiés, des cages propres, des couvercles et des bouteilles d’eau. Transférez les souris dans une cage fraîche sans nourriture. Ajoutez des étiquettes de ne pas nourrir les cages.
      2. Préparez suffisamment de seringues injectables de glucose à 10 % (stériles et apyrogènes) et de 1 ml.
      3. Assurez-vous que les souris de chaque groupe jeûnent pendant 16 h, de 17h00 le jour 1 à 9h00 le jour 2, mais laissez libre accès à l’eau. Mesurez la glycémie à jeun comme décrit aux étapes 3.1.1.1-3.1.1.3 à l’aide d’un glucomètre.
    2. Pesez les souris et marquez leur queue pour faciliter une identification rapide. Préparez des seringues à glucose avec 10 μL/g de poids de souris.
    3. À intervalles de 30 s, injecter 10 μL/g de glucose dans la cavité intrapéritonéale de la souris.
      REMARQUE : Une attention particulière doit être accordée aux techniques d’injection ici pour éviter un volume d’injection de liquide imprécis. Les principaux points de fonctionnement sont les suivants :
      1. Immobilisez la souris et retenez la queue d’une main. Gardez la tête légèrement plus basse que les fesses afin que les organes de la cavité abdominale se déplacent vers la tête, laissant suffisamment d’espace d’injection.
      2. Positionnez l’aiguille entre la ligne médiane et l’os de la hanche, insérez-la à travers la peau à un angle de 45 degrés, puis guidez doucement l’aiguille plus profondément dans la cavité abdominale tout en la maintenant alignée parallèlement à la surface de la peau sur ~0,5 cm.
        REMARQUE : Faites attention à toute résistance pendant l’injection pour déterminer si les organes internes sont accidentellement perforés.
      3. Éjectez la seringue dans la cavité abdominale.
      4. Notez l’heure à laquelle l’injection a commencé et utilisez une minuterie pour contrôler le taux d’injection. Réglez la minuterie sur 90 s pour trois souris afin d’éviter de perdre du temps dans la manipulation de la minuterie.
    4. Prenez la mesure de la glycémie à partir de la veine de la queue aux intervalles souhaités (0 avant l’administration du glucose, 15, 30, 60, 90 et 120 min après la charge en glucose).
      REMARQUE : Les tests de glycémie ultérieurs doivent également prendre 20 à 30 s pour chaque souris.
    5. Renvoyez les souris dans leurs cages d’habitation équipées de nourriture et d’eau après l’expérience.

Résultats

Dans notre laboratoire, nous avons atteint un taux de fécondation de 89,57 % et un taux de 87,38 % sur 2 cellules en utilisant l’ICSI avec des spermatozoïdes caudaux épididymaires chez la souris. Le taux de natalité de la progéniture après la TE est d’environ 42,50%. Remarquablement, tous les taux de fécondation, les taux de 2 cellules et les taux de naissance de la progéniture sont comparables aux niveaux atteints dans l’ART humain, ce qui permet une simulation complète des différentes étapes des techniques de l’ART humain chez la souris. De plus amples détails sont fournis dans les tableaux 1 et 2. Il n’y avait pas de fluctuation significative des taux de glucose sanguin aléatoires entre les souris nées naturellement et les souris ICSI au cours du processus de croissance et de développement (Figure 2). Cependant, les souris ICSI mâles ont montré des niveaux élevés de glucose sanguin à jeun tout au long de l’expérience (Figure 3), indiquant une altération de l’homéostasie de la glycémie à jeun. Fait intéressant, les souris femelles ICSI n’ont montré aucun changement par rapport au groupe témoin. Dans la GTT, la glycémie a montré un changement significatif entre les souris ICSI mâles et le groupe témoin (Figure 4), et il n’y avait pas de différence de ce type chez les souris femelles. Ces résultats suggèrent que la progéniture obtenue à l’aide de la technologie ICSI pourrait souffrir de diabète, et que le résultat était lié au sexe. Bien que les souris femelles n’aient pas présenté le phénotype du diabète, le phénotype de surpoids des souris ICSI mâles et femelles était cohérent (Figure 5).

