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Article de méthode

Techniques de culture in vitro pour modéliser l’organogenèse du foie, construire des assembloïdes et concevoir des tissus synthétiques à l’aide de lignées cellulaires humaines

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DOI :

10.3791/66229

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18 avril 2025

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1Department of Biomedical Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 2Clinical and Translation Research Center (CTRC), University at Buffalo (State University of New York), 3Department of Chemical and Biological Engineering, University at Buffalo (State University of New York), 4Center for Cell, Gene and Tissue Engineering, University at Buffalo, State University of New York, 5Khufu Therapeutics, Inc.

Dans cet article

Résumé

Les organoïdes révolutionnent la modélisation tissulaire personnalisée pour le développement d’organes, la découverte de médicaments et la recherche sur les maladies. L’ingénierie des organoïdes progresse dans la création de tissus synthétiques complexes. L’objectif est d’intégrer la morphogenèse, la technologie assembloïde et les biomatrices pour faire progresser l’ingénierie tissulaire. Ce protocole aide à modéliser l’organogenèse hépatique et à établir des lignes directrices pour la construction des tissus synthétiques.

Résumé

Les maladies chroniques du foie ont atteint des proportions épidémiques, affectant plus de 800 millions de personnes dans le monde. Le traitement actuel, la transplantation hépatique orthotopique, présente plusieurs limites. Des solutions prometteuses ont émergé dans le domaine de la médecine régénérative du foie, avec un potentiel important pour l’organogenèse hépatique. L’organogenèse hépatique précoce, qui se produit entre E8.5 et 11.5, implique la formation d’interactions épithéliales-mésenchymateuses conduisant à la morphogenèse, à la formation du cordon hépatique et à la migration collective. Cependant, il existe un manque de méthodes de modélisation in vitro de ce processus. Dans cette étude, une série détaillée de méthodes est présentée, permettant de modéliser divers stades et aspects de l’organogenèse hépatique avec des lignées cellulaires humaines. Dans une série de méthodes, la technologie assembloïde avec des sphéroïdes hépatiques (HEP) et mésenchymateux (MES) est utilisée, reproduisant les structures précoces trouvées dans l’organogenèse hépatique, modélisant la morphogenèse précoce et démontrant la migration cellulaire interstitielle telle qu’observée in vivo. Ces systèmes assembloïdes innovants aident à identifier les facteurs influençant la formation et la migration des assembloïdes. Des systèmes de culture de sphéroïdes HEP ont également été utilisés pour modéliser la migration collective et la morphogenèse ramifiée. Les milieux conditionnés par le mésenchyme (M-CM) jouent un rôle important dans l’initiation de la migration ramifiée dose-dépendante. Toutes les méthodes présentées se sont révélées très reproductibles avec un taux de réussite élevé. En reliant ces événements entre eux, nos travaux permettront de recréer des événements morphogénétiques séquentiels pour faire de l’ingénierie inverse de l’organogenèse in vitro et in vivo.

