Article de méthode

Isolement de cellules stromales à partir d’organes hématopoïétiques

DOI :

10.3791/66231

⸱

26 janvier 2024

 ,  ,  , 
1Center for Regenerative Medicine, Massachusetts General Hospital, 2Harvard Stem Cell Institute, 3Department of Stem Cell and Regenerative Biology, Harvard University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous présentons ici des protocoles qui permettent d’isoler des cellules stromales de l’os murin, de la moelle osseuse, du thymus et du tissu thymique humain compatibles avec la multiomique unicellulaire.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Le séquençage unicellulaire a permis de cartographier des populations cellulaires hétérogènes dans le stroma des organes hématopoïétiques. Ces méthodologies fournissent une lentille à travers laquelle étudier l’hétérogénéité jusqu’alors non résolue à l’état d’équilibre, ainsi que les changements dans la représentation du type cellulaire induits par des stress extrinsèques ou au cours du vieillissement. Ici, nous présentons des protocoles par étapes pour l’isolement de populations de cellules stromales de haute qualité à partir du thymus murin et humain, ainsi que de l’os et de la moelle osseuse murins. Les cellules isolées par ces protocoles conviennent à la génération d’ensembles de données multiomiques unicellulaires de haute qualité. Les impacts de la digestion des échantillons, de l’appauvrissement de la lignée hématopoïétique, de l’analyse/tri FACS et de la façon dont ces facteurs influencent la compatibilité avec le séquençage unicellulaire sont discutés ici. Avec des exemples de profils FACS indiquant une dissociation réussie et inefficace et des rendements de cellules stromales en aval dans l’analyse post-séquençage, des indications reconnaissables pour les utilisateurs sont fournies. La prise en compte des exigences spécifiques des cellules stromales est cruciale pour obtenir des résultats de haute qualité et reproductibles qui peuvent faire progresser les connaissances dans le domaine.

Introduction

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Chez l’adulte en bonne santé, la production de novo de cellules sanguines se produit dans la moelle osseuse et le thymus. Les cellules stromales à ces sites sont essentielles au maintien de l’hématopoïèse, mais le stroma constitue moins de 1% du tissu 1,2,3,4. L’obtention d’isolats purs d’hématopoïèse soutenant le stroma constitue donc un défi important, en particulier pour la multiomique unicellulaire qui nécessite un traitement rapide pour obtenir des échantillons de haute qualité. Les composants de différents cocktails de digestion peuvent interférer avec certaines étapes de l’analyse multiomique 5,6. Les protocoles présentés ici détaillent l’isolement d’une grande variété de cellules stromales à partir de la moelle osseuse et des tissus thymiques.

Les perturbations des constituants stromaux dans la moelle osseuse et le thymus entraînent une perturbation profonde du développement des cellules sanguines et peuvent entraîner des tumeurs malignes 7,8,9. L’hématopoïèse soutenant le stroma est endommagée à la suite d’un conditionnement cytotoxique et d’une greffe de moelle osseuse, ce qui entraîne une réduction de la sécrétion de cytokines et de facteurs de croissance qui soutiennent les cellules souches et progénitrices hématopoïétiques (HSPC)2,10,11. De plus, le vieillissement affecte les cellules stromales de la moelle osseuse et du thymus, contribuant probablement aux phénotypes hématopoïétiques âgés. Le thymus est le premier organe à subir une involution importante associée à l’âge. La graisse et le tissu fibreux commencent à remplacer le stroma de soutien des lymphocytes T dès le début de la puberté12,13. Dans la moelle osseuse, la teneur en adipocytes augmente avec l’âge et les niches vasculaires et endostatives sont significativement remodelées 14,15,16.

Pour permettre l’étude du stroma de soutien à l’hématopoïèse dans plusieurs états de stress et dans le cas du thymus des tissus humains et murins, nous avons optimisé les protocoles de digestion précédemment publiés 1,2,8,17,18. Ces protocoles garantissent une isolation efficace et reproductible des cellules, et ils sont compatibles avec le séquençage de l’ARN unicellulaire (scRNAseq) et d’autres types de multiomique.

Protocole

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Tous les travaux sur des tissus humains ont été effectués après l’approbation du comité d’examen interne (IRB) du Massachusetts General Hospital. Toutes les procédures sur les animaux ont été menées conformément aux directives du Massachusetts General Hospital Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC). Des souris C57Bl/6, âgées de 8 à 10 semaines, mâles et femelles, ont été utilisées pour la présente étude. Les animaux proviennent d’une source commerciale (voir la Table des matières).

