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Article de méthode

Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

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DOI :

10.3791/66236

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16 février 2024

 ,  , 
1Department of Neuroscience, Yale School of Medicine

Dans cet article

Résumé

L’article décrit l’optimisation des paramètres d’acquisition de la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de cargaisons endogènes marquées à une résolution de neurone unique chez un nématode vivant.

Résumé

Le transport axonal est une condition préalable à la livraison des protéines axonales depuis leur site de synthèse dans le corps cellulaire neuronal jusqu’à leur destination dans l’axone. Par conséquent, la perte du transport axonal altère la croissance et la fonction neuronales. L’étude du transport axonal permet donc d’améliorer notre compréhension de la biologie des cellules neuronales. Avec les récentes améliorations de l’édition du génome CRISPR Cas9, le marquage endogène des cargaisons axonales est devenu accessible, permettant d’aller au-delà de la visualisation du transport basée sur l’expression ectopique. Cependant, le marquage endogène se fait souvent au détriment d’une faible intensité de signal et nécessite des stratégies d’optimisation pour obtenir des données robustes. Ici, nous décrivons un protocole pour optimiser la visualisation du transport axonal en discutant des paramètres d’acquisition et une approche de blanchiment pour améliorer le signal de la cargaison endogène marquée sur un fond cytoplasmique diffus. Nous appliquons notre protocole pour optimiser la visualisation des précurseurs de vésicules synaptiques (SVP) marqués par RAB-3 marqué par protéine fluorescente verte (GFP) afin de mettre en évidence comment l’ajustement fin des paramètres d’acquisition peut améliorer l’analyse de la cargaison axonale marquée de manière endogène chez Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

Tout au long de la vie, les neurones dépendent du transport axonal pour transporter les protéines, les lipides et d’autres molécules du corps cellulaire à leur destination finale dans l’axone. Par conséquent, l’altération du transport axonal est associée à une perte de la fonction neuronale et est souvent impliquée dans la pathologie des troubles neurodégénératifs 1,2. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents au transport axonal est d’un grand intérêt.

Plusieurs décennies de recherche sur le transport axonal ont révélé de nombreuses informations importantes sur la machinerie moléculaire qui médie ce transport, leur composition ainsi que les mécanismes de régulation. Le transport axonal à longue distance se produit sur le cytosquelette des microtubules, qui se compose de polymères de microtubules partiellement chevauchants qui sont généralement orientés avec leur extrémité positive dans les axones3. Par conséquent, le transport antérograde est médié par des protéines motrices qui se déplacent jusqu’à l’extrémité positive des microtubules, les kinésines, tandis que le transport rétrograde dépend du moteur de dynéine dirigé vers l’extrémité négative. Bien que de nombreux aspects du transport aient été révélés, pour de nombreuses protéines axonales, on ne sait toujours pas comment elles sont chargées dans la machinerie de transport, comment les colis de transport individuels sont organisés et comment ce transport est régulé3.

Le transport axonal a d’abord été étudié dans des expériences de radio-marquage, dans lesquelles des acides aminés radiomarqués ont été injectés dans le compartiment somatique, où ils ont été incorporés dans des protéines endogènes naissantes et ont pu être suivis au fil du temps dans le compartiment axonal par autoradiographie4. Bien que les expériences de radiomarquage aient permis d’étudier le transport axonal de protéines endogènes in vivo, elles ne permettent pas de suivre directement le comportement de la cargaison individuelle pour obtenir des informations mécanistes4. Cette limitation a été surmontée grâce à l’utilisation de la microscopie à fluorescence. Cependant, le transport axonal n’est souvent pas visualisé sur des protéines endogènes, mais plutôt par l’expression d’une copie marquée par fluorescence. En particulier pour les protéines faiblement exprimées, la surexpression fournit des intensités de signal plus élevées qui rendent possible la visualisation, de préférence avec une résolution de neurone unique. De plus, l’expression ectopique de la protéine marquée fluorescente contourne le besoin et les défis de l’édition du génome. Inversement, il a été avancé que le comportement de la cargaison exprimée de manière ectopique peut différer du comportement de la cargaison endogène5.