Introduction

La migration des cellules hépatiques joue un rôle important dans l’organogenèse hépatique, la maladie et la thérapie cellulaire. Au cours de l’organogenèse hépatique (E8.5-9.0, souris), l’épithélium préhépatique ventral de l’intestin antérieur commence à exprimer des gènes hépatiques en raison de signaux inductifs émanant du mésenchyme et du cœur environnants. En E9.0, l’épithélium de l’intestin antérieur s’épaissit à mesure que les cellules passent d’une morphologie cuboïdale à une morphologie cylindrique pseudostratifiée, formant le diverticule hépatique1,2. À ce stade critique, le diverticule hépatique n’est composé que de ~1 500 cellules. Ensuite, l’endoderme hépatique qui tapisse le diverticule hépatique s’épaissit, se délamine et forme des cordons d’hépatoblastes en migration (HB). Ces HB co-migrent avec les cellules endothéliales et les cellules mésenchymateuses, se ramifiant dans le tissu mésenchymateux environnant, initiant une migration cellulaire collective tridimensionnelle pour former le bourgeon hépatique3,4. En fait, au cours de cette étape, les cellules subissent collectivement (1) une co-migration, ou un mouvement avec d’autres types de cellules, (2) une morphogenèse ramifiée ou la formation de structures ramifiées en forme de tube, et (3) une migration interstitielle, ou une migration au-dessus ou entre d’autres cellules. En E11.5, la migration cesse, et le foie primitif s’est formé, s’étendant de 10à 3 fois3. La migration des cellules hépatiques peut également être nécessaire dans les stades ultérieurs de l’organogenèse hépatique, car l’expression des HBs fœtales de rat a montré des preuves de gènes hautement régulés à la hausse associés à la migration cellulaire collective 3D, à la morphogenèse et au remodelage de la matrice extracellulaire5. En plus de son rôle dans l’organogenèse hépatique précoce, la migration collective 3D est intimement liée à la propagation locale et aux métastases du carcinome hépatocellulaire (CHC) avancé, conduisant finalement à une aggravation du pronostic et à une augmentation de la résistance au traitement6. Les hépatocytes adultes et fœtaux utilisent également la migration collective lorsqu’ils se déplacent de la rate vers l’intérieur du foie lors de la repopulation hépatique. Des études d’imagerie in vivo ont démontré que les hépatocytes transplantés pénètrent dans la veine porte, puis dans les capillaires en quelques heures, migrant à travers les sinusoïdes hépatiques et à travers le tissu hépatique7,8,9. Enfin, des études récentes démontrent que les HB migratrices apparaissent lors de la régénération du foie murin et humain, avec quelques preuves de mouvement en sheets10. Dans l’ensemble, la migration collective du foie, capable de plusieurs modes de morphogenèse, joue un rôle important dans l’organogenèse, le cancer, la thérapie cellulaire des hépatocytes et la régénération du foie.

De nombreuses études génétiques ont exploré les voies moléculaires sous-jacentes à la migration collective des cellules hépatiques 3D. Ces études révèlent que l’absence de moelle hépatique entrave la formation du foie, soulignant la nécessité de la formation de la moelle hépatique et de leurs interactions avec les cellules de soutien pour la formation du foie1,11,12,13. Ces études démontrent également que la croissance du foie est initiée par divers facteurs, notamment le FGF-2 sécrété par le mésoderme cardiaque, le BMP4 sécrété par le mésenchyme environnant, le HGF et les interactions entre les cellules endothéliales. De plus, les facteurs de transcription associés à la migration, notamment HEX, PROX1 et TBX3, jouent un rôle crucial 2,14. En conclusion, des études génétiques fournissent des preuves que la signalisation des facteurs solubles, conduisant à l’expression des facteurs de transcription, entraîne la migration, la signalisation et les interactions moléculaires entre les HB et leur mésenchyme environnant.

Bien que la migration cellulaire dans l’organogenèse hépatique précoce ait été largement étudiée, les études in vitro actuelles sur la migration hépatique utilisent fréquemment des tests 2D utilisant des cellules CHC hautement migratrices avec des modèles tumoraux in vivo15. Ces études ont permis de mieux comprendre plusieurs facteurs influençant la migration hépatique, notamment TGFβ-116, c-Myc17, YAP18, goosecoid19, actopaxin20, et miRNAs21,22,23. Bien que des progrès notables aient été réalisés dans la compréhension des mécanismes moléculaires de la migration des cellules hépatiques 3D, les disparités distinctes entre la migration cellulaire 2D et 3D suggèrent que les tests 2D possèdent des limites inhérentes. De plus, ces modèles n’incluent souvent pas les types de cellules mésenchymateuses, qui sont essentielles à la fois pour la migration et la croissance. Bien qu’il y ait eu des progrès dans le développement de modèles 3D pour la migration du foie qui intègrent le mésenchyme de soutien, ces modèles mettent principalement l’accent sur la co-migration plutôt que sur l’exploration des divers modes de migration collective.