En utilisant le protocole d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) décrit ici, nous avons atteint des taux élevés de fécondation et de développement embryonnaire chez la souris. Dans une expérience représentative, 89,57% des ovocytes ont été fécondés après ICSI, comme en témoigne la formation de deux pronoyaux. 24 h après l’ICSI, 87,38 % des zygotes ont atteint le stade embryonnaire à 2 cellules. Après le transfert d’embryons aux femelles receveuses, le taux de natalité des petits vivants était de 42,50 % (résultats positifs). En utilisant le protocole d’injection intracytoplasmique optimisée de spermatozoïdes (ICSI) décrit ici, nous avons généré efficacement une progéniture à partir d’ovocytes et de spermatozoïdes de souris. Il est important de noter qu’une caractérisation approfondie des animaux dérivés de l’ICSI a révélé des perturbations métaboliques en l’absence de défauts de développement macroscopiques.

Par rapport aux témoins naturels, les souris ICSI mâles mais pas femelles présentaient une homéostasie du glucose altérée, mise en évidence par une glycémie à jeun élevée (Figure 3) et une tolérance au glucose réduite dans les tests de tolérance au glucose intrapéritonéale (Figure 4). Ces altérations peuvent provenir de déficiences de reprogrammation lors de la fécondation médiée par ICSI ou d’anomalies génétiques/épigénétiques subtiles survenues lors de la manipulation du sperme.

De plus, les souris ICSI mâles et femelles ont montré une augmentation du poids corporel par rapport aux témoins (Figure 5), suggérant une propension à l’obésité. Alors que la technique ICSI de souris modélise de manière fiable les résultats de l’ICSI chez l’homme, les phénotypes métaboliques observés soulignent la nécessité d’interpréter avec prudence les résultats des modèles animaux ICSI. Une évaluation complète de la croissance, de la santé et du comportement est impérative pour déterminer l’adéquation des souris ICSI aux applications en aval.

Prises ensemble, ces données illustrent l’utilité du protocole ICSI chez la souris pour générer efficacement une progéniture pour les études, tout en soulignant l’importance d’évaluer minutieusement les résultats phénotypiques chez les animaux dérivés de l’ICSI. Les anomalies métaboliques spécifiques au sexe observées dans cet exemple soulignent la nécessité d’une interprétation prudente des résultats des modèles murins ICSI.

figure-results-1
Figure 1 : Schéma de la préparation de la boîte pour l’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes chez la souris. Le couvercle de la boîte de culture cellulaire a été divisé en moitiés supérieure et inférieure. La moitié supérieure contenait des gouttelettes de solution de polyvinylpyrrolidone à 10 % pour le placement des spermatozoïdes. La moitié inférieure contenait des gouttelettes de milieu M2 pour la réalisation de la procédure ICSI. Toutes les gouttelettes ont été recouvertes d’huile minérale pour éviter l’évaporation. Cette configuration en boîte a permis le transfert séquentiel de spermatozoïdes et d’ovocytes entre les gouttelettes PVP et M2 pour permettre le processus ICSI. Les zones séparées ont empêché le mélange des médias pendant la procédure. Abréviations : ICSI = injection intracytoplasmique de spermatozoïdes ; PVP = polyvinylpyrrolidone. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-2
Figure 2 : Glycémie aléatoire hebdomadaire chez des souris témoins naturellement élevées (n = 5) et ICSI (n = 5) au cours du développement postnatal. La glycémie a été mesurée chaque semaine après le jeûne nocturne à partir de la veine caudale des souris témoins et ICSI à l’aide d’un glucomètre. La signification statistique a été évaluée ±à l’aide d’une ANOVA à deux facteurs, ns, P > 0,05. Abréviations : MEB = erreur type de la moyenne ; ICSI = injection intracytoplasmique de spermatozoïdes ; ns = non significatif ; NM = accouplement naturel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