Les améliorations récentes de l’édition du génome ont rendu les stratégies de marquage endogène plus accessibles. Par conséquent, une intensité de signal plus faible est devenue la principale limitation à l’étude du transport axonal d’une cargaison par expression ectopique au lieu du marquage endogène. Des considérations minutieuses dans la stratégie de marquage endogène associées à une optimisation des conditions d’acquisition peuvent surmonter ce défi.

Les nématodes constituent un excellent modèle de recherche pour étudier le transport axonal in vivo en raison de leur transparence et de leur facilité dans les manipulations génétiques. Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de recherche pour visualiser le transport axonal de protéines endogènes avec une résolution de neurone unique chez Caenorhabditis elegans vivant. Nous visualisons le transport axonal des précurseurs des vésicules synaptiques en utilisant une souche générée par le Jorgensen Lab6, dans laquelle la RAB GTPase associée à la vésicule, RAB3, est marquée de manière endogène avec GFP, dans le motoneurone DA9. En demandant comment de petites adaptations de différents paramètres d’acquisition et de photoblanchiment peuvent améliorer la visualisation d’événements de transport individuels, le protocole fournit des idées sur la façon d’optimiser les conditions d’imagerie.

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Protocole

Pour un protocole détaillé sur la façon de maintenir et de préparer les nématodes pour l’imagerie de cellules vivantes, reportez-vous aux travaux de S.Niwa 7.

1. Génération de souches de vers

En plus de générer des souches de nématodes, le Caenorhabditis Genetics Center (CGC)8 contient une collection croissante de souches de nématodes avec des protéines endogènes marquées par fluorescence qui peuvent être obtenues directement à partir de leur page Web.

  1. Choix de la stratégie de marquage par fluorescence
    1. Utilisez la souche de nématode MTS1161, qui contient l’allèle6 de rab-3(ox699), pour visualiser la GFP endogène marquée RAB-3 dans le motoneurone DA9 (la souche sera déposée au CGC). Pour visualiser d’autres protéines axonales, générez une souche de nématode avec une protéine marquée endogène en utilisant le protocole d’édition CRISPR Cas9 du Mello Lab9.
      REMARQUE : MTS1161 utilise une approche de recombinaison pour marquer spécifiquement RAB-3 de manière endogène avec une étiquette GFP6. Une approche alternative courante est basée sur la reconstitution d’une protéine fluorescente divisée, qui est recommandée pour les protéines particulièrement faiblement exprimées, car elle augmente le nombre de copies fluorescentes par protéine endogène en utilisant plusieurs copies fluorescentes divisées10. Le nombre de copies peut initialement être estimé sur la base des ensembles de données de transcriptome de la page Web CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) 11.
  2. Choix du neurone pour visualiser le transport axonal
    1. Dans la souche MTS1161, visualisez RAB-3 dans le motoneurone DA9 (voir Figure 1). Pour d’autres cargaisons axonales, en particulier les protéines faiblement exprimées, identifiez un neurone dans lequel les niveaux d’expression de la protéine analysée sont les plus élevés à l’aide de la page Web CenGen.
      REMARQUE : Le projet CenGen (cengen.org) fournit une excellente ressource en ligne pour estimer les niveaux d’expression d’une protéine d’intérêt dans de nombreux neurones du nématode sur la base d’un vaste ensemble de données transcriptomiques couvrant les 302 neurones du système nerveux de C. elegans 12,13.

2. Manipulation des vers et préparation pour l’imagerie

  1. Maintenir les nématodes sur une pelouse de bactéries (souche : OP50) ensemencées sur des plaques de milieu de croissance des nématodes à 20 °C et cultivées jusqu’à l’âge adulte pour l’imagerie.
    REMARQUE : Il est important de mesurer le transport axonal à un stade d’âge défini, car les taux de transport diminuent avec l’âge de manière constante à travers différentes cargaisons axonales, classes de neurones et organismes14, 15, 16, 17, 18-Les nématodes au stade larvaire L4 ou 1 jour avant l’âge adulte ont été utilisés dans la plupart des articles et offrent donc les plus grands ensembles de données pour les comparaisons.
  2. Préparez les nématodes pour l’imagerie des cellules vivantes : Effectuez toutes les étapes suivantes avec un stéréomicroscope pour visualiser et manipuler les vers.
    1. Transférez les nématodes dans une gouttelette de 0,5 mM de lévamisole à l’aide d’un pic en fil de platine et incubez les nématodes pendant 20 min dans la gouttelette.
    2. Montez soigneusement 10 à 20 nématodes de la gouttelette de lévamisole dans une gouttelette de 12 μL de milieu M9 sur une plaque d’agarose à 10 % (dissoute dans le milieu M9) sur une lame de verre à l’aide d’un cure-cheveux. Pour une procédure détaillée sur la façon de faire un patch d’agarose à 10%, reportez-vous au protocole de S.Niwa7.
      REMARQUE : Le montage d’un petit nombre de nématodes est suffisant car seuls quelques animaux seront imagés par lame avant que les animaux ne commencent à souffrir d’hypoxie.
    3. Placez une lamelle sur la gouttelette (22 mm x 22 mm ou 18 mm x 18 mm). Pour le transport d’imagerie dans l’axone DA9, positionnez l’axone près de la lamelle. Pour ce faire, faites pivoter la lamelle de 45° après l’avoir placée sur le dessus de la plaque de gélose, pour faire rouler les animaux sur leur dos.
    4. Scellez l’espace entre la lamelle et la lame de verre avec un gel visqueux comme de la vaseline. Cela empêchera la plaque d’agarose de sécher, ce qui peut faire dériver les nématodes hors du champ d’imagerie.
      REMARQUE : Il est crucial de traiter les animaux aussi doucement que possible. Des concentrations trop élevées de lévamisole ou des dommages physiques au ver peuvent altérer le transport axonal. De légères contractions de la queue pendant la séance d’imagerie sont un bon signe que l’animal reste en bonne santé. Les animaux restent en bonne santé et peuvent même se remettre de la plaque d’agarose après la séance d’imagerie.

3. Microscopie à cellules vivantes

REMARQUE : Les valeurs exactes des paramètres d’acquisition peuvent différer d’un microscope à l’autre. Cependant, les tendances pour chaque paramètre d’acquisition doivent être indépendantes du microscope utilisé. Un microscope confocal à disque rotatif équipé d’une ligne laser distincte pour le blanchiment a été utilisé dans ce protocole (voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur le microscope). La fluorescence verte a été excitée par un laser de 488 nm et l’émission a été filtrée par un filtre d’émission ET525/36. Le blanchiment a été effectué à l’aide d’une ligne laser de 488 nm.

  1. Assurez-vous que la température de la pièce, ou si une étape à température contrôlée est disponible, est réglée à une température constante. Pour les nématodes, réglez la température à 20 °C.
  2. Montez la diapositive et utilisez un objectif avec un grossissement de 4x-20x pour localiser les nématodes sur la lame et mémoriser les positions. Passez à un objectif de grossissement 63x pour l’acquisition d’images.
  3. Prenez une seule image pour vérifier les paramètres d’acquisition initiaux. Suivez les intensités du signal dans le champ de vision avec l’histogramme d’intensité du logiciel d’acquisition. Les valeurs d’intensité doivent couvrir le tiers inférieur du signal maximal que la caméra peut détecter. Évitez la saturation des pixels. Augmentez l’intensité du laser d’excitation si l’intensité du signal est trop faible.
    REMARQUE : N’utilisez pas d’intensités laser d’excitation trop élevées car il blanchit la protéine fluorescente pendant le time-lapse.
  4. Modifiez le paramètre d’acquisition et les étapes ici pour optimiser la détection du signal de fluorescence.
    1. Mise en œuvre d’une étape de blanchiment : Blanchir la région de l’axone qui va être analysée à l’aide d’une ligne laser de 488 nm (puissance : 15 mW) pour l’étape de blanchiment. Visez une efficacité de blanchiment d’au moins 90 %. Déterminez l’efficacité du blanchiment en comparant l’intensité du signal de la région avant et après l’étape de blanchiment.
      REMARQUE : Le blanchiment améliore le signal des particules en mouvement en abaissant le signal qui dérive des particules stationnaires ainsi que du signal qui dérive de la fraction cytoplasmique de la protéine en arrière-plan. La cargaison membraneuse, telle que RAB-3 sur les précurseurs des vésicules synaptiques, a une faible fraction cytoplasmique, de sorte que l’étape de blanchiment n’améliore que légèrement le signal du paquet de transport sur le fond cytoplasmique (Figure 2A,D). Cependant, le blanchissement permet de mieux retracer les événements de transport individuels sur de plus longues distances et de quantifier les temps de pause (Figure 2A).
    2. Binning : utilisez le binning 2 x 2 pour améliorer l’intensité du signal des événements de transport individuels. Le regroupement combine des réseaux de pixels en un seul pixel plus grand. Cela réduira la résolution spatiale mais augmentera l’intensité du signal des événements de transport individuels et est particulièrement utile pour les particules faibles (Figure 2B,D).
    3. Temps d’exposition : Augmentez le temps d’exposition pour augmenter l’intensité du signal. L’augmentation du temps d’exposition augmente l’intensité du signal de l’échantillon au détriment de l’obtention d’une résolution temporelle plus faible pour les événements de transport. Pour l’expérience ici, utilisez une résolution temporelle de 300 ms à 700 ms entre des points de temps consécutifs (temps d’exposition de 100 à 500 ms) pour suivre les événements de transport individuels de RAB-3. (Figure 2C,D)
  5. Enregistrement en accéléré : Prenez un laps de temps d’au moins 1 à 3 minutes en fonction de l’intensité du signal de la protéine ainsi que de la fréquence des événements de transport individuels. Une fois qu’un laps de temps a été enregistré, passez à l’animal suivant. Les animaux sur une lame ne doivent pas être imagés pendant plus de 30 minutes pour s’assurer que les animaux enregistrés sont en bonne santé.
    REMARQUE : De légères secousses de la queue de l’animal pendant l’enregistrement sont un indicateur que l’animal est toujours en vie.

4. Analyse des données de transport axonal

REMARQUE : Utilisez ImageJ/Fiji19 pour les étapes d’analyse d’image suivantes. Fidji est capable de lire les données à l’aide de tous les logiciels de microscopie courants.

  1. Génération Kymograph
    1. Importer les données : importez le fichier de données time-lapse dans Fidji. S’il ne peut pas importer les données aux Fidji, exportez l’enregistrement du temps sous forme de fichier tiff à partir du progiciel et chargez-le ensuite dans les Fidji.
    2. Correction de la dérive : Vérifiez si le segment de l’animal/de l’axone s’est déplacé ou a légèrement dérivé lors de l’acquisition de l’image. Corrigez les mouvements ou les dérives des animaux en exécutant le plugin StackReg20. Lors de l’exécution du plugin, choisissez la transformation Rigid Body .
    3. Génération manuelle d’un kymographe : une procédure détaillée étape par étape est fournie à la figure 3. Utilisez le film corrigé de la dérive pour générer le kymographe. Utilisez l’outil Ligne segmentée et ajustez la largeur de la ligne pour qu’elle corresponde au diamètre de l’axone en double-cliquant avec le bouton gauche de la souris sur l’icône de la ligne segmentée pour tracer une ligne le long du segment d’axone qui sera analysé. Exécutez le plug-in ImageJ/Fiji Kymoreslicewide pour générer le kymographe et utilisez la valeur d’intensité maximale sur toute la largeur de la ligne dans ses paramètres de paramètre.
      REMARQUE : Garder une cohérence dans la direction du dessin de la ligne (par exemple, toujours proximal à l’axone distal ou inversé) simplifie le traçage de la direction du mouvement vers l’arrière dans les kymographes.
  2. Analyse des paramètres de transport
    1. Calculez le paramètre de transport : numéro d’événement, vitesse, durée de course et durée de pause à partir du kymographe en suivant les étapes suivantes.
      1. Suivre les événements de transport dans le kymographe : utilisez l’outil Ligne droite pour suivre des événements de transport individuels sur le kymographe. Enregistrez chaque ligne dans le gestionnaire de retour sur investissement et tracez tous les événements de transport dans le kymographe. Choisissez les paramètres de mesure suivants dans ImageJ/Fiji : Aire, Rectangle englobant, Valeur de gris moyenne, Diamètre de Feret.
      2. Paramètre de transport Calculate : collez le tableau des résultats dans une feuille de calcul et utilisez les colonnes suivantes des sections de résultats pour calculer :
        Longueur de course : multipliez la largeur (en pixels) par la résolution de la caméra (par exemple, x μm/pxl) pour déterminer la longueur de course en μm.
        Vélocité : Durée de la course/Durée de la course. Pour déterminer la durée d’un mouvement en secondes, multipliez la hauteur (en pixels) par le temps d’acquisition entre des points temporels consécutifs (par exemple, x s/pixel).
        Temps de pause : durée de l’exécution entre deux mouvements consécutifs où la vélocité est de 0.
        Numéro d’événement : Le nombre total d’événements peut être normalisé en fonction de la longueur totale du kymographe pour déterminer le nombre d’événements par minute et le segment de longueur axonale. Les événements peuvent ensuite être classés en événements de transport antérogrades et rétrogrades. Pour déterminer la directionnalité de chaque événement de mouvement, utilisez l’outil Angle de Feret. Dans les kymographes qui ont été initialement générés en traçant la ligne segmentée du proximal au distal et les événements de transport antérogrades dans le kymographe pointent de droite à gauche, un angle de Féret < 90° indiquera un événement antérograde et >90° un événement rétrograde, sinon ce sera l’inverse.

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Résultats

Vue d’ensemble du système modèle et de la procédure de mesure
Pour visualiser le transport axonal des précurseurs des vésicules synaptiques, nous avons tracé de manière endogène la GFP marquée RAB-3. Ici, nous utilisons une souche6 de GFP ::Flip-on ::RAB-3 récemment générée, dans laquelle l’expression de la recombinase Flippase sous un promoteur spécifique de la cellule (glr-4p) marque RAB-3 endogène dans le motoneurone DA9. DA9 est un motoneurone bipolaire, dont le co...

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Discussion

Limites de la méthode et méthodes alternatives
Dans ce protocole, nous avons optimisé les paramètres d’acquisition pour visualiser le transport axonal de RAB-3 marqué endogènement, qui est associé à des précurseurs de vésicules synaptiques. Pour visualiser RAB-3, nous avons utilisé une souche6 de FLIP-on ::GFP ::RAB-3 récemment publiée et exprimé la recombinase Flippase sous un promoteur spécifique de la cellule (glr-4p)25

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Déclarations de divulgation

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrentiel ou financier qui aurait pu sembler influencer les travaux rapportés dans cet article.

Remerciements

Les auteurs tiennent à remercier les laboratoires Yogev et Hammarlund pour l’assistance technique, les commentaires et les discussions. Nous tenons à remercier tout particulièrement Grace Swaim pour ses conseils en imagerie de cellules vivantes et Grace et Brian Swaim pour avoir initialement établi l’analyse manuelle par kymographe en laboratoire. OG est soutenu par une bourse Walter-Benjamin financée par la Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, Fondation allemande pour la recherche) -Projet# 465611822. SY est financé par la subvention R35-GM131744