La capacité de générer des tissus à partir de sphéroïdes par divers processus d’auto-assemblage et de morphogénétique facilite l’exploration scientifique des tissus synthétiques. Ces tissus ont de vastes applications dans le développement et le dépistage de médicaments, la modélisation de maladies, la thérapie et d’autres applications biomédicales et biotechnologiques. Les détails méthodologiques de plusieurs systèmes de culture in vitro en 3D conçus pour présenter différents modes de migration collective du foie en 3D sont fournis. Ces systèmes comprennent (1) la culture de co-sphéroïdes avec des sphéroïdes HEP et MES dans une matrice, (2) des gouttelettes de matrice sphéroïde HEP cultivées avec du M-CM, (3) des sphéroïdes mixtes HEP-MES et (4) une matrice sphéroïde HEP cultivée avec une forte densité de cellules MES. Ces systèmes permettent une modélisation robuste de la migration collective du foie dans un environnement 3D, faisant ainsi progresser notre compréhension des processus moléculaires et cellulaires sous-jacents à l’organogenèse hépatique, au cancer et à la thérapie.

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Protocole

Les détails des réactifs et de l’équipement utilisés dans l’étude sont répertoriés dans la table des matériaux. Les abréviations utilisées dans cet article sont définies dans le Fichier supplémentaire 1.

1. Préparation d’une solution d’agarose à faible électroendosmose (EEO) à 1 %

  1. Pesez 2,5 g de poudre d’agarose à faible teneur en EEO et transférez-la dans un beaker.
    REMARQUE : Assurez-vous que le bécher est au moins deux fois plus grand que le volume souhaité pour permettre la formation de bulles pendant la préparation de la solution.
  2. À l’aide d’un cylindre gradué, mesurer 250 mL d’eau distillée et le verser dans le bécher, en visant une concentration finale (p/v) de 1 %.
  3. Couvrez l'ouverture du bécher avec une pellicule plastique, en laissant un petit trou pour la ventilation. Faites chauffer le bécher au micro-ondes pendant 30 s.
  4. Retirez délicatement le bécher et faites tourner le contenu. Répétez ce processus toutes les 30 s jusqu’à dissolution complète.
    ATTENTION : Manipulez la verrerie au micro-ondes avec précaution, à l’aide de gants appropriés. Surveillez de près la solution pour éviter la surchauffe ou le débordement.
  5. Une fois qu’une solution homogène est obtenue, retirez le bécher du micro-ondes. Agitez doucement la solution avant de la transférer dans un flacon pré-stérilisé. Autoclavez la solution et conservez-la à température ambiante (RT) jusqu’au moment de l’utiliser.

2. Revêtement d’une plaque à 96 puits

REMARQUE : Des microplaques sphéroïdes à 384 puits à très faible attachement peuvent être utilisées dans ces expériences et d’autres.

  1. Desserrez le bouchon du flacon contenant la solution stérile d’agarose à 1 %. Réchauffez la solution au micro-ondes par intervalles de 30 s jusqu’à ce qu’elle passe à la phase liquide ; Serrez ensuite le cap.
    ATTENTION : Manipulez la verrerie au micro-ondes avec précaution, à l’aide de gants appropriés. Surveillez attentivement la solution pour éviter la surchauffe ou le débordement.
    REMARQUE : Effectuez ces étapes sous une hotte stérile à flux laminaire de culture tissulaire.
  2. Transférez 55 à 65 μL de la solution d’agarose à 1 % par puits pour enrober la plaque de culture tissulaire de 96 puits et faites immédiatement pivoter la plaque.
  3. Une fois que la solution d’agarose à 1 % a été transférée dans le nombre de puits souhaité, placez les plaques dans un réfrigérateur à 4 °C pendant 20 à 30 minutes pour permettre à l’agarose de se solidifier. Avant utilisation, amenez la plaque à température ambiante (Figure 1A).