figure-results-3
Figure 3 : Glycémie hebdomadaire à jeun chez des souris sélectionnées naturellement (n = 7 pour les mâles, n = 7 pour les femelles) et des souris traitées par ICSI (n = 7 pour les mâles, n = 7 pour les femelles) pendant le développement postnatal. Après le jeûne nocturne, la glycémie a été mesurée chaque semaine à partir de la veine de la queue de souris témoins à jeun et de souris traitées par ICSI à l’aide d’un glucomètre. Il a été observé que les souris mâles traitées par ICSI, mais pas les femelles, présentaient une glycémie à jeun significativement élevée par rapport à leurs témoins du même sexe à partir de l’âge de 8 semaines. La signification statistique a été évaluée ±à l’aide d’une ANOVA à deux facteurs, ns, P > 0,05, ***P < 0,001, ****P < 0,0001). Abréviations : MEB = erreur type de la moyenne ; ICSI = injection intracytoplasmique de spermatozoïdes ; ns = non significatif ; NM = accouplement naturel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Test de tolérance au glucose intrapéritonéale chez des souris mâles élevées naturellement (n = 5) et traitées par ICSI (n = 5) à l’âge de 16 semaines. Après un jeûne d’une nuit, les souris ont reçu une injection intrapéritonéale de glucose (2 g/kg de poids corporel). La glycémie a ensuite été mesurée à 0, 30, 60 et 120 minutes après l’injection. Les souris mâles traitées par ICSI ont présenté des taux de glycémie significativement plus élevés à 30, 60 et 120 minutes pendant l’IPGTT par rapport au contrôle naturel. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SEM. Les analyses ont été effectuées à l’aide d’une ANOVA à deux facteurs. ns, P > 0,05. *P < 0,05. Abréviations : IPGTT = Test de tolérance au glucose intrapéritonéal ; MEB = erreur type de la moyenne ; ICSI = injection intracytoplasmique de spermatozoïdes ; ns = non significatif ; NM = accouplement naturel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Suivi du poids corporel de souris témoins élevées naturellement (n = 5 mâles, n = 5 femelles) et de souris traitées par ICSI (n = 5 mâles, n = 5 femelles) de 4 à 20 semaines. Des mesures hebdomadaires ont révélé que les souris mâles et femelles traitées par ICSI présentaient une augmentation significative du poids corporel par rapport à leurs témoins du même sexe, à partir de l’âge de 8 semaines. Les données sont présentées sous forme de ± moyenne SEM. Les analyses ont été effectuées à l’aide d’une ANOVA à deux facteurs. P < 0,001. P < 0,0001. Abréviations : MEB = erreur type de la moyenne ; ICSI = injection intracytoplasmique de spermatozoïdes ; ns = non significatif ; NM = accouplement naturel. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

OvocytesZygotesTaux de fécondation (%)2 cellulesTaux de 2 cellules (%)4 à 8 cellulesTaux de cellules de 4 à 8 (%)MorulaTaux MorulaBlastocystesTaux de blastocystes
Spermatozoïdes caudales ICSI1908493.337690.487285.716982.146476.19
Spermatozoïdes de la caudale ICSI28072906286.115981.945373.614663.89
Spermatozoïdes de la caudale ICSI3605083.334284377432642856
Total23020689.5718087.3816881.5515474.7613866.99

Tableau 1 : Résultats développementaux après ICSI chez la souris. Abréviation : ICSI = injection intracytoplasmique de spermatozoïdes.

Non.Non. d’embryons transférésNon. de naissance (%)MâleFemelleTaux de natalité (%)
16330
26110
35202
48422
58211
67532
Total401710742.5

Tableau 2 : Issue de la naissance après transplantation utérine d’embryons de souris ICSI. Abréviation : ICSI = injection intracytoplasmique de spermatozoïdes.

Discussion

Cette étude a intégré des techniques d’injection intracytoplasmique de spermatozoïdes (ICSI) et de transfert d’embryons (TE) de souris pour récapituler de manière exhaustive la technologie de procréation assistée humaine (ART) et examiner l’impact de l’ICSI en conjonction avec l’ET sur le développement de la progéniture. L’application de la technique ICSI avec des spermatozoïdes de souris normaux a donné un taux élevé de fécondation (86,76 %) et de taux à 2 cellules (88,48 %). Après ET, le taux de naissance des souris descendantes était d’environ 42,50 %, ce qui indique la robustesse de la plate-forme technique. La découverte la plus notable de cette étude est la fluctuation liée à l’âge des niveaux de métabolisme du glucose chez la progéniture ICSI, qui peut être attribuée à l’application de la technique ICSI6.

L’observation de fluctuations dans les niveaux de métabolisme du glucose constitue une découverte remarquable dans cette étude. Cette découverte implique des implications potentielles à long terme de la technique ICSI sur la santé de la progéniture, en particulier en ce qui concerne le métabolisme du glucose7. Pour élucider les raisons de ce phénomène, nous avons procédé à un examen complet des étapes techniques pivots englobées dans la procédure ICSI. Nous avons constaté que le contrôle de la température de micro-injection (19 °C), de la durée de la coupe par ultrasons (en 5 s) et du volume de liquide de transfert (<0,5 cm) étaient importants pour maintenir une viabilité embryonnaire et des taux d’implantation élevés. Le contrôle de l’effet de siphonnage de la pipette de transfert est apparu comme une étape critique pour un transfert précis d’embryons. Lors de la préparation de la pipette de transfert, il est essentiel d’assurer l’uniformité du diamètre du tube pour atténuer l’effet de siphonnage et mieux contrôler le mouvement du liquide à l’intérieur du tube. Cette mesure est essentielle pour améliorer le taux de réussite et la précision du transfert d’embryons. De plus, le fait d’éviter la culture in vitro prolongée et l’encombrement lors du transfert d’embryons a également contribué à améliorer les compétences développementales. En utilisant des protocoles optimisés, nous avons atteint un taux de fécondation de 86,76 % et un taux de natalité de 42,50 % après l’ET, ce qui suggère que la procédure ICSI elle-même n’a pas intrinsèquement altéré la viabilité. Par conséquent, les fluctuations du métabolisme du glucose étaient plus vraisemblablement associées à de subtils changements intracellulaires induits par le processus de TAR plutôt qu’à des dommages évidents à l’embryon.

Bien que le TAR soit largement considéré comme sûr, de plus en plus de preuves indiquent que même la progéniture apparemment normale peut présenter divers risques pour la santé plus tard dans la vie en raison des caractéristiques reproductives non naturelles et des périodes critiques d’intervention pendant le développement des gamètes et des embryons 5,8,9,10,11,12,13 . Nos résultats fournissent de nouvelles perspectives sur les effets métaboliques potentiels du TAR et soulignent la nécessité de mener d’autres études sur les effets à long terme du TAR sur la santé de la progéniture14.

Il est essentiel de reconnaître que cette étude a utilisé un modèle murin ; Par conséquent, les résultats peuvent ne pas être directement transférables aux sujets humains. Néanmoins, étant donné les parallèles biologiques substantiels entre les souris et les humains, ces résultats conservent une signification référentielle considérable15. De plus, il est important de reconnaître que les patients subissant une ICSI dans la pratique clinique présentent souvent des anomalies du sperme. À l’inverse, cette étude a utilisé des souris normales pour les procédures ICSI, manquant ainsi de données sur la progéniture ICSI de souris présentant des anomalies du sperme. Cependant, il est raisonnable de prévoir que les anomalies des spermatozoïdes auraient un impact plus profond sur les effets à long terme de la technique ICSI. Par conséquent, les résultats de cette étude conservent une valeur référentielle notable.

Une autre limite de notre étude est la divergence méthodologique entre notre modèle murin et les pratiques cliniques humaines en matière d’immobilisation des spermatozoïdes. Dans l’application clinique de l’ICSI, il est courant d’immobiliser les spermatozoïdes humains en perturbant physiquement la queue avec une micropipette. Cependant, dans nos expériences sur des modèles murins, nous avons utilisé la coupe de la queue par ultrasons pour préparer le sperme, une méthode couramment utilisée dans la manipulation embryonnaire de souris. Nous reconnaissons que cette approche peut introduire par inadvertance une variabilité et un biais potentiel dans le modèle, en particulier compte tenu des dommages possibles à l’intégrité et à la fonction des spermatozoïdes que l’échographie peut causer. Cette différence méthodologique peut limiter la traduisibilité directe de nos résultats. Dans nos travaux futurs, nous prévoyons d’explorer l’utilisation de micropipettes pour perturber la queue des spermatozoïdes de souris. Cet ajustement vise à minimiser les effets non intentionnels sur les spermatozoïdes et à mieux reproduire les conditions et les résultats observés dans les procédures ICSI humaines. Nous nous engageons à améliorer continuellement nos pratiques de recherche afin d’accroître la pertinence clinique de nos résultats.

Sur la base de la plate-forme technologique susmentionnée, dans les recherches futures, nous étudierons plus en détail l’impact de la technique ICSI sur d’autres aspects de la santé de la progéniture, tels que la santé cardiovasculaire et le système immunitaire. De plus, des études de suivi à plus long terme sont également impératives pour comprendre de manière exhaustive les effets à long terme de l’ICSI.

Déclarations de divulgation

Les auteurs n’ont aucun conflit d’intérêts à divulguer.

Remerciements

Ce travail a été soutenu par le plan de grand projet du Fonds spécial de développement pour la zone nationale de démonstration de l’innovation indépendante de Shanghai Zhangjiang (ZJ2022-ZD-006), le projet de financement ciblé de la Commission municipale des sciences et de la technologie de Shanghai (22DX1900400), le programme pour la jeunesse de la Commission municipale de la santé de Shanghai (20204Y0276). la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (32070849).

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
1,25 % d’avertin (2,2,2-tribromoéthanol)Nanjing AibeiM2960pour l’anesthésie
Boîtes de Pétri bactériologiques 35 x 10 mm avec couvercle étanche, polystyrène vierge cristallin,BD353001
Boîtes de Pétri 50 x 9 mm avec couvercle étanche, polystyrène vierge cristallin,BDstérile 351006
Enceinte de sécuritébiologique ESCOclass figure-materials-1 BSCOpérations aseptiques, fabrication de plats de culture, aliquotage de réactifs, etc.
Incubateur CO2Thermo8000DHCulture d’embryons
Dissection MicroscopeOlympusSZX16Utilisation dans le transfert d’embryons de souris
Fluorinert Fc-770SIGMAF3556Fluorinert FC-770 est un liquide thermiquement stable entièrement fluoré avec une rigidité diélectrique et une résistivité élevées, utilisé comme glucomètre portable à fluide opératoire
RocheAccuChekperforma Blood mesure de la glycémie
HTFMerckMR-070-DLe liquide tubaire humain (HTF) EmbryoMax (1x), conçu pour être utilisé avec la FIV chez la souris, est disponible en format de 50 ml et a été optimisé et validé pour la culture d’embryons.
Microinjecteur hydrauliqueEppendorfCellTram 4r Huile, 5196000030Pour injection de spermatozoïdes
Microscope inverséNikonTI2-UMicromanipulation hôte d’observation
KSOMMerckMR-020P-D(1x), Poudre, sans rouge de phénol, 5 x 10 mL
M2MerckMR-015-DEmbryoMax M2 Medium (1x), liquide, avec
micromanipulateurNARISHIGENTX-N4pour bras de micromanipulation
  ;SIGMAM8410peut être utilisée comme couche de couverture pour contrôler l’évaporation et la contamination croisée dans diverses applications de biologie moléculaire.
Coupe-aiguilleNanjing AibeiSutter MF-800Utilisation pour la fabrication d’aiguilles de micromanipulation
Extracteurd’aiguille Nanjing AibeiSutter modèle p-100Utilisation pour la fabrication d’aiguilles de micromanipulation
Piezo Drill Trip Mouce ICSIEppendorf5195000.087Application de l’aiguille d’injection ICSI.
Micromanipulateur piézoélectrique (briseur de membrane)EppendorfEppendorf PiezoXpertUtilisation de micro-impulsions pour briser la zone pellucide et l’oolemma de l’ovocyte
Microinjecteur pneumatiqueEppendorfCellTram 4r Air, 5196000013Pour la fixation de l’ovocyte
Gonadotrophine chorionique humaine prête à l’emploi (Hcg)Nanjing AibeiM2520Réactif de stérilisation, injection intrapéritonéale. 50 UI/mL
Prêt à l’emploi Gonadotrophine sérique de jument gestante (PMSG)Nanjing AibeiM2620Réactif de stérilisation, injection intrapéritonéale. 50 UI/mL
StéréomicroscopeOlympusSZX7Prélèvement d’ovocytes et observation du développement embryonnaire
bactériologique stérile de rouge de phénol Huile minérale L’huile minérale

Références

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