L’objectif de cet article est de détailler les meilleures pratiques pour la fabrication de milieux pour les micro-organismes anaérobies exigeants acquis dans un environnement. Ces méthodes aident à gérer les cultures anaérobies et peuvent être appliquées pour soutenir la croissance de micro-organismes insaisissables non cultivés, la « matière noire microbienne ».
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Article de méthode
Ensemble de formats de milieux simulés in situ pour la culture de micro-organismes anaérobies acquis dans l’environnement
Dans cet article
Résumé
Résumé
La recherche de microorganismes anaérobies dépendante de la culture repose sur la compétence méthodologique. Ces méthodes doivent créer et maintenir des conditions de croissance appropriées (p. ex., pH et sources de carbone) pour les microorganismes anaérobies tout en permettant d’extraire des échantillons sans compromettre l’environnement artificiel. À cette fin, les méthodes qui s’inspirent d’un environnement in situ et le simulent peuvent être d’une grande aide pour cultiver des micro-organismes de cet environnement. Ici, nous décrivons une méthode anaérobie in situ informée et simulée pour la culture de micro-organismes terrestres de surface et souterrains, en mettant l’accent sur la collecte d’échantillons anaérobies avec un minimum de perturbation. Ce protocole détaille la production d’un milieu liquide anaérobie personnalisable, ainsi que l’acquisition environnementale et la croissance in vitro de micro-organismes anaérobies. Le protocole couvre également les composants critiques d’un bioréacteur anaérobie utilisé pour les simulations environnementales de sédiments et de milieux liquides anaérobies pour les cultures acquises dans l’environnement. Nous avons inclus des données préliminaires de séquençage de nouvelle génération d’un microbiome maintenu pendant la durée de vie d’un bioréacteur où la culture active s’est ajustée dynamiquement en réponse à une source de carbone expérimentale.
Introduction
La plupart des micro-organismes restent non cultivés ; Ceci est soutenu par la grande disparité entre les cellules observée par microscopie contrastée par les quelques micro-organismes cultivés avec succès à l’aide de plaques de gélose. Staley et Konopka ont nommé cette disparité « l’anomalie du grand nombre de plaques »1. La diversité non expliquée estimée est étayée par des données métagénomiques et métatranscriptomiques montrant de nombreux nouveaux genres répartis dans des courbes d’abondance de rang à partir de plusieurs environnements différents2. Les microorganismes qui ont été observés (généralement par séquençage aléatoire d’une communauté microbienne) mais qui n’ont pas été cultivés ont été appelés « matière noire microbienne »3,4.
À l’ère des micro-omiques, la culture de micro-organismes reste impérative pour évaluer pleinement les données génomiques et vérifier la fonction/phénotype des gènes présents. Le séquençage de micro-organismes cultivés reste le seul moyen d’obtenir avec certitude des génomes complets jusqu’à ce que des technologies telles que la métagénomique shotgun et les génomes assemblés par métagénome de l’environnement deviennent infaillibles5. Les évaluations génomiques associées à des micro-organismes cultivés fournissent des inférences solides pour comprendre la « matière noire microbienne ». De nombreux membres de la « matière noire microbienne » remplissent des fonctions cruciales qui ont un impact sur le cycle des nutriments et d’autres éléments et la production de produits naturels précieux, soutiennent les systèmes écologiques et fournissent des services écologiques. D’un point de vue médical, environ la moitié de tous les produits pharmaceutiques actuellement commercialisés sont des produits et des dérivés de produits issus de bactéries, et le profilage des espèces non cultivées est soupçonné de révéler les antibiotiques du futur. Pour accéder à cette majorité inculte, une variété de méthodologies de culture doit être augmentée6. Parmi les membres de la « matière noire microbienne », les micro-organismes oligotrophes anaérobies sont largement sous-déclarés et détiennent probablement des voies biochimiques précieuses sur le plan écologique et industriel7, ce qui en fait des cibles importantes de culture. Cependant, les microorganismes oligotrophes anaérobies sont plus difficiles à cultiver que leurs homologues aérobies et copiotrophes en raison des temps d’incubation souvent plus longs, des conditions fastidieuses (p. ex., des températures in vitro non standard particulières) et de l’utilisation de recettes de milieux spécialisés.
Les techniques actuelles de développement pour cultiver des membres de la « matière noire microbienne », y compris de nouveaux micro-organismes oligotrophes anaérobies, ont considérablement amélioré notre compréhension et augmenté la représentation de ces micro-organismes dans l’arbre phylogénétique. Les techniques actuelles utilisant des milieux éclairés pour la culture de nouveaux microorganismes (c.-à-d. des milieux obtenus à partir de la connaissance du ou des microorganismes d’intérêt) peuvent être séparées en trois méthodes distinctes. La première des méthodes consiste à retirer directement une section discrète de l’environnement pour la transférer dans une chambre de croissance in vitro qui contient déjà les micro-organismes d’intérêt dans une membrane. La section discrète (p. ex., l’eau de mer) fournit aux microorganismes d’intérêt l’habitat géochimique qu’ils utilisent in situ, tandis que la membrane arrête le mouvement des cellules (les cellules d’intérêt resteront à l’intérieur ; les cellules étrangères qui sont arrivées avec la section discrète resteront à l’extérieur). En incluant des composés naturellement disponibles pour cibler les micro-organismes dans leur habitat naturel, ces micro-organismes peuvent être cultivés8. La deuxième méthode utilise la métatranscriptomique ou la génomique pour élucider les capacités métaboliques, fournissant des indices pour affiner les paramètres de culture pour une conception de milieu ciblé. Cette approche fournit un profil écophysiologique qui peut être utilisé pour cibler l’enrichissement de types spécifiques de micro-organismes hors d’un environnement. Les dispositions du milieu sont adaptées aux gènes identifiés présents qui sont présumés soutenir le ou les micro-organismes ciblés afin de réduire la diversité de l’enrichissement,9,10. Une mise en garde est que l’information génomique ne déduit pas directement l’expression des gènes, contrairement à l’information transcriptomique.
La troisième méthode englobe les milieux protégés par l’environnement et simulés, distincts de la première, qui ne simule pas les milieux, mais utilise plutôt l’environnement directement comme source de milieu. Cette troisième méthode nécessite une reconnaissance environnementale de la géochimie d’un site de terrain contenant des microorganismes d’intérêt. Grâce à ces connaissances, les composants primaires et les paramètres physiques sont identifiés pour produire un milieu simulé tenant compte de l’environnement. Le milieu reçoit ensuite une perfusion directe de sédiments ou de liquides contenant des micro-organismes de l’environnement dans le milieu. Cette méthode est particulièrement utile dans les cas où le microbiologiste d’élevage n’a pas accès à des quantités suffisantes d’environnement source (comme pour la première méthode) ni à des données métatranscriptomiques ou génomiques appropriées (comme pour la seconde).
Le protocole suivant est un exemple de la troisième méthode ; il est informé par et vise à simuler des environnements d’intérêt. Trois recettes de milieux naïfs ciblant différentes cultures de micro-organismes anaérobies acquises sur le terrain sont présentées en parallèle au sein du protocole. Les trois cultures représentées sont des cultures mixtes provenant du sol (ci-après, culture mixte du sol), des cultures mixtes provenant d’un trou de forage (ci-après, culture mixte de forage) et un méthanogène isolé provenant de l’intérieur d’un trou de forage (ci-après, méthanogène isolé du trou de forage). Les identités et les quantités composées dans les recettes médiatiques partagées ici sont destinées à servir de guide de départ ; Ils peuvent et sont encouragés à être personnalisés en fonction de l’environnement du lecteur et des micro-organismes d’intérêt.
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Protocole
1. Production de milieu liquide anaérobie personnalisable
- Milieu pour flacons de culture (production de 500 mL)
- Mesurer et ajouter des composés dans une bouteille de 1 L et ajuster le pH à l’aide de la colonne du tableau 1 correspondant à la culture d’intérêt du lecteur (les quantités du tableau 1 sont enregistrées pour une production de 1 000 mL, ajuster en conséquence). Mélanger les composés jusqu’à l’homogénéité en faisant tourner la bouteille.
- Faites bouillir le liquide au micro-ondes pendant 5 à 6 minutes. Ouvrez souvent le micro-ondes et faites tourner doucement le liquide à l’aide d’un gant résistant à la chaleur. Ouvrez rapidement le micro-ondes si le liquide s’immobilise après avoir bouillonné ; sinon, le liquide peut se dilater rapidement et déborder de la bouteille.
- Fixer une pipette en verre stérile de 10 mL à un collecteur de gaz N2 (basé sur la conception de Balch et al.11, mais ne nécessitant pas de colonne de cuivre chauffée pour le gaz N2 de pureté ; voir le fichier supplémentaire 1 pour plus d’informations sur le collecteur de gaz). Ouvrez le collecteur pour évacuer O2 et laissez le gaz N2 s’écouler.
- Placez la pointe de la pipette dans le liquide et ajustez le débit de gaz pour que les bulles soient modérément vigoureuses. Rincez le liquide avec N2 jusqu’à ce que le flacon ne soit plus trop chaud au toucher.
REMARQUE : Cela dépend du contenu du support, mais prend généralement ~20 min. - En attendant que le flacon refroidisse, disposer 10 flacons de culture stériles de 100 mL ; ou si vous préparez des milieux pour la collecte de cultures mixtes au sol, disposer deux bouteilles stériles de 500 ml.
- Une fois que le flacon de support est froid au toucher, tirez la pointe de la pipette vers le haut dans l’espace libre du flacon. Ajouter 0,125 g de NaHCO3 et 0,300 g de Na2S∙9 H2O et attendre que la résazurine devienne incolore.
ATTENTION : Na2S∙9 H2O est corrosif, toxique et irritant. Utilisez un équipement de protection individuelle lors de la manipulation et rincez soigneusement les outils métalliques après le contact. - En attendant que la resazurine change de couleur, fixez des canules métalliques à l’installation du collecteur de gaz et placez les pointes des canules dans des bouteilles de culture. Ajustez le débit de N2 dans les bouteilles à un débit modéré, afin que le liquide ajouté à l’étape suivante ne ballotte pas à cause du flux de gaz.
- Une fois que la résazurine est incolore, aliquote 50 mL de liquide dans chaque bouteille de culture ou 250 mL de liquide dans chaque bouteille de 500 mL.
- Boucher chaque bouteille avec un bouchon en caoutchouc de taille assortie immédiatement après avoir retiré les canules. Fixez le bouchon avec un joint en aluminium (pour les bouteilles de culture) ou un bouchon à vis ouvert GL45 (pour les bouteilles de 500 ml).
- Placez les bouteilles dans un bac autoclavable et remplissez le bac d’eau du robinet jusqu’à ce que les niveaux d’eau correspondent à ceux des bouteilles.
REMARQUE : Cela garantira que les bouteilles ne se rompent pas en raison des contraintes causées par les différences de température sur le verre pendant l’autoclavage. - Autoclavez les bouteilles à 121 °C pendant 30 min.
- Milieu pour bioréacteur (production de 8 L)
- Préparation de la tourie
- Ouvrez la vanne d’un robinet à bille cannelé de 1/4" (6,4 mm). Fixez deux longueurs de 6 cm de diamètre intérieur (ID) de 1/4 » (6,4 mm) et de diamètre extérieur (OD) de 1/2 » (12,7 mm) de diamètre extérieur (OD) à chaque extrémité du robinet à bille cannelé du tuyau.
- Fixez à une extrémité de l’ensemble un raccord d’adaptateur cannelé de tuyau de 5/16 »-1/4 » (7.9 mm-6.4 mm). Fixez l’autre extrémité de l’ensemble au raccord cannelé d’une tourie de 8 L.
- Utilisez une attache zippée pour fixer la connexion entre le raccord cannelé du tuyau de la tourie et le tube, et la connexion entre le raccord de l’adaptateur cannelé du tuyau et le tube.
- Autoclave la tourie avec montage à 121 °C pendant 30 min.
- Production moyenne
- Fermez la vanne du robinet à bille cannelé sur l’ensemble de tourie 8 L.
- Mesurer et ajouter des composés à la tourie de 8 L et ajuster le pH à l’aide de la colonne du tableau 1 correspondant à la culture d’intérêt du lecteur (les quantités du tableau 1 sont enregistrées pour une production de 1 000 mL, ajuster en conséquence). Ajoutez une barre d’agitation et utilisez une plaque chauffante pour mélanger les composés jusqu’à homogénéité.
- Faites bouillir le liquide avec la plaque chauffante. Laisser bouillir le liquide pendant 30 min.
REMARQUE : Le chauffage du liquide à ébullition dépend du contenu du fluide mais peut prendre 2-3 h. - Fixer une pipette en verre stérile de 10 mL à un collecteur de gaz N2 (basé sur la conception de Balch et al.11, mais ne nécessitant pas de colonne de cuivre chauffée pour le gaz N2 de pureté ; voir le fichier supplémentaire 1 pour plus d’informations sur le collecteur de gaz). Ouvrez le collecteur pour évacuer O2 et laissez le gaz N2 s’écouler.
- Éteignez le feu, puis placez la pointe de la pipette dans le liquide et ajustez le débit de gaz de manière à ce que les bulles soient modérément vigoureuses mais ne débordent pas. Rincer le liquide avec N2 pendant 30 min.
- Tirez la pointe de la pipette vers le haut dans l’espace libre de la tourie. Ajouter 2,0 g de NaHCO3 et 4,8 g de Na2S∙9 H2O, et attendre que la résazurine devienne incolore.
ATTENTION : Na2S∙9 H2O est corrosif, toxique et irritant. Utilisez un équipement de protection individuelle lors de la manipulation et rincez soigneusement les outils métalliques après le contact. - Une fois que la résazurine est incolore, retirez la pipette en verre et fermez immédiatement la tourie avec un bouchon #10. Enroulez un fil sur le bouchon et autour de la lèvre de la tourie pour fixer le bouchon.
- Préparation de la tourie
2. Acquisition in situ de micro-organismes anaérobies environnementaux
- Acquisition d’échantillons anaérobies de surface (culture mixte du sol)
- Apportez la ou les bouteilles de milieu de culture en sol mélangé faites comme ci-dessus et un carottier dans le champ.
REMARQUE : Un trépan de sol conique standard Giddings de 2 5/8 po est utilisé par les auteurs (tableau des matériaux). Cependant, tout carottier ou truelle permettant d’échantillonner à la profondeur souhaitée peut être utilisé. - Enfoncer le carottier dans les sédiments jusqu’à ce que le haut du cylindre de prélèvement des échantillons affleure la surface des sédiments.
- Tournez le carottier de 90° pour libérer le noyau et tirez vers le haut jusqu’à ce que l’échantillon soit extrait de l’environnement.
- Dans les sédiments meubles (comme ceux qui peuvent être rencontrés lors de l’échantillonnage des milieux humides), couvrir la base de la carotte avec une nouvelle main gantée de nitrile pendant l’extraction pour éviter que l’échantillon ne tombe ou ne se dissémine dans l’eau lors de l’extraction.
- Se rapprocher rapidement à l’œil nu de 6 à 7 cm de la base du noyau. Utilisez une nouvelle main gantée de nitrile pour trancher dans le noyau et séparer le bas de 6-7 cm.
- Transférez immédiatement le fond du noyau dans le flacon de culture. Si le sol/sédiment est trop gros, formez-le rapidement pour qu’il rentre plus facilement dans la bouteille, en minimisant autant que possible l’exposition à l’atmosphère aérobie.
- Une fois l’échantillon transféré, repositionnez immédiatement le bouchon et maintenez-le en place avec un bouchon à vis.
- Gardez l’échantillon au frais. Réfrigérer le flacon de prélèvement à 4 °C au retour au laboratoire.
- Apportez la ou les bouteilles de milieu de culture en sol mélangé faites comme ci-dessus et un carottier dans le champ.
- Acquisition d’échantillons anaérobies souterrains (culture mixte en forage)
- Disposer une bouteille stérile de 1 L près du collecteur de gaz. Boucher la bouteille avec un bouchon en caoutchouc. Versez de l’éthanol à 100 % sur le bouchon et mettez-y le feu à l’aide d’un briquet.
- Fixez une aiguille stérile de 23 G à la configuration du collecteur de gaz N2 . Ouvrez le collecteur pour évacuer O2 et laissez le gaz N2 (ou Ar) s’écouler à un débit modéré.
- Une fois que le bouchon n’est plus en feu, insérez l’aiguille dans la bouteille. Insérez une deuxième aiguille stérile de 23 G non fixée au collecteur de gaz dans la bouteille. Rincer le flacon pendant 1 à 2 min.
- Extraire l’aiguille non attachée au collecteur de gaz. Pressuriser le flacon pendant 1 min. Extraire l’aiguille restante.
- Apportez la bouteille sous pression et une aiguille stérilisée de 23 G sur le site du forage. Aspirer le liquide du trou de forage en suivant les méthodes de Merino et al.12.
REMARQUE : Selon la méthode, le raccordement et le débit du forage, cela modifie la stratégie d’acquisition d’un échantillon d’eau. S’il y a un débit d’eau continu, recueillir l’eau comme indiqué à l’étape 2.2.6. sera suffisant. Si le débit d’eau est collecté par lots ou à faible débit, une autre méthode d’entrée/sortie peut être utilisée. Dans tous les cas, réduire au minimum la contamination et s’assurer que l’échantillon prélevé est représentatif de l’environnement que l’on souhaite échantillonner. Il s’agit d’une déclaration largement généralisée car les auteurs ont constaté que chaque événement de collecte d’échantillons provenant de sites gouvernementaux ou privés devait être hautement adaptable à l’accessibilité disponible. - Ouvrez rapidement la bouteille, pompez du liquide pour remplir complètement la bouteille et fermez la bouteille.
- Insérez l’aiguille de 23 G qui a été apportée sur le site dans le bouchon en caoutchouc de la bouteille pour soulager la pression dans la bouteille. Extrayez l’aiguille.
- Gardez l’échantillon au frais. Réfrigérer le flacon de prélèvement à 4 °C au retour au laboratoire.
3. Croissance in vitro de micro-organismes anaérobies acquis sur le terrain
- Croissance par bouteille de culture
- Disposer une bouteille stérile bouchée de N2 et les bouteilles de culture et de collecte préparées comme ci-dessus. Versez de l’éthanol à 100 % sur les bouchons et mettez-y le feu à l’aide d’un briquet.
- Assembler une aiguille de 23 g sur une seringue de 1 ml. Une fois que les bouchons ne sont plus en feu, insérez l’aiguille dans le flacon de N2 et aspirez ~1 mL de N2. Extrayez l’aiguille.
- Appuyez lentement sur le piston pour libérer le N2. Dès que la seringue est vide, insérez l’aiguille dans le flacon de prélèvement et prélevez 0,5 mL de l’échantillon environnemental. Extrayez l’aiguille.
- Insérez l’aiguille dans le flacon de culture et injectez l’échantillon. Extrayez l’aiguille.
- Faites tourner la bouteille et placez-la dans un incubateur à température, comme indiqué dans le tableau 1 ou dans l’environnement d’intérêt du lecteur.
REMARQUE : La progression de la culture (bouteille ou bioréacteur) est surveillée à l’aide d’un hémocytomètre Petroff-Hauser de 0,02 mm de profondeur. Les enrichissements en micro-organismes anaérobies ou fastidieux n’atteignent généralement pas les densités cellulaires où la DO600 est utilisable, et les autres méthodes de détection ne sont pas pratiques pour la surveillance de routine et répétitive. Les limites de détection, le contrôle de la qualité et les calculs statistiques dépendent du type de chambre de comptage cellulaire et des besoins de l’utilisateur.
- Croissance par bioréacteur
- Préparation d’un ballon avec une seringue modifiée
- Retirez le piston de trois seringues Luer Lock de 10 ml (une pour chaque assemblage final). Coupez la bride de chaque seringue et limez l’extrémité coupée pour qu’elle ne perce pas les ballons. Nettoyez tous les copeaux limés de la seringue modifiée.
- Préparez un ballon doublé en plaçant un ballon dans un autre.
- Étirer l’extrémité du ballonnet doublé sur la seringue modifiée de 10 ml.
- Séparez légèrement l’extrémité du ballon extérieur du ballon intérieur. Essorez tout l’air emprisonné entre les ballons.
- Serrez un collier de serrage autour de la base des ballons pour fixer les ballons à la seringue.
- Préparation d’un bouchon modifié
- Retirer les pistons de dix seringues Luer Lock de 1 mL (deux pour chaque bouchon à modifier). Coupez la bride des seringues.
- Disposez deux bouchons en caoutchouc taille #10 (pour les bonbonnes de 8 L) et trois tailles pour les bouteilles avec finition filetée GL45 (pour les bouteilles de récupération). À l’aide d’un foret de 1/4" (6,4 mm), percez deux trous dans le haut de chaque bouchon en caoutchouc suffisamment large pour que les seringues modifiées s’adaptent et suffisamment étroits pour que l’ajustement soit étanche à l’air.
- Insérez les seringues modifiées dans les trous du bouchon en caoutchouc.
- Nettoyez et autoclavez le bouchon modifié à 121 °C pendant 30 min.
- Préparation de l’assemblage du bioréacteur
- Désinfecter avec de l’éthanol à 70 % tous les robinets, les connecteurs d’adaptateur Luer lock femelles et autres matériaux de bioréacteur non autoclavables, et autoclaver à 121 °C pendant 30 min tous les tubes (après coupe à longueur), les bouchons, la laine de verre et les autres matériaux de bioréacteur autoclavable.
- Placez un bioréacteur stérile (Figure 1 et Figure 2) sur un support annulaire et fixez-le avec une sangle de chaîne. Prévoyez également un bain-marie, une pompe péristaltique, le milieu contenant une tourie de 8 L bouchée (à l’étape 1.2 du protocole), une bouteille de 3,5 L (bouteille de récupération sans échantillonnage) et une bouteille de 500 ml (bouteille de récupération d’échantillonnage).
- Boucher la tourie
- Sortez un ballon avec une seringue modifiée. Connectez un robinet d’arrêt à trois voies à l’embout Luer Lock de la seringue.
- Prenez l’ensemble ballon et connectez le robinet d’arrêt à trois voies au tube d’un réservoir de N2. Tournez le robinet d’arrêt à trois voies pour bloquer l’extrémité ouverte à l’atmosphère.
- Ouvrez le réservoir d’essence et remplissez le ballon avec N2. Une fois plein, tournez le robinet d’arrêt à trois voies pour bloquer l’extrémité du ballon. Fermez le réservoir d’essence et débranchez le tube du réservoir du robinet d’arrêt à trois voies.
- Connectez les éléments suivants dans l’ordre : un robinet d’arrêt à trois voies (du ballonnet avec la seringue modifiée), un robinet d’arrêt à deux voies, un coupleur d’adaptateur Luer Lock femelle et l’embout Luer Lock de l’une des seringues du bouchon modifié.
- À l’embout Luer Lock de l’autre seringue, connectez un robinet d’arrêt bidirectionnel. Fermez les deux vannes des robinets d’arrêt bidirectionnels sur l’ensemble de butée modifié.
- Détordez le fil qui maintient le bouchon de taille #10 non modifié de la tourie. Remplacez rapidement le bouchon non modifié par l’ensemble de bouchon modifié et tournez le fil comme précédemment pour fixer l’ensemble de bouchon modifié à la tourie.
NOTA : Si vous êtes confiant et préparé, l’ensemble de bouchon modifié peut être utilisé pour arrêter la tourie à l’étape finale de la préparation du milieu (étape 1.2.2.7). - Tournez le robinet d’arrêt à trois voies pour bloquer l’extrémité ouverte à l’atmosphère. Ouvrez le robinet d’arrêt bidirectionnel en séquence. Le gaz du ballon et l’espace de tête de la tourie de 8 L sont maintenant connectés.
- Boucher les bouteilles de récupération sans échantillonnage et d’échantillonnage
- Bouchon : la bouteille de récupération sans échantillonnage de 3,5 L avec un bouchon modifié dimensionné pour les bouteilles avec une finition filetée GL45, en appliquant 70 % d’éthanol à la base du bouchon pour aider à l’insérer dans la bouteille. Boucher la bouteille avec un bouchon à vis GL45 à couvercle ouvert.
- Connectez les éléments suivants dans l’ordre : un ballonnet avec l’embout Luer Lock de la seringue modifiée, un robinet d’arrêt à trois voies, un coupleur adaptateur Luer Lock femelle et l’embout Luer Lock de l’une des seringues du bouchon modifié. Tournez le robinet d’arrêt à trois voies pour bloquer l’extrémité ouverte directement à l’atmosphère.
- À l’embout Luer Lock de l’autre seringue, connectez un coupleur adaptateur Luer Lock femelle.
- Répétez les trois étapes ci-dessus pour le flacon de récupération d’échantillonnage de 500 ml.
- Mise en place de la tubulure
- Mesurez la distance entre les orifices de la chemise d’eau du bioréacteur et les barbes du tuyau du bain-marie. Coupez deux longueurs de tubes en silicone de 3/16 » (4,8 mm) de diamètre intérieur et de 3/8 » (9,5 mm) de diamètre extérieur pour couvrir cette distance.
- Assemblez deux raccords de tuyau droits avec des bouchons à vis ouverts GL14. Fixez chacun à une extrémité des deux pièces de tube.
- Tournez les bouchons à vis sur les orifices de la chemise d’eau du bioréacteur. Fixez les autres extrémités du tube aux barbes du tuyau du bain-marie afin que l’eau s’écoule du bain-marie, entre au bas de la chemise d’eau du bioréacteur, sorte par le haut de la chemise d’eau et retourne au bain-marie. Serrez les attaches zippées autour des extrémités du tube pour fixer le tube aux barbes du tuyau du bain-marie.
- Pour les pompes similaires à la mini-pompe VWR Ultra Low Flow Variable Flow, enfilez l’ensemble de tubes fendus de 3/16" (4,8 mm) de diamètre extérieur fourni à travers la pompe.
- Mesurez la distance entre le tube de la tourie et le tube de la pompe péristaltique. Coupez une longueur de 3/16 » (4,8 mm) de diamètre intérieur, 3/8 » (9,5 mm) de diamètre extérieur pour couvrir cette distance.
- Fixez une extrémité du tube au raccord cannelé du tuyau de l’ensemble de tube de tourie et l’autre à l’ardillon du tuyau de l’ensemble de tuyau de la pompe péristaltique, orienté de manière à ce que le fluide s’écoule de la tourie et traverse la pompe péristaltique.
- Mesurez la distance entre l’ensemble de tubulure de la pompe péristaltique et l’orifice inférieur du bioréacteur. Coupez une longueur de 3/16 » (4,8 mm) de diamètre intérieur, 3/8 » (9,5 mm) de diamètre extérieur pour couvrir cette distance.
- Fixez une extrémité de ce tube à l’ardillon du tuyau de l’ensemble de tuyau de la pompe péristaltique et fixez soigneusement l’autre à l’orifice inférieur du bioréacteur. En prenant soin de ne pas fissurer le verre mais aussi de sécuriser la connexion, serrez un collier de serrage autour de l’extrémité du tube pour fixer le tube à l’orifice inférieur du bioréacteur.
- Mesurez et coupez environ 5 » (127 mm) de longueur de tube en silicone de 3/16 » (4,8 mm) de diamètre intérieur, 3/8 » (9,5 mm) de diamètre extérieur.
- Fixez un connecteur d’adaptateur Luer Lock femelle à un robinet d’arrêt à trois voies. Fixez n’importe quelle extrémité du robinet d’arrêt à trois voies au tube.
- Assemblez un raccord de tuyau coudé avec un bouchon à vis à dessus ouvert GL14. Fixez-le à l’autre extrémité du tube.
- Tournez le bouchon à vis sur l’orifice vertical le plus haut du bioréacteur. Tournez le robinet d’arrêt à trois voies pour bloquer l’extrémité pointant vers le bioréacteur.
- Mesurer la distance entre l’orifice vertical le plus haut et l’ensemble de la bouteille de récupération non échantillonnante. Coupez une longueur de 3/16 » (4,8 mm) de diamètre intérieur, 3/8 » (9,5 mm) de diamètre extérieur pour couvrir cette distance. Coupez les brides de deux seringues Luer Lock de 1 mL et insérez-les dans les extrémités du tube.
- Fixez une extrémité de cet ensemble de tubes au robinet d’arrêt à trois voies de l’ensemble d’orifice vertical le plus haut et fixez l’autre extrémité au connecteur de l’adaptateur Luer Lock femelle sur l’ensemble de bouteilles de récupération sans échantillonnage.
- Mesurez la distance entre l’orifice vertical le plus haut et l’ensemble de la bouteille de récupération d’échantillonnage. Coupez une longueur de 3/16 » (4,8 mm) de diamètre intérieur, 3/8 » (9,5 mm) de diamètre extérieur pour couvrir cette distance. Coupez les brides de deux seringues Luer Lock de 1 mL et insérez-les dans les extrémités du tube.
- Fixez une extrémité de cet ensemble de tubes au robinet d’arrêt à trois voies de l’ensemble d’orifice vertical le plus haut et fixez l’autre au connecteur d’adaptateur Luer Lock femelle sur l’ensemble de bouteilles de récupération d’échantillonnage.
- Remplissage du bioréacteur
- Boucher l’un des orifices GL18 du bioréacteur avec un septum en caoutchouc blanc. Boucher l’autre port GL18 et les autres ports GL14 exposés verticaux avec des septa en silicone à face PTFE de taille GL18/GL14 (PTFE face au verre) et des bouchons à vis ouverts.
- Avec une tige de 50 cm de long, emballez 0,9 g de laine de verre dans la base du bioréacteur.
- Autoclave 1,3 L de sable à 121 °C pendant 30 min. Remplissez le bioréacteur avec le sable à l’aide d’un entonnoir.
REMARQUE : D’autres types de sédiments informés par l’environnement du lecteur et les micro-organismes d’intérêt peuvent être remplacés ici. - Placez le tube dans un réservoir de N2 dans le haut du bioréacteur et rincez l’espace libre du bioréacteur avec N2 pendant 2 min. Fermez immédiatement le bioréacteur avec un bouchon de taille #7 et un bouchon à vis GL45 à couvercle ouvert.
- De la bouteille de récupération non prélevée, débranchez le tube et tournez le robinet d’arrêt à trois voies pour bloquer l’extrémité pointant vers le ballon. Connectez le tube à un réservoir de N2 au connecteur de l’adaptateur Luer Lock femelle et rincez l’espace libre du bioréacteur avec N2 pendant 2 min. Rebranchez immédiatement le tube et remettez le robinet d’arrêt à trois voies pour bloquer l’extrémité ouverte à l’atmosphère.
- Répétez l’étape ci-dessus pour la bouteille de récupération d’échantillonnage.
- Tournez le robinet d’arrêt à trois voies de l’orifice vertical le plus haut du bioréacteur pour bloquer l’extrémité pointant vers la bouteille de récupération d’échantillonnage. Pompez le liquide de la tourie dans le bioréacteur. Mettez la pompe en pause, ventilez le ballon du flacon d’échantillonnage et remplissez le ballon de la tourie avec du N2 au besoin.
- Une fois le bioréacteur rempli de fluide, réglez le débit de la pompe à 0,6 mL/min (valeur numérique de 40 sur la Mini-Pump).
REMARQUE : D’autres débits souhaités par le lecteur peuvent être remplacés ici. - Réglez la température du bain-marie , comme indiqué dans le tableau 1 ou dans l’environnement d’intérêt du lecteur.
REMARQUE : L’inoculum peut être ajouté à ce stade ou plus tard, selon les spécificités de l’étude. Si vous inoculez à ce stade, passez à l’étape 3.2.4.10. Si vous inoculez plus tard, passez à l’étape 3.2.5. - Disposer une bouteille de collecte ou une bouteille de culture inoculée et une bouteille stérile bouchée de N2. Versez de l’éthanol à 100 % sur les bouchons et mettez-y le feu à l’aide d’un briquet.
- Assembler une aiguille de 23 g sur une seringue de 60 ml. Une fois que les bouchons ne sont plus en feu, insérez l’aiguille dans la bouteille de N2 et aspirez ~50 mL de N2. Extrayez l’aiguille.
- Appuyez lentement sur le piston pour libérer le N2. Dès que la seringue est vide, insérez l’aiguille dans le flacon de prélèvement et prélevez 50 mL de l’échantillon environnemental. Extrayez l’aiguille.
- Remplacez l’aiguille 23 G par une aiguille métallique longue stérile (canule, longueur 31,5 cm). Insérez la longue aiguille métallique dans le septum en caoutchouc blanc sur le port GL18 du bioréacteur.
- Enfoncez l’aiguille dans le sédiment et injectez l’inoculum. Extrayez l’aiguille.
- Maintenance du bioréacteur
- Chaque jour où le bioréacteur fonctionne, effectuez les opérations suivantes :
- Vérifiez le niveau du bain-marie. S’il est bas, ajoutez plus d’eau (utilisez de l’eau distillée pour la longévité de l’équipement en réduisant la corrosion et l’accumulation de minéraux).
- Vérifier le ballonnet de la bouteille de récupération non prélevée ; un ballon plein inhibera l’écoulement du milieu. Lorsqu’il est plein, tournez le robinet d’arrêt à trois voies pour bloquer l’extrémité pointant vers la bouteille de récupération. Pressez le ballon pour le vider ; ensuite, remettre le robinet d’arrêt à trois voies pour bloquer l’extrémité ouverte à l’atmosphère ; Répétez jusqu’à ce que le ballon soit vide.
- Vérifiez le ballon de la tourie 8 L. S’il est bas, fermez le robinet d’arrêt bidirectionnel en séquence et débranchez le robinet d’arrêt à trois voies du robinet d’arrêt bidirectionnel. Remplissez et fixez à nouveau le ballon en suivant les étapes 3.2.3.3.2, 3.2.3.3.3 et 3.2.3.3.7.
- Vérifiez le niveau du fluide dans la tourie de 8 L. Si le niveau est bas, assemblez une autre tourie de 8 L et préparez plus de médium en suivant les étapes 1.2 du protocole. et 3.2.3.3. Mettez la pompe en pause, fermez le robinet à bille cannelé du tuyau, débranchez rapidement l’ancienne tourie et connectez la nouvelle tourie.
REMARQUE : Pour un débit de 0,6 mL/min, un nouveau milieu sera nécessaire tous les 9 jours. - Vérifier le niveau du milieu dans le flacon de récupération sans prélèvement. Si elle est pleine, assembler une autre bouteille de récupération sans prélèvement d’échantillons conformément à l’étape 3.2.3.4.1. Rincez le nouveau flacon avec N2, déconnectez rapidement le ballonnet avec la seringue et le tube modifiés de l’ancien flacon et connectez-le au nouveau flacon.
- Retirer le bouchon modifié d’une bouteille de récupération pleine sans échantillonnage. Autoclaver le liquide à 121 °C pendant 30 min ; Ensuite, éliminez le liquide conformément aux politiques institutionnelles du lecteur. Nettoyer et autoclaver toutes les pièces de l’ensemble de bouteilles de récupération sans échantillonnage pour les préparer à la prochaine utilisation.
- Effectuez un échantillonnage tous les 7 jours (ou le nombre souhaité par le lecteur) en procédant comme suit :
- Tournez le robinet d’arrêt à trois voies de l’orifice vertical le plus haut du bioréacteur pour bloquer l’extrémité pointant vers la bouteille de récupération sans échantillonnage. Recueillir 250 mL de liquide.
REMARQUE : Pour un débit de 0,6 mL/min, la collecte de 250 mL prendra ~7 h. - Remettez le robinet d’arrêt à trois voies de l’orifice vertical le plus haut du bioréacteur pour bloquer l’extrémité pointant vers la bouteille de récupération d’échantillonnage. Débranchez le tube et la bouteille de récupération d’échantillonnage du robinet d’arrêt à trois voies de l’orifice vertical le plus haut du bioréacteur.
- Après l’essai, l’entreposage et/ou l’élimination appropriée du liquide d’échantillonnage, nettoyez toutes les pièces de l’ensemble de bouteilles de récupération d’échantillonnage, à l’exception du ballonnet, avec la seringue modifiée. Autoclavez toutes les pièces à 121 °C pendant 30 minutes, à l’exception du ballonnet avec la seringue modifiée et les connecteurs d’adaptateur Luer Lock femelles. Remontez pour le prochain jour d’échantillonnage.
REMARQUE : Il est fortement recommandé d’avoir une redondance en double ou en triple des pièces, des capuchons, des tubes et des septa pour une réparation et un remplacement rapides si nécessaire.
- Tournez le robinet d’arrêt à trois voies de l’orifice vertical le plus haut du bioréacteur pour bloquer l’extrémité pointant vers la bouteille de récupération sans échantillonnage. Recueillir 250 mL de liquide.
- Chaque jour où le bioréacteur fonctionne, effectuez les opérations suivantes :
- Préparation d’un ballon avec une seringue modifiée
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Résultats
Nous présentons ici les résultats d’une étude de bioréacteur utilisant une méthode de préparation de milieu de culture mixte de forage et une méthode de configuration de bioréacteur comme décrit ici. Le milieu de culture mixte du forage a été modifié pour contenir comme source de carbone une boue d’épis de maïs traitée par dissolution hydrothermale oxydative (OHD)13,14. Un milieu de culture mixte de forage modifié a été pompé dans le bioréacteur pendant 44 jours ...
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Discussion
La section de production moyenne de ce protocole (section 1) doit sa structure à la technique Hungate modifiée de Miller et Wolin17, qui a été largement utilisée depuis sa publication. L’aspect pratique de ce protocole élargi vient de sa nature descriptive et de son appariement avec l’acquisition in situ de micro-organismes. Des flacons de culture contenant des milieux de simulation et de respect de l’environnement ont été utilisés pour cultiver avec succès les anciens membres de la « mat...
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Déclarations de divulgation
Les auteurs déclarent qu’ils n’ont aucun conflit d’intérêts.
Remerciements
Les auteurs tiennent à souligner la lignée d’information et de mentorat qui a influencé/fait évoluer ces techniques au fil des ans. Le Dr Hamilton-Brehm, en tant qu’ancien étudiant diplômé, postdoctorant et professeur actuel, a une dette de gratitude envers ceux qui ont pris le temps d’enseigner les techniques anaérobies : le Dr Mike Adams, le Dr Gerti Schut, le Dr Jim Elkins, le Dr Mircea Podar, le Dr Duane Moser et le Dr Brian Hedlund. The Nature Conservancy et American Rivers ont soutenu ce travail par le biais des subventions G21-026-CON-P et AR-CE21GOS373, respectivement. Les opinions, constatations, conclusions ou recommandations exprimées dans cet article sont celles des auteurs et ne reflètent pas nécessairement les points de vue de Nature Conservancy ou d’American Rivers. Ce travail a été soutenu par une subvention du SIU Advanced Energy Institute, qui remercie le financement accordé par l’intermédiaire de l’Advanced Energy Resource Board. NGS a été réalisé par LC Sciences.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| General Materials | |||
| Flacon de borosillicate de 1 L | Fisher Scientific | ||
| Seringue de 1 mL avec embout coulissant | Fisher Scientific | ||
| Pipette en verre de 10 mL | Fisher Scientific | ||
| Flacon de culture de 100 mL | Fisher Scientifc | ||
| 20 mm Sertisseuse à main | Aiguille Fisher Scientifc | ||
| 23 g Fisher | Scientifc | ||
| Flacon borosilicate 500 mL | Fisher Scientific | ||
| Joint en aluminium | Fisher Scientifc | ||
| , longueur 31,5 cm | Fisher Scientific | ||
| , longueur 6 cm | Fisher Scientifc | ||
| Giddings Machine Company ; | Assemblé à partir de pièces de l’entreprise | ||
| Collecteur à gaz | Swagelok | Assemblé à partir de nombreuses pièces différentes | |
| Briquet | Lowe’s | ||
| N2 gaz | Airgas | ||
| Gants en nitrile | Fisher Scientific | ||
| Bouchon en caoutchouc (pour bouteilles GL45) | Glasgeratebau OCHS | ||
| Bouchon en caoutchouc (pour bouteilles de culture) | Ace Glass | ||
| Plaque chauffante d’agitation | Corning | ||
| Oligo-éléments | ATCC | ||
| Vitamines | ATCC | ||
| Matériaux spécifiques au bioréacteur | |||
| #10 bouchon en caoutchouc | Ace Glass | ||
| Bouchon en caoutchouc #7 | Fisher Scientifc | ||
| Seringue de 1 mL avec embout Luer Lock | Fisher Scientifc | ||
| 1/4 » Robinet à bille ardillon | Amazon | ||
| 10 mL avec embout Luer Lock | Fisher Scientifc | ||
| Bouteille de borosilicate | Fisher | ||
| 5/16 » - 1/4 » adaptateur de tuyau cannelé montage d’une | Amazon | ||
| 60 mL avec embout Luer Lock | Fisher Scientifc | ||
| 8 L borosillicate carbon | Allen Glass | ||
| Connecteur de tuyau coudé pour GL14 open top cap | Ace Glass | 7623-20 | |
| Balloon | Party City | ||
| Borosillicate bioreactor | Allen Scientific Glass | Sur mesure sur demande | |
| Drill | Lowe’s | ||
| Femelle luer lock adaptateur coupleur | Amazon | ||
| GL14 capuchon à dessus ouvert | Ace Glass | 7621-04 | |
| GL18 capuchon à dessus ouvert | Ace Glass | 7621-08 | |
| GL45 capuchon à dessus ouvert | Ace Glass | ||
| PTFE face en silicone septum pour GL14 capuchon à dessus ouvert | Ace Verre | 7625-06 | |
| Septum en silicone recouvert de PTFE pour GL18 capuchon supérieur ouvert | Ace Glass | 7625-07 | |
| Support d’anneau | Fisher Scientific | ||
| Collier de chaîne de support | Amazon | ||
| Ring Collier de serrage | |||
| Tube en silicone ; 1/4 « id, 1/2 » od | Grainger | 55YG13 | |
| Tube en silicone ; 3/16 » id, 3/8 » od | Grainger | ||
| Raccord de tuyau droit pour GL14 capuchon supérieur ouvert | Ace Glass | 7623-22 | |
| Robinet d’arrêt à trois voies | Amazon | ||
| Robinet d’arrêt à deux voies | Amazon | ||
| Mini-pompe à débit variable Ultra low flow | VWR | ||
| Bain-marie | Fisher Septum | ||
| en caoutchouc blanc pour tubes de 13-18 mm od | Ace Glass | 9096-49 | |
| Fil | Lowe’s | ||
| Zip tie | Lowe’s |
Références
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- Hamilton-Brehm, S. D., et al. Thermodesulfobacterium geofontis sp. nov., a hyperthermophilic, sulfate-reducing bacterium isolated from obsidian pool, yellowstone national park. Extremophiles. 17 (2), 251-263 (2013).
- Twigg, R. S. Oxidation-reduction aspects of resazurin. Nature. 155 (3935), 401-402 (1945).
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Réimpressions et autorisations