1. Préparation du tissu thymique murin

  1. Préparez les tampons et les solutions suivants.
    1. Medium 199 (M199) avec 2 % (v/v) de sérum fœtal bovin (FBS) (voir le tableau des matières).
    2. Cocktail de dissociation murin : 0,5 WU/mL de Liberase TM et 6,3 U/mL de DNase I en M199 + 2% de FBS (voir tableau des matériaux).
    3. M199 avec 2 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA).
      REMARQUE : Le milieu contenant du FBS peut être remplacé par BSA pour améliorer la qualité de l’ARN.
  2. Réaliser le curage ganglionnaire du thymus murin
    1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 (selon les protocoles approuvés par l’établissement) et la placer sur son dos. Mouillez la fourrure sur la poitrine en vaporisant de l’éthanol à 70% et procédez à l’ouverture de la cavité thoracique.
    2. Disséquez soigneusement le thymus en faisant d’abord une incision transversale juste en dessous de la cage thoracique avec des ciseaux chirurgicaux. Coupez les côtes de chaque côté de la souris jusqu’à la clavicule. Coupez ensuite le diaphragme de manière à ce que la paroi thoracique puisse être libérée. Soulevez les côtes à l’aide d’une pince pour exposer la cavité thoracique.
      1. Le thymus est un organe bilobaire blanc, situé au sommet de la cavité, juste au-dessus du cœur. Tenez le thymus avec la pince et coupez doucement le tissu conjonctif qui maintient le thymus en place. Mettez le tissu thymique disséqué dans le puits d’une plaque à 6 puits avec M199 + 2% FBS sur glace.
        REMARQUE : Lorsque vous travaillez avec des souris âgées ou conditionnées aux radiations ou des souches mutantes avec des défauts thymiques, le thymus peut être si petit qu’un microscope de dissection est nécessaire pour exciser l’organe de manière fiable.
    3. À l’aide d’un microscope de dissection, retirez tout tissu extrathymique à l’aide d’une pince à bout émoussé et de ciseaux à micro-ressort.
  3. Effectuer la dissociation enzymatique du tissu thymique murin (30 min par incréments de 10 min)
    1. Placez le thymus nettoyé dans le capuchon d’un tube de 15 ml et hachez finement le tissu avec des ciseaux chirurgicaux stériles.
      REMARQUE : Le hachage du tissu dans le capuchon du tube qui doit être utilisé pour la digestion minimise la perte de tissu due au transfert d’un récipient à un autre. Ceci est très important lorsque l’on travaille avec des souris âgées ou conditionnées par les radiations ou des souches mutantes avec des défauts thymiques. La petite taille du thymus dans ces environnements nécessite de réduire la perte de matière dans la mesure du possible.
    2. Ajoutez 2 ml de cocktail de dissociation murin dans le tube de 15 ml, fixez le capuchon contenant les morceaux de thymus et retournez 5 fois pour vous assurer que le tissu est remis en suspension dans le cocktail de dissociation.
    3. Pour éviter les fuites, enveloppez le capuchon du tube dans un film de paraffine. Placez ensuite le tube horizontalement dans un bain-marie à 37 °C avec agitation à 250 tr/min. Incuber pendant 10 min.
      REMARQUE : Le succès du protocole de digestion dépend de l’incubation effectuée à 37 °C et avec agitation. Le protocole décrit a été optimisé à l’aide d’un bain-marie agité. Si ce n’est pas le cas, d’autres approches qui permettent l’agitation dans un cadre chauffé peuvent fonctionner, mais nous recommandons que le protocole soit d’abord optimisé pour ces paramètres.
    4. Placez le tube de 15 ml dans une grille et laissez les morceaux de mouchoir se déposer. Retirez délicatement le surnageant et passez-le sur une passoire à cellules de 70 μm dans un tube glacé de 50 ml.
    5. Répétez les étapes 2 à 4 deux fois pour un total de 3 cycles de digestion. Le tissu doit être plus ou moins complètement dissocié à la fin de la dernière incubation.
    6. Ajouter 20 mL de M199 + 2 % de FBS à la suspension cellulaire recueillie. Essorer à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    7. Retirer le surnageant et le remettre en suspension dans un volume approprié de M199 + 2 % FBS. Passez ensuite au comptage des cellules.
      REMARQUE : Le volume de M199 + 2% FBS à remettre en suspension dépendra de l’état du thymus. Pour les souris âgées de 6 à 10 semaines, nous recommandons de remettre le tissu en suspension dans 3 à 4 ml de M199 + 2 % de FBS. Cependant, pour les expériences utilisant des tissus vieillis ou conditionnés aux radiations ou des souches mutantes présentant des anomalies thymiques, la petite taille du thymus nécessitera des volumes plus faibles allant de 0,1 à 1 mL.
    8. Compter les cellules en diluant la suspension cellulaire 1:2 dans une solution de bleu de trypan à 0,4 % (p/v). Chargez les cellules sur un hémocytomètre et comptez au microscope à fond clair. Comptez les cellules non colorées pour déterminer le nombre de cellules vivantes par millilitre et le nombre de cellules colorées en bleu pour évaluer la viabilité de l’échantillon.
  4. Effectuer un tri cellulaire activé par fluorescence du stroma thymique murin
    1. Faites tourner les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Remettre en suspension les cellules à une concentration de 5 x 107 cellules/mL dans M199 + 2% FBS complété par 25 U/mL inhibiteur de la RNase Protector (voir tableau des matériaux).
    2. Ajouter du bloc murin Fc (voir le tableau des matières) à une concentration de 2 μg/mL et incuber pendant 10 min à 4 °C.
    3. Colorer les cellules avec les anticorps suivants : CD45-PE/Cy7 (4 μg/mL), Ter119-PE (4 μg/mL), CD31-BUV737 (2 μg/mL) et EpCam-BV711 (2 μg/mL) (voir le tableau des matériaux) pendant 30 min à 4 °C.
    4. Laver les échantillons dans du M199 + 2% BSA et essorer à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    5. Éliminer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du M199 + 2 % de BSA contenant un colorant de viabilité tel que le DAPI (0,5 μg/mL) ou le 7-AAD (1 μg/mL) (voir le tableau des matériaux). Procéder à l’isolement FACS des cellules stromales thymiques en suivant les protocoles établis19.

2. Préparation du tissu thymique humain

  1. Préparez les tampons et les solutions suivants.
    1. Medium 199 (M199) avec 2% (v/v) FBS.
    2. M199 avec 1,5 % (p/v) BSA.
    3. Cocktail de dissociation humaine : 1 mg/ml de collagénase IV et 2 mg/mL de dispase et 6,3 U/mL de DNase I dans M199 +1,5 % de BSA (voir tableau des matériaux).
      REMARQUE : La dernière étape de digestion dans la préparation du tissu thymique humain comprend la trypsine. Il est donc essentiel que toutes les étapes jusqu’à ce point soient effectuées dans un tampon contenant du BSA, car le FBS inhibera l’activité de la trypsine.
  2. Effectuer l’isolement du tissu thymique humain
    1. Placez le thymus humain (recueilli selon la méthode19 précédemment publiée) dans un volume approprié de M199 + 1,5 % BSA et stockez-le sur de la glace jusqu’au début du traitement.
    2. Lorsque vous travaillez avec du tissu thymique humain, manipulez-le comme s’il était potentiellement infectieux en effectuant le travail dans une hotte de culture tissulaire et en utilisant les précautions standard conformément aux directives20 du CDC.
    3. Mettez le mouchoir dans une boîte de Pétri de 10 cm avec 10 ml de M199 glacé + 1,5 % de BSA. À l’aide de pinces et de ciseaux stériles, nettoyez soigneusement la graisse ou les tissus extrathymiques qui ont été endommagés lors de l’extraction de l’organe.
    4. À l’aide de ciseaux chirurgicaux et d’une pince, coupez le thymus en cubes de 1 cm3 et appuyez doucement sur les morceaux à l’aide du piston d’une seringue de 10 ml. Cela libérera une partie des thymocytes en développement, réduisant ainsi le volume de tissu à digérer.
      REMARQUE : Conservez la fraction hématopoïétique libérée si une analyse ultérieure des stades de développement des thymocytes est nécessaire. Cependant, ne combinez pas cette fraction avec la fraction de cellules stromales générée lors de la digestion enzymatique. Il a été observé que la mise en commun des deux fractions augmente considérablement le risque de formation de bouchons dans la suspension cellulaire, réduisant ainsi le rendement des cellules stromales. Peu de cellules stromales sont perdues lors de l’écrasement doux des tissus.
  3. Effectuer la dissociation enzymatique du tissu thymique humain (90 min par incréments de 30 min)
    1. Transférez environ 5 mg des morceaux de tissu thymique légèrement écrasés dans le capuchon d’un tube conique de 50 ml. Ensuite, coupez finement le tissu à l’aide de ciseaux chirurgicaux stériles.
    2. Pipetez 8 ml de cocktail de dissociation humaine dans le tube de 50 ml, fixez le capuchon contenant le tissu thymique humain haché, puis retournez doucement le tube 5 fois pour vous assurer que tout le tissu est mélangé au cocktail d’enzymes.
    3. Fixez le capuchon du tube avec un film de paraffine pour éviter les fuites. Incuber le tube horizontalement dans un bain-marie à agiter (250 tr/min) à 37 °C pendant 30 min.
    4. Placez le tube de 50 ml dans une grille et laissez les morceaux de tissu thymique humain se déposer avant de retirer le surnageant et de le passer sur une passoire cellulaire de 70 μm dans un nouveau tube de 50 ml placé sur de la glace.
    5. Répétez les étapes 2.3.2 à 1.3.4 pour un total de deux cycles de digestion avec le cocktail de dissociation humaine.
    6. Une fois le deuxième cycle de digestion terminé, ajoutez 8 ml supplémentaires du cocktail de dissociation humaine au tissu restant. Ensuite, pipetez également 2 mL de trypsine à 0,25 % dans le tube de dissociation tissulaire. Incuber pendant 30 minutes supplémentaires à 37 °C, en secouant à 250 tr/min.
      REMARQUE : Il est absolument essentiel que le temps de digestion des tissus humains soit d’au moins 90 minutes, car des temps d’incubation plus courts entraînent une réduction drastique des rendements de cellules stromales.
    7. Une fois la dernière étape d’incubation terminée, mettez en commun la suspension cellulaire et les fragments de tissu restants avec le surnageant collecté lors des étapes précédentes en passant au-dessus d’une crépine cellulaire de 70 μm. Ajouter 3 mL de FBS à l’échantillon pour briser la réaction de la trypsine et placer sur de la glace.
    8. Procédez au comptage des cellules comme décrit à l’étape 1.3.
  4. Effectuer le tri cellulaire activé par fluorescence du stroma thymique humain
    1. Essorez la suspension cellulaire du thymus humain et remettez en suspension à une concentration de 5 x 107 cellules/mL dans M199 + 2% FBS complété par 25 U/mL Protector inhibiteur de RNase.
    2. Incuber avec un bloc Fc humain (5 μg/mL) (voir le tableau des matières) pendant 10 min à 4 °C.
    3. Colorer l’échantillon pendant 30 min à 4 °C avec CD45-BV711 (2,5 μg/mL), CD235a-BV711 (2,5 μg/mL), Lineage-cocktail-FITC (3,76 μg/mL), CD66b-FITC (20 μL/100 μL échantillon), CD8-APC/Cy7 (5 μL/100 μL échantillon), CD4-BV605 (5 μL/100 μL échantillon), CD31-PE/Dazzle594 (10 μg/mL) et EpCam-BV421 (2,5 μg/mL) (voir le tableau des matériaux).
    4. Laver les échantillons avec du M199 + 1,5 % BSA et les faire tourner à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    5. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du BSA M199 + 1,5 % contenant un colorant de viabilité tel que le DAPI (0,5 μg/mL) ou le 7-AAD (1 μg/mL). Procéder à l’isolement FACS des cellules stromales thymiques en suivant les protocoles établis19.

3. Préparation de l’os murin et du tissu de la moelle osseuse

REMARQUE : Les fractions osseuses et moelles osseuses sont préparées en deux réactions de digestion distinctes pour obtenir une pureté maximale des cellules stromales et une dissociation optimale des tissus. Les échantillons peuvent être regroupés après les étapes de digestion pour être triés dans un seul compartiment stromal.

  1. Préparez les tampons et les solutions suivants.
    1. M199 avec 2 % (v/v) FBS.
    2. Cocktail de dissociation murin B&M (os et moelle) : Stemxyme 2 mg/mL, Dispase 1 mg/mL et 10 U/mL DNase I (voir tableau des matériaux) en M199 +2% FBS.
      REMARQUE : Préparez le mélange de dissociation B&M frais et conservez le mélange sur de la glace jusqu’à utilisation.
    3. M199 avec 0,5 % (p/v) BSA.
    4. Solution saline tamponnée au phosphate (PBS) avec 0,5 % (p/v) de BSA.
    5. M199 avec 2 % (p/v) d’albumine sérique bovine (BSA) et 2 mM d’EDTA.
      REMARQUE : Le milieu contenant du FBS peut être remplacé par BSA pour améliorer la qualité de l’ARN.
  2. Effectuer une séparation de la moelle osseuse murine
    1. Euthanasier la souris par asphyxie au CO2 (selon les protocoles approuvés par l’établissement). Vaporisez de l’éthanol à 70% pour mouiller la fourrure.
    2. Retirez délicatement le fémur, le tibia, le bassin et l’humérus de chaque côté et placez-les dans un puits contenant M199 + 2% FBS sur glace21,22.
    3. Retirez tous les tissus musculaires, ligamentaires et cartilagineux avec des lingettes tissulaires pour minimiser les dommages à l’os et préserver la couche périostée. Placez-les dans un nouveau puits avec du M199 + 2% FBS sur glace.
    4. À l’aide d’un scalpel, coupez les plaques de croissance des os longs pour retirer l’épiphyse et placez-la dans un plat de 10 cm avec du M199 + 2% FBS sur de la glace.
    5. Rincez la moelle osseuse des os jusqu’à ce qu’elle soit blanc pâle. À l’aide d’une aiguille de 28 g et d’une seringue de 10 ml remplie de 10 ml de M199 + 2 % de FBS, rincer la moelle dans un tube de 15 ml sur de la glace. Placez l’os rincé dans le plat de 10 cm avec l’épiphyse.
      REMARQUE : Le rinçage complet de la moelle osseuse pour une séparation complète des tissus entraînera une meilleure préparation de l’échantillon.
  3. Effectuer la dissociation enzymatique du tissu de la moelle osseuse murine (total 30 min par incréments de 10 min)
    1. Laissez le tube de 15 ml debout sur de la glace jusqu’à ce que la moelle coule au fond du tube. Retirez lentement le 10 mL M199 + 2% FBS par pipetage.
    2. Ajoutez 4 ml de cocktail de dissociation B&M dans le tube de 15 ml et placez-le dans un bain-marie à 37 °C (sans agiter) pendant 10 min.
    3. Après 5 min, retournez le tube trois fois et remettez-le dans le bain-marie.
    4. Après les 10 premières minutes, assurez-vous que la pastille est au fond et recueillez le surnageant tout en filtrant à travers une crépine de 70 μm dans un tube glacé de 50 mL. Ajoutez 2 ml de cocktail de dissociation B&M frais à la pastille BM restante et remettez-la dans le bain-marie.
    5. Dissocier les morceaux de moelle osseuse restants par pipetage vigoureux à l’aide d’une pipette de 1 mL. Collectez toute la suspension cellulaire résultante dans le même tube que lors des étapes précédentes. Ajouter 20 mL de M199 + 0,5 % de BSA + 2 mM d’EDTA à la suspension cellulaire recueillie.
      REMARQUE : À l’étape 3.3.5, le tampon ajouté après l’échantillon digéré final contient de l’EDTA pour aider à inhiber l’activité enzymatique ultérieure.
  4. Effectuer une déplétion des cellules hématopoïétiques du tissu de la moelle osseuse murine.
    1. Cellules de centrifugation à 500 x g pendant 5 min à 4 °C. Mettre en suspension dans 500 μL de PBS + 0,5 % BSA avec des anticorps anti-biotine (5 mg/mL) ciblant CD45, Ter119, CD11b, Gr1, B220 et CD3 (voir le tableau des matériaux). Transférer dans un tube à fond rond muni d’un bouchon.
    2. Incuber sur un agitateur orbital pendant 10 min à température ambiante dans l’obscurité.
    3. Tourbillonnez soigneusement les billes magnétiques et ajoutez 25 μL de billes magnétiques dans le tube.
    4. Incuber sur un agitateur orbital pendant 5 min à température ambiante dans l’obscurité.
    5. Placez le tube dans l’aimant correspondant pendant 2-3 minutes et récupérez le surnageant dans un tube frais.
      REMARQUE : La moelle osseuse peut être regroupée ou conservée séparément de la fraction osseuse après cette étape. Si l’appauvrissement de la lignée réussit, la suspension cellulaire résultante doit être dépourvue de globules rouges.
  5. Effectuer la dissociation enzymatique du tissu osseux murin.
    1. Casser les os en petits morceaux dans le plat de 10 cm avec le capuchon plat d’un tube de 50 ml. Filtrez le surnageant à travers une crépine cellulaire de 70 μm pour isoler les fragments osseux à l’intérieur du filtre.
      REMARQUE : Alternativement, un mortier et un pilon peuvent être utilisés pour la fragmentation des os. Cette option, cependant, a tendance à générer plus de débris et à réduire la viabilité des cellules stromales lorsque l’os est broyé plutôt que cassé. Les cellules du stroma sont toujours attachées à l’os et dans l’os, et le surnageant contenant des cellules hématopoïétiques doit être éliminé.
    2. À l’aide de ciseaux, coupez les fragments d’os dans la passoire cellulaire. Cela augmentera la surface pour une dissociation enzymatique plus efficace. Laver l’os avec 5 mL de M199 + 2% FBS.
    3. Placez la fraction osseuse dans 5 mL de mélange murin de dissociation B&M (voir tableau des matériaux) dans un nouveau tube de 50 mL.
    4. Pour éviter les fuites, enveloppez le capuchon du tube dans un film de paraffine. Placez ensuite le tube horizontalement dans un bain-marie à 37 °C avec 120 tr/min en secouant pendant 30 min.
    5. Après la digestion, ajouter 25 mL de M199 + 0,5 % de BSA + 2 mM d’EDTA et filtrer le surnageant contenant les cellules stromales à travers une passoire cellulaire de 70 μm dans un tube glacé de 50 ml.
      REMARQUE : Vérifiez que les fragments d’os résultants ont été visiblement diminués par la digestion. À l’étape 3.5.5, le tampon ajouté après l’échantillon digéré final contient de l’EDTA pour aider à inhiber l’activité enzymatique ultérieure.
  6. Effectuer un tri cellulaire activé par fluorescence de l’os murin et du stroma de la moelle osseuse.
    1. Faites tourner les cellules à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    2. Remettre en suspension dans un bloc Fc murin à une concentration de 10 μg/mL dans du PBS + 0,5 % BSA + 2 mM d’EDTA et incuber pendant 10 min à 4 °C.
    3. Colorer les cellules (jusqu’à 10 millions de cellules/100 μL de volume total de coloration) avec les anticorps suivants : CD45-PE/Cy7 (1 μg/mL), Ter119-PE/Cy7 (1 μg/mL), CD31-BV421 (0,66 μg/mL), CD140a-APC (2 μg/mL), Sca1-AF700 (0,66 μg/mL), CD51-PE (2 μg/mL), CD105-PE/dazzle (2 μg/mL) (voir le tableau des matériaux).
    4. Laissez Calcein-AM s’équilibrer à température ambiante et mettez-le en suspension dans 50 μL de DMSO. Préparez des produits frais pour chaque utilisation. Conserver à température ambiante après la remise en suspension. Prédiluer la calcéine dans du PBS (0,1 mg/mL) avant de l’ajouter à l’échantillon (20 μg/mL) déjà remis en suspension dans le cocktail de coloration des anticorps et incuber pendant 20 à 30 min à 4 °C dans l’obscurité.
    5. Laver les échantillons avec du PBS + 0,5 % BSA + 2 mM d’EDTA et centrifuger à 500 x g pendant 5 min à 4 °C.
    6. Retirer le surnageant et remettre en suspension les cellules dans du PBS + 0,5 % de BSA + 2 mM d’EDTA. Procéder à l’isolement FACS des cellules stromales osseuses et de la moelle osseuse en suivant les protocoles établis19.

Résultats

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Ces protocoles produisent des variétés de cellules stromales reproductibles du thymus et de la moelle osseuse adaptées à l’analyse cytométrique en flux, ainsi qu’à la multiomique unicellulaire, comme le séquençage de l’ARNsc. Le tissu thymique murin subit un remodelage important en réponse à des facteurs de stress, tels que le conditionnement cytotoxique qui précède la greffe de moelle osseuse ou le processus naturel de vieillissement. En conséquence, la cellularité thymique est considérablement réduite dans ces deux contextes (Figure 1A). Alors qu’un thymus d’une souris de type sauvage de 8 semaines contient environ 100 millions de cellules, on peut s’attendre à ce que la cellularité d’une souris de 2 ans soit la moitié de cela, et qu’un thymus 4 jours après l’irradiation et la greffe de moelle osseuse puisse être aussi faible que 5 000 000 cellules (Figure 1A).

Le conditionnement cytotoxique permettra d’ablater préférentiellement les cellules hématopoïétiques, de sorte que le compartiment stromal sera enrichi proportionnellement (Figure 1B). Cependant, la faible cellularité globale rendra difficile l’isolement d’un nombre suffisant de cellules stromales thymiques. Il peut donc être nécessaire de regrouper les animaux pour obtenir des numéros de cellules compatibles avec les applications multiomiques en aval et pour minimiser les pertes de matière dans la mesure du possible. Pour effectuer la multiomique sur des cellules stromales thymiques, le tri cellulaire activé par fluorescence (FACS) de cellules CD45-Ter119- vivantes et uniques (Figure 1C) garantira qu’un nombre suffisant de cellules peut être trié dans la plupart des conditions de stress.

Pour préserver l’hétérogénéité du compartiment du stroma, nous ne trions généralement pas sur un seul marqueur positif du stroma, mais nous éliminons les cellules hématopoïétiques. L’inclusion de marqueurs positifs des cellules stromales est toujours recommandée pour l’analyse afin de s’assurer qu’une bonne dissociation des tissus a été obtenue. Cependant, l’isolement de FACS est imparfait, et comme déterminé par scRNAseq, 30 à 50 % des cellules triées seront d’origine hématopoïétique (Figure 1D,E). Cela peut être amélioré en appauvrissant magnétiquement les cellules CD45+ avant le FACS ; cependant, cela n’est pas recommandé dans des conditions de cellularité thymique réduite (Figure 1A), car la perte de matière qui accompagne le traitement supplémentaire impliqué dans l’appauvrissement magnétique entraîne des rendements de stroma trop faibles pour les applications en aval.

Pour l’isolement du stroma thymique humain, l’étape la plus critique est la digestion enzymatique. Si l’étape de dissociation est précipitée, le rendement global des cellules stromales, ainsi que la représentation du sous-type des cellules stromales, seront sévèrement diminués (Figure 2A). Il est également recommandé de toujours inclure les marqueurs de l’endothélium thymique et de l’épithélium pour s’assurer que la digestion des tissus a été optimale, car le simple fait de présenter un point négatif pour les marqueurs hématopoïétiques ne sera pas suffisant pour évaluer la libération réelle des cellules stromales. Ceci est illustré par la figure 2A, où le pourcentage de cellules négatives pour les marqueurs hématopoïétiques est plus élevé dans l’échantillon digéré pendant 30 minutes par rapport à l’échantillon incubé pendant 90 minutes. Cependant, comme on le voit dans la porte consécutive, le rendement des cellules endothéliales et épithéliales est très faible dans le protocole de digestion plus court (Figure 2A).

Pour l’isolement FACS des cellules stromales thymiques humaines pour les applications multiomiques, la coloration avec un cocktail d’anticorps de la lignée hématopoïétique, ainsi qu’avec des anticorps CD4 et CD8 est suggérée, en plus du marqueur pan-hématopoïétique CD45 et du marqueur érythroïde CD235a (Figure 2B) pour améliorer l’enrichissement des cellules stromales. Ainsi, pour l’analyse multiomique humaine du stroma thymique, les cellules CD45-CD235a-Lineage-CD4-CD8- vivantes et uniques doivent être triées par FACS (Figure 2B). Comme on l’a vu pour le scRNAseq d’échantillons murins, cela entraîne toujours une contamination de 30 à 50 % des cellules hématopoïétiques, mais cela donne toujours une résolution acceptable du compartiment stromal du thymus humain (Figure 2C, D).

Pour l’os et le stroma BM, la même stratégie a été utilisée que pour le tissu thymique ; Les cellules stromales sont isolées par contrôle sur les cellules négatives pour les marqueurs hématopoïétiques, et d’autres marqueurs de cellules stromales sont inclus comme contrôles de la digestion (Figure 3). La dissociation des tissus calcifiés comme l’os entraîne une accumulation importante de débris. L’ajout de calcéine comme colorant de viabilité permettra d’exclure la plupart de ces débris, qui, autrement, gonflent faussement les nombres triés et diminuent les fréquences de population fermées (figure 3). Ceci est illustré par les graphiques FACS comparant le gating sur toutes les cellules et le gating uniquement sur Calcein+ (Figure 3). Comme on le voit pour les cellules stromales thymiques humaines, le pourcentage de cellules hématopoïétiques négatives pour les marqueurs n’est pas une lecture fiable de l’efficacité de la dissociation des os et des tissus BM (Figure 3). Bien que la porte CD45-Ter119- puisse contenir une abondance de cellules dans un échantillon où l’étape de digestion a échoué, une analyse plus approfondie des marqueurs typiques des cellules stromales osseuses et BM CD31, CD140a et CD51 démontre clairement une faible libération du stroma (Figure 3 et Figure 4).

Pour l’isolement par FACS des cellules stromales osseuses murines et BM, l’utilisation de la stratégie de déclenchement est suggérée comme dans la figure 3, où nous ne trions que CD45-Ter119-Calcein+ mais surveillons les propriétés de diffusion directe et latérale et l’expression des marqueurs cellulaires stromaux de la population triée pour assurer une digestion optimale (Figure 3A). La combinaison de l’appauvrissement cellulaire de la moelle osseuse positif à la lignée hématopoïétique avant le FACS et du tri sur les portes montrées permet d’obtenir un séquençage unicellulaire des cellules qui sont >90% de stroma. Un exemple d’un tel séquençage de l’ARNsc (Figure 5A,B) illustre cette faible contamination hématopoïétique après annotation des cellules analysées par transcriptome (exemples de gènes marqueurs hématopoïétiques Figure 5C). Ceci contraste fortement avec les préparations stromales thymiques où la déplétion des cellules magnétiques n’a pas été effectuée avant l’étape de tri en raison de la quantité limitée de matériel de départ dans le tissu thymique post-transplantation (Figure 1F).

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Figure 1 : Analyse par cytométrie en flux et séquençage de l’ARN unicellulaire du stroma thymique murin. (A) Quantification du nombre de thymocytes chez des souris âgées de 8 semaines (contrôle), des souris de 8 semaines irradiées létalement et transplantées 4 jours auparavant (transplantation) et des souris âgées de 2 ans (âgées). (B) Graphiques représentatifs de cytométrie en flux démontrant l’enrichissement en sous-types de cellules stromales 4 jours après l’irradiation létale et la transplantation. (C) Stratégie de contrôle par cytométrie en flux pour trier le stroma thymique murin pour l’analyse multiomique unicellulaire. (D) UMAP du thymus murin indiquant le stroma (bleu) et les cellules hématopoïétiques (rouge). (E) UMAP montrant des gènes marqueurs hématopoïétiques murins dans des échantillons de thymus. (F) Quantification des cellules stromales et hématopoïétiques murines dans des échantillons de scRNAseq de thymus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Analyse par cytométrie en flux et séquençage de l’ARN unicellulaire du stroma thymique humain. (A) Graphiques FACS montrant des résultats représentatifs de l’impact de différents temps de digestion sur la libération des populations de cellules stromales thymiques humaines. (B) Stratégie de contrôle par cytométrie en flux pour trier le stroma thymique humain pour l’analyse multiomique sur cellule unique. (C) UMAP du thymus humain indiquant le stroma (bleu) et les cellules hématopoïétiques (rouge). (D) UMAP montrant des gènes marqueurs hématopoïétiques humains dans des échantillons de thymus. (E) Quantification des cellules stromales et hématopoïétiques humaines dans des échantillons de scRNAseq de thymus. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Les marqueurs stromaux de la moelle osseuse murine et la Calcein sont utiles pour estimer l’efficacité de la dissociation. (A) Analyse par cytométrie en flux représentative des cellules stromales de la moelle osseuse murine CD45-Ter119- bloquées sur toutes les cellules et des cellules Calcein+. Le contrôle CD31- ultérieur a montré une proportion plus élevée de cellules CD140a+CD51+ lors de la sélection des cellules Calcein+. (B) Analyse par cytométrie en flux représentative d’un échec de la digestion osseuse avec des cellules CD140a+CD51+ manquantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Stratégie de déclenchement du stroma de la moelle osseuse. (A) Stratégie de contrôle de la cytométrie en flux pour trier le stroma de la moelle osseuse murine pour la multiomique unicellulaire. (B) Analyse par cytométrie en flux représentative d’un échec de la digestion de la moelle osseuse avec des cellules CD140a+CD51+ manquantes. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 5 : Séquençage de l’ARN unicellulaire de la moelle osseuse avec composition cellulaire stromale et hématopoïétique. (A) UMAP de l’os murin et de la moelle osseuse indiquant le stroma (bleu) et les cellules hématopoïétiques (rouge). (B) Quantification des cellules stromales et hématopoïétiques dans des échantillons d’os murins et de moelle osseuse. (C) UMAP des gènes marqueurs hématopoïétiques dans des échantillons de moelle osseuse murine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

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Les cellules stromales dans les organes hématopoïétiques sont essentielles à la production normale de sang et les perturbations du stroma hématopoïétique peuvent entraîner de graves altérations de l’entretien hématopoïétique et de la réponse au stress 9,23,24. La connaissance des cellules stromales hématopoïétiques est essentielle pour comprendre les maladies hématologiques 7,9,10,24 et pour la capacité de développer des traitements pour les combattre25,26. La séparation reproductible du stroma hématopoïétique du parenchyme est cependant un défi, en particulier avec l’avènement des multiomiques unicellulaires qui nécessitent des préparations d’échantillons de haute qualité tout en maximisant le rendement et la variété des cellules stromales. Les protocoles décrits ici ont été optimisés pour être compatibles avec la plupart des applications multiomiques en aval tout en répondant aux défis de l’isolement des cellules stromales hématopoïétiques 1,2,19.

Le premier problème à prendre en compte pour l’isolement des cellules stromales hématopoïétiques est les conditions de dissociation. Une dissociation optimale est essentielle pour libérer les cellules du stroma du tissu afin de refléter l’hétérogénéité complète du compartimentdu stroma 1,2. Le choix du bon mélange de dissociation dépend de la portée de l’expérimentation et des protocoles en aval. Nous vous recommandons de préparer les mélanges de dissociation aussi frais que possible et de les conserver sur de la glace jusqu’à ce qu’ils soient utilisés. Certains composants sont difficiles à dissoudre, comme la dispase, et peuvent nécessiter plus de temps pour le mélange par pipette. Le vortex n’est pas recommandé car il peut perturber la conformation native des enzymes de digestion, conduisant finalement à leur inactivation. Il est important de noter que l’EDTA inhibe l’activité enzymatique et doit être évité pendant les étapes de digestion active, mais peut être utilisé pour arrêter la réaction si le tampon contenant l’enzyme ne peut pas être éliminé rapidement. En plus du mélange d’enzymes lui-même, deux points sont essentiels à une dissociation efficace des tissus, (1) un broyage et une coupe minutieux pour augmenter la surface et (2) un temps d’incubation suffisant avec les enzymes de digestion. Le tissu thymique humain est, par exemple, nettement plus difficile à dissocier que le tissu murin et les temps de digestion doivent donc être plus longs. Si l’ajustement n’est pas fait pour les tissus humains, le rendement stromal et la variété cellulaire seront diminués (Figure 2A). Les enzymes de dissociation nécessitent une température optimale de 37 °C qui influence inévitablement l’expression des gènes27. Bien qu’une dissociation à froid ou à basse température soit souhaitable pour conserver les états cellulaires, il n’existe actuellement aucune combinaison d’enzymes de dissociation active à froid adaptée aux os et à la moelle osseuse. Pour tout tissu nécessitant une digestion, l’hétérogénéité et le pourcentage de contribution acquis à partir de différents types de cellules changeront invariablement avec le temps de digestion, la composition du cocktail enzymatique et le traitement. En aval de ces étapes initiales, l’hétérogénéité et la représentation seront encore limitées par les étapes de filtration telles que la taille des buses pendant le tri et la capture des types de cellules difficiles (par exemple, les adipocytes du stroma) et les diamètres des canaux des dispositifs fluidiques. Ainsi, lorsque nous comparons des ensembles de données, nous devons garder à l’esprit que ces différences dans les protocoles peuvent avoir un impact sur la représentation des sous-populations. Il s’ensuit logiquement que nous devons être vigilants pour que les étapes de traitement soient égales lors de la mesure de l’impact des perturbations dans les systèmes stromaux.

Alors que le coût du séquençage a été et est en baisse, les technologies de cellules uniques sont souvent limitées par le nombre de cellules pouvant être analysées. Pour optimiser la capacité de chaque kit de réactifs, la déplétion magnétique des cellules hématopoïétiques a été utilisée dans la mesure du possible. Cela permet d’éviter un grand nombre de cellules contaminantes qui sont beaucoup plus nombreuses que le stroma dans les fractions d’échantillons de moelle osseuse et thymique. Cependant, si le matériel de départ est limité, comme dans le cas du tissu thymique post-greffe, la perte accrue et non spécifique de cellules que les stratégies de déplétion magnétique entraînent invariablement peut la rendre déconseillée. De plus, lors de la préparation et de la digestion des tissus, le broyage, la découpe et la libération enzymatique des composants de la matrice extracellulaire génèrent une grande quantité de débris. Ce type de contaminant, s’il est laissé dans l’échantillon pour l’analyse, peut causer des problèmes de colmatage lors du traitement en aval, provoquer des puits négatifs pour le tri de l’indice de cellule unique et gonfler fortement les pourcentages de porte mère dans l’analyse. La coloration à la calcéine a été utilisée pour obtenir des résultats positifs pour les cellules/cellules vivantes. Calcein est disponible en différentes couleurs, ce qui le rend très adaptable à votre matrice de coloration. Lorsque vous travaillez avec du calcéin, veillez à ne pas soumettre le colorant à des cycles répétés de congélation-décongélation (c’est-à-dire préparez-le toujours frais et conservez-le à température ambiante après la dissolution).

La possibilité de multiplexer des échantillons basés sur des anticorps codés à barres avec des oligos d’ADN28 permet d’augmenter l’utilité des réactions de séquençage de cellules uniques sur des plateformes telles que 10x Genomics. Les anticorps de hashtagging conçus pour le multiplexage d’échantillons ont des cibles différentes pour les molécules de surface cellulaire ou la membrane nucléaire et une spécificité pour la souris et l’homme. Bien que le système de hashtag cellulaire ait été utilisé avec succès pour plusieurs tissus, des expériences combinant des mélanges d’enzymes de digestion avec l’utilisation ultérieure de hashtags peuvent conduire à une récupération considérablement réduite. Nous avons tenté d’inclure des étapes de lavage supplémentaires après la dissociation et ajouté de l’EDTA pour inhiber l’activité des enzymes de digestion. Cependant, même avec ces étapes, attendez-vous à une identification par hashtag plus faible que les cellules hématopoïétiques. Il a été constaté qu’avec les protocoles de digestion enzymatique, les taux de capture des hashtags se situaient entre 30 % et 70 %. Cela se produit malgré le fait que le même clone d’anticorps avec un conjugué fluorochrome a marqué >90% des cellules stromales de la même population. Tout plan expérimental associant la digestion enzymatique des tissus avec le hashtag doit être testé et des précautions doivent être prises pour assurer l’inhibition enzymatique.

Déclarations de divulgation

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

D.T.S. est administrateur et actionnaire d’Agios Therapeutics et d’Editas Medicines. fondateur, directeur, actionnaire et membre du conseil consultatif scientifique de Magenta Therapeutics et LifeVault Bio, actionnaire et fondateur de Fate Therapeutics et Garuda Therapeutics, et administrateur, fondateur et actionnaire de Clear Creek Bio, consultant pour FOG Pharma, Inzen Therapeutics et VCanBio, et bénéficiaire d’un financement de recherche parrainé par Sumitomo Dianippon. D.T.S et K.G sont les inventeurs de US20220143099A1 de brevets.

Remerciements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Nous avons bénéficié de l’assistance technique d’experts de l’installation de cytométrie en flux HSCI-CRM du Massachusetts General Hospital et de la plateforme Bauer de l’Université Harvard. T.K. et K.G. ont été soutenus par le Conseil suédois de la recherche et C.M. par la Fondation allemande pour la recherche. Nous remercions Sergey Isaev et I-Hsiu Lee pour leur aide dans l’analyse des données de séquençage de l’ARN unicellulaire.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
0,25 % Trypsine-EDTAThermo Fisher Scientific25200-072
7AAD (7-aminoactinomycine D)BD Biosciences559925
Cocktail de lignée anti-humaine 3-FITCBD Biosciences643510
Albumine sérique bovineMillipore SigmaA9647
C57Bl/6 sourisJackson664Mâles ou femelles, 8-12
semaines Calcein  ;Fisher Scientific65-0853-78
Collagénase IVMillipore SigmaC5138
Corning Filtres à cellules stériles, blanc, taille des mailles : 70 µ ; mFisher Scientific08-771-2
Dispase IIThermo Fisher Scientific17105041
Dnase I SolutionThermo Fisher Scientific90083  ; 2500 U/mL
Souris Easysep streptavidine RapidSpheres Kit d’isolementStemCell Technologies19860
Sérum de bovin fœtalGibcoA31605-01Qualifié One Shot
Human Fc BlockBD Biosciences564220
Liberase TM  ;Millipore Sigma5401127001Research Grade
Medium 199Gibco12350
Souris anti-humaine CD235a-BV77BD Biosciences740785
Souris anti-humaine CD31-PE/Dazzle594Biolegend303130
Souris anti-humaine CD45-BV77Biolegend304050
Souris anti-humaine CD4-BV605BD Biosciences562658
Souris anti-humaine CD66b-FITCBD Biosciences555724
Souris anti-humaine CD8-APC/Cy7BD Biosciences557760
Souris anti-humaine EpCam-BV421Biolegend324220
Protecteur Inhibiteur de RNaseMillipore Sigma3335402001
Rat anti-souris CD105-PE /dazzle594Biolegend120424
Rat anti-souris CD11b-BiotineBiolegend101204
Rat anti-souris CD140a-APCFisher Scientific17-1401-81
Rat Anti-souris CD16/CD32 (souris BD Fc Block)BD Biosciences553142
Rat anti-souris CD31-BUV737BD Biosciences612802
Rat anti-souris CD31-BV421Biolegend102424
Rat anti-souris CD3-BiotineBiolegend100244
Rat anti-souris CD45.2-BiotineBiolegend109804
Rat anti-souris CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-souris CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-souris CD45-PE/Cy7Biolegend103114
Rat anti-souris CD45R/B220-BiotinBiolegend103204
Rat anti-souris CD51-PEBiolegend104106
Rat anti-souris EpCam-BV711BD Biosciences563134
Rat anti-souris Ly-6A/E(Sca-1)-AF700Biolegend108142
Rat anti-souris Ly-6G/Ly-6C(Gr1)-BiotinBiolegend 108404
Anti-souris pour rat Ter119-BiotinBiolegend116204
Anti-souris pour rat Ter119-PEBiolegend116208
anti-souris pour rat Ter119-PE/Cy7Biolegend116222
Stemxyme  ;Worthington BiochemicalLS004107

Références

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S quen age sur cellule uniquedissociation du thymusisolement de la moelle osseusefiltration sur tamis cellulaires paration par billes magn tiquesanalyse FACScellules stromales murinesh t rog n it des populations cellulaires

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