3. Préparation des sphéroïdes HEP

  1. Cultivez des cellules HepG2-WT dans un flacon T-75 à l'aide d'un milieu de croissance complété (cDMEM) composé de milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM), complété par 10 % de sérum fœtal bovin (FBS) et 1 % de pénicilline-streptomycine (Pen-Streptomycine). Maintenir la culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2, en changeant le milieu de culture tous les jours.
  2. Lorsque vous atteignez 80 % de confluence, rincez les cellules avec 1 solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et jetez le rinçage. Ajouter 5 mL de 0,05 % de trypsine-EDTA dans le ballon et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 à 10 min.
  3. Ajoutez des quantités égales de cDMEM et lavez les cellules du flacon. Une fois les cellules détachées, transférez le mélange dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL et centrifugez la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min à RT.
    REMARQUE : Toutes les étapes de centrifugation décrites dans ce protocole ont été effectuées à température ambiante (RT). Cependant, ces procédures de centrifugation peuvent également être effectuées à des températures froides.
  4. Remettre en suspension la suspension cellulaire dans du cDMEM frais et compter les cellules pour déterminer la concentration finale en cellules/mL (< classe forte = »xfig »>Figure 1B).
  5. Marquage colorant des cellules
    REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative.
    1. Transférez la quantité désirée de suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL et centrifugez la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min.
    2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de croissance sans sérum pour obtenir une concentration finale de 1,0 x 106 cellules/mL. Ajouter 5 μL de solution fluorescente de marquage cellulaire par mL de suspension cellulaire et incuber la suspension cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2 en rotation pendant 20 min
      REMARQUE : Le milieu de croissance sans sérum est DMEM et n’est complété qu’avec 1 % de pen-streptocoque. Ajustez le temps d’incubation pour une coloration uniforme en fonction de la densité de suspension des cellules.
    3. Une fois l’incubation terminée, centrifugez la suspension cellulaire à 450 x g pendant 5 min et remettez en suspension la pastille cellulaire dans du cDMEM frais. Répétez ce processus de lavage deux fois de plus (Figure 1C).
  6. Formation de sphéroïdes
    1. Suspendez les cellules dans du cDMEM frais pour obtenir une concentration finale de 5,0 x 104 cellules/ml en fonction du nombre de cellules. Bien mélanger la suspension cellulaire et transférer 100 μL de suspension cellulaire par puits sur la plaque à 96 puits recouverte d’agarose.
      REMARQUE : La densité de suspension cellulaire est réglée pour atteindre 5 000 cellules par puits dans la plaque de 96 puits recouverte d’agarose. Pour l’utilisation de plaques à 384 puits, les cellules sont suspendues à une concentration finale de 2,0 x 105 cellules/mL, et 50 μL de suspension cellulaire sont transférés par puits pour atteindre une concentration de 10 000 cellules par puits.
    2. Centrifuger la plaque à 340 x g pendant 10 min et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 à 9 jours (Figure 1D).
      REMARQUE : Changez le milieu de croissance tous les deux jours après le placage, en retirant doucement 50 % de cDMEM et en le remplaçant. Les sphéroïdes HEP conviennent au modèle assembloïde HEP-MES ou au modèle M-CM.

4. Préparation des sphéroïdes MES

  1. Cultivez des cellules HFF/MRC-5 dans un flacon T-175 à l’aide de cDMEM composé de DMEM, complété par 10 % de FBS et 1 % de Pen-Strep. Maintenir la culture cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2, en changeant de milieu tous les deux jours.
  2. Lorsque vous atteignez 80 % de confluence, effectuez un rinçage des cellules avec 1x PBS et jetez le rinçage. Ajouter 5 mL de 0,25 % de trypsine-EDTA dans le ballon et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 à 10 min.
  3. Ajoutez des quantités égales de cDMEM et lavez les cellules du flacon. Une fois les cellules détachées, transférez le mélange dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL et centrifugez la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min.
  4. Remettre en suspension la suspension cellulaire dans du cDMEM frais et compter les cellules pour déterminer la concentration finale en cellules/mL (< classe forte = »xfig »>Figure 1B).
  5. Marquage colorant des cellules
    REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative.
    1. Transférez la quantité désirée de suspension cellulaire dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL et centrifugez la suspension cellulaire à 300 x g pendant 5 min.
    2. Remettre en suspension la pastille cellulaire dans un milieu de croissance sans sérum pour obtenir une concentration finale de 1,0 x 106 cellules/mL. Ajouter 5 μL de solution fluorescente de marquage cellulaire par mL de suspension cellulaire et incuber la suspension cellulaire à 37 °C et 5 % de CO2 en rotation pendant 20 min
      REMARQUE : Le milieu de croissance sans sérum est DMEM et n’est complété qu’avec 1 % de pen-streptocoque. Ajustez le temps d’incubation pour une coloration uniforme en fonction de la densité de suspension des cellules.
    3. Une fois l’incubation terminée, centrifugez la suspension cellulaire à 450 x g pendant 5 min et remettez en suspension la pastille cellulaire dans du cDMEM frais. Répétez ce processus de lavage deux fois de plus (Figure 1C).
  6. Formation de sphéroïdes
    1. Mettez les cellules en suspension dans du cDMEM frais pour obtenir une concentration finale de 1,0 x 105 cellules/mL en fonction du nombre de cellules. Bien mélanger la suspension cellulaire et transférer 100 μL de suspension cellulaire par puits sur la plaque à 96 puits recouverte d’agarose.
      REMARQUE : La densité de suspension cellulaire est réglée pour atteindre une densité de 10 000 cellules par puits dans la plaque de 96 puits recouverte d’agarose.
    2. Centrifuger la plaque à 340 x g pendant 10 min et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 5 à 9 jours (Figure 1D).
      REMARQUE : Changez le milieu de croissance tous les deux jours après le placage, en retirant doucement 50 % de cDMEM et en le remplaçant. Les sphéroïdes MES conviennent au modèle assembloïde HEP-MES.

5. Formation de l’assembloïde HEP-MES

REMARQUE : Reportez-vous à l’étape 3 et à l’étape 4 pour la formation des sphéroïdes HEP (Figure 2A) et MES (Figure 2B).

  1. Prélever les sphéroïdes HFF/MRC-5 individuellement à l’aide d’une pipette à partir de la plaque à 96 puits. Transférez-les dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 ml contenant du cDMEM frais. Laissez les sphéroïdes se déposer dans le tube pendant 5 min, puis rincez doucement avec du cDMEM.
    REMARQUE : Effectuez le processus de rinçage doucement et avec soin.
  2. Transférez doucement un seul sphéroïde HFF/MRC-5 à l’aide d’une pipette dans un puits contenant un sphéroïde HepG2-WT. Ajouter du Matrigel (MG) ou du collagène de queue de rat (CG) dans une dilution 1:1 et 1:5 et incuber à 37 °C à 5 % de CO2 pendant 3 h (Figure 2C).
    REMARQUE : Décongeler MG toute la nuit sur de la glace dans un réfrigérateur de 2 °C à 8 °C. Assurez-vous d’utiliser des pipettes, des pointes et des tubes pré-refroidis lors de la manipulation de MG, car il forme un gel au-dessus de 10 °C.
  3. Après l’incubation, ajouter 75 μL de cDMEM frais dans chaque puits et incuber à 37 °C à 5 % de CO2 pendant 2-3 jours.
    REMARQUE : Changez le milieu de croissance tous les deux jours après le placage, en retirant doucement 50 % de cDMEM et en le remplaçant. Les assembloïdes se formeront toujours sans changement de support jusqu’à 3-4 jours. La formation d’assembloïdes HEP-MES peut se produire sans l’utilisation de la matrice.

6. Formation de gouttelettes sphéroïdes HEP

REMARQUE : Reportez-vous à l’étape 3 pour la formation des sphéroïdes HEP (Figure 3A). Deux matériaux différents peuvent être utilisés pour suspendre les sphéroïdes HEP dans des gouttelettes. Les deux méthodes sont présentées ci-dessous.

  1. Gouttelettes de MG DFG
    1. Prélever les sphéroïdes HepG2-WT individuellement à l’aide d’une pipette à partir de la plaque à 96 puits, en les laissant se déposer dans une centrifugeuse conique stérile de 15 ml sur de la glace.
    2. Dans un tube à centrifuger conique stérile séparé de 15 ml, mélanger 1 mL de GFR MG glacé et de milieu de croissance témoin glacé à une dilution de 1:1. Aspirez le milieu à l’aide d’une pipette du tube de 15 mL contenant les sphéroïdes HepG2-WT et placez-le sur de la glace.
      REMARQUE : Décongeler le MG pendant la nuit sur de la glace dans un réfrigérateur de 2 °C à 8 °C. Assurez-vous que les pipettes, les pointes et les tubes sont pré-refroidis lors de la manipulation de MG, car il forme un gel au-dessus de 10 °C.
    3. Ajoutez la solution MG aux sphéroïdes HepG2-WT, en assurant une distribution uniforme des sphéroïdes à l’intérieur de la solution MG.
    4. À l’aide d’une pipette de 200 μL, prélever un volume de 15 μL d’un seul sphéroïde dans la solution de MG et l’ensemencer lentement dans une boîte de Pétri de 60 mm (Figure 3B).
      REMARQUE : Si plus d’un sphéroïde est semé par gouttelette, retirez-le et réensemencez-le correctement. Les sphéroïdes sont repositionnés si nécessaire pour s’assurer qu’ils sont au centre de la gouttelette. Pour un ensemencement optimal des sphéroïdes, envisagez d’utiliser le pipetage inversé pour minimiser la formation de bulles d’air.
  2. Gouttelettes CG de queue de rat
    REMARQUE : Toute la préparation du CG doit être faite sur de la glace.
    1. Prélever les sphéroïdes HepG2-WT individuellement à l’aide d’une pipette à partir de la plaque à 96 puits, en les laissant se déposer dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL sur de la glace (figure 3B).
    2. Dans un tube de microcentrifugation, ajouter 358,8 μL d’eau désionisée, 100 μL de 10x PBS, 12,1 μL de 1 N NaOH et 529,1 μL de CG de queue de rat pour un volume total de 1 mL.
      REMARQUE : Le CG de queue de rat de base doit toujours être ajouté à la fin.
    3. Ajoutez la solution CG aux sphéroïdes HepG2-WT, assurant une distribution uniforme des sphéroïdes à l’intérieur de la solution CG.
    4. À l’aide d’une pipette de 200 μL, prélever un volume de 15 μL d’un seul sphéroïde dans la solution de CG et l’ensemencer lentement dans une boîte de Pétri de 60 mm.
      REMARQUE : Si plus d’un sphéroïde est semé par gouttelette, retirez-le et réensemencez-le correctement. Les sphéroïdes sont repositionnés pour s’assurer qu’ils sont au centre de la gouttelette. Pour un ensemencement optimal des sphéroïdes, envisagez d’utiliser le pipetage inversé pour minimiser la formation de bulles d’air.
  3. Incuber les gouttelettes à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 60 min avant d’ajouter le milieu de culture.
  4. Ajouter lentement 5 ml du milieu de croissance désiré dans la boîte de Pétri et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 avec des changements de milieu de croissance tous les trois jours (Figure 3C).
    REMARQUE : Le M-CM a été utilisé dans l’essai de formation de gouttelettes HEP.

7. Préparation du M-CM

  1. Récoltez les cellules HFF/MRC-5 et ensemencez-les dans un flacon traité pour culture tissulaire T-75 à une densité d’ensemencement de 5 000 cellules/cm2 et incubez le ballon à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 72 h dans 15 mL de cDMEM.
    REMARQUE : Surveillez le flacon pendant cette période pour assurer une santé cellulaire optimale.
  2. Après 72 h d’incubation, prélever le M-CM dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 ml. Centrifuger le M-CM à 290 x g pendant 5 min pour l’élimination des débris et filtrer à l’aide d’un filtre de 0,2 μm pour la stérilisation (Figure 4A).
  3. Diluer le M-CM avec un milieu de croissance complet à un rapport de dilution de 1:1 à 1:7 et l’ajouter à l’expérience souhaitée (Figure 4B).
    REMARQUE : Utilisez M-CM dans le test de formation de gouttelettes HEP.

8. Formation de sphéroïdes mixtes HEP-MES

REMARQUE : Reportez-vous aux étapes 3.1 à 3.5 pour la préparation de la suspension de cellules HepG2-WT et aux étapes 4.1 à 4.5 pour la préparation de la suspension de cellules HFF/MRC-5.

  1. Mettre en suspension les cellules HepG2-WT dans du cDMEM frais pour obtenir une concentration finale de 1,0 x 105 cellules/mL pour chaque suspension cellulaire.
  2. Mettre en suspension les cellules HFF/MRC-5 dans du cDMEM frais pour obtenir une concentration finale de 1,0 x 105 cellules/mL pour chaque suspension cellulaire.
  3. Transférez les suspensions de cellules HepG2-WT et HFF/MRC-5 dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 mL selon un rapport de 1:1 pour obtenir une concentration finale de 2,0 x 105 cellules/mL. Mélangez soigneusement la suspension cellulaire et transférez 100 μL de suspension cellulaire par puits sur la plaque à 96 puits recouverte d’agarose.
    REMARQUE : La densité de suspension cellulaire est réglée pour obtenir 20 000 cellules par puits dans la plaque de 96 puits recouverte d’agarose.
  4. Centrifuger la plaque à 340 x g pendant 10 min et incuber à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 1 à 2 jours (Figure 5C).
  5. Ajout d’hydrogels de fibrine
    REMARQUE : Il s’agit d’une étape facultative qui est effectuée dans les 72 h après le placage des sphéroïdes mixtes HEP-MES.
    1. Dans un tube à centrifuger conique stérile de 15 ml, mélanger le fibrinogène (3,25 mg/mL) et la thrombine (12,5 unités/mL) dans un rapport de 4:1 pour la formation de fibrine et placer le tube sur de la glace.
  6. Transférez la fibrine dans chaque puits avec un sphéroïde mixte préexistant à une dilution de 1:1 avec le cDMEM actuel dans le puits. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min.
  7. Après l’incubation, ajouter 75 μL de cDMEM frais dans chaque puits et incuber à 37 °C à 5 % de CO2 pendant 1 à 2 jours.
    REMARQUE : Changez le milieu de croissance tous les deux jours après le placage, en retirant doucement 50 % de cDMEM et en le remplaçant.

9. Modèle migratoire MES à haute densité

REMARQUE : Reportez-vous à l’étape 3 pour la préparation des sphéroïdes HepG2-WT (Figure 6A) et aux étapes 4.1-4.5 pour la préparation de la suspension de cellules HFF/MRC-5 (Figure 6B).

  1. Mettez les cellules HFF/MRC-5 en cDMEM frais pour atteindre une concentration finale de 6,0 x 105 cellules/mL et mettez-les sur de la glace.
  2. Mélanger la suspension de cellules HFF/MRC-5 et le MG/CG glacé à une dilution de 1:1 (Figure 6C).
    REMARQUE : La densité de suspension cellulaire est réglée pour obtenir 30 000 cellules par puits dans la plaque de 96 puits recouverte d’agarose. Décongeler MG toute la nuit sur de la glace dans un réfrigérateur de 2 °C à 8 °C. Assurez-vous que les pipettes, les pointes et les tubes sont pré-refroidis lors de la manipulation de MG, car il forme un gel au-dessus de 10 °C.
  3. Transvaser 100 μL de solution HFF/MRC-5 et MG à l’aide d’une pipette dans un puits contenant un sphéroïde HepG2-WT. Incuber la plaque à 37 °C et 5 % de CO2 pendant 30 min.
  4. Après l’incubation, ajouter 75 μL de cDMEM frais dans chaque puits et incuber à 37 °C à 5 % de CO2 pendant une période allant jusqu’à 12 jours.

10. Analyse statistique

  1. Examiner et analyser les données recueillies à l’aide de Microsoft Excel ou de tout logiciel statistique/graphique.
    REMARQUE : Pour l'évaluation statistique entre deux groupes, le test t de Student a été effectué (type II avec deux queues), et les valeurs p égales ou inférieures à 0,05 ont été considérées comme ayant une signification statistique et sont définies dans le texte et les figures/légendes des figures.

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Résultats

L'intérêt pour les tissus synthétiques dans diverses applications biomédicales, telles que la modélisation des maladies, la découverte de médicaments et le génie tissulaire (Figure 7), est en forte augmentation. Dans ce domaine, les organoïdes, sphéroïdes et cellules dérivés de cellules souches pluripotentes humaines (hPSC) sont progressivement transformés en tissus synthétiques plus complexes et plus volumineux. Cette transformation repose sur l'application de principes de morphogenèse, l'u...

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Discussion

Le protocole actuel englobe plusieurs méthodes de culture d’assembloïdes simples et complexes, ainsi que des techniques d’induction de la migration cellulaire collective 3D dans l’organogenèse hépatique précoce24,25. Les protocoles décrits mettent en évidence plusieurs étapes critiques, la formation de sphéroïdes étant un aspect central de toutes les méthodologies. Des micropuits (96 ou 384 puits) sont utilisés avec des plaques non adhérentes ou recouvertes d’aga...

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Déclarations de divulgation

NP est le fondateur de Khufu Therapeutics, une société d’ingénierie organoïde qui développe des traitements pour les maladies hépatiques aiguës et chroniques.

Remerciements

Les auteurs tiennent à exprimer leur sincère gratitude à Ogechi Ogoke et Osama Yousef pour leurs contributions inestimables aux données utilisées dans cet article. NP a été soutenu par les fonds de démarrage UB CBE, une bourse Mark Diamond, le New York State Stem Cell Science C024316, le centre UB Stem Cells in Regenerative Medicine (ScIRM), le Centre de l’Université de Buffalo pour l’ingénierie cellulaire, génétique et tissulaire (CGTE).

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Microplaque sphéroïde à fixation ultra-faible noire noire/claire à fond rond 384 puitsCorning3830
96-wl Plaque de culture cellulaire Plate, TC, STRL, 1/pk, 100/CSProduits de laboratoire Ventes701001
AgaroseSigma-AldrichA0576Low EEO
Axiovision SoftwareZEISSversion 4
Antenne parabolique, 60mm, TC, STRL, 20/pk, 500 / CSVentes de produitsde laboratoire 705001
Flacon de culture cellulaire, 175cm² ;, Vent,TC,STRL,5 / pk,40 / CSVentes de produits de laboratoire709003
Flacon de culture cellulaire,75cm² ;, Vent,TC,TC,STRL,5 / pk,100 / CSVentes de produits de laboratoire708003
Tubes à centrifuger, 15mL,PP,STRL,grad,50 / bg, 500 / CSVentes de produits de laboratoireL226010
Collagène I, queue de rat, 100 mgde Corning354236
DMEM, glycémie élevée, supplément GlutaMAX, pyruvateThermoFisher Scientific10569010
EVOS Microscope fluorescent à contraste de phaseEVOSAMEFC4300R1 360 x 1 024 pixel
densité Sérum de veau fœtal, qualifié, États-UnisThermoFisher Scientific26140079
Fibrinogène du plasma humainSigma-AldrichF4883-500MG500 mg
Hep G2 [HEPG2]ATCCHB-8065
HERAcell vios 160iThermoFisher Scientific51033557
HFF-1ATCCSCRC-1041
ImageJIJ1.46r ; https://imagej.net/ij/
Matrigel Facteur de croissance réduit (GFR) Membrane basale Matrice, sans LDEV, 10 mLCorning354230
MRC-5ATCCCCL-171
MSCGMT Croissance des cellules souches mésenchymateuses humaines BulletKitLonzaPT-3001
Pénicilline-Streptomycine (10 000 U/mL)ThermoFisher Scientific15140122
Thrombine à partir de plasma humainSigma-AldrichT6884-100UN100 unités
Trypsine-EDTA (0,05 %), rouge de phénolThermoFisher Scientific25300062
Trypsine-EDTA (0,25 %), rouge de phénolThermoFisher Scientific25200072
Vybrant DiD Solution de marquageThermoFisher ScientificV22887
Vybrant DiI Solution de marquage cellulaireThermoFisher ScientificV22885
Vybrant DiO Marquage cellulaire SolutionThermoFisher ScientificV22886
Microscope à fluorescence Zeiss AxioZEISSSE64, densité de 1 344 & fois ; 1 024 pixels
cellulaire

Références

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Techniques de culture in vitro pour modéliser l’organogenèse du foie, construire des assembloïdes et concevoir des tissus synthétiques à l’aide de lignées cellulaires humaines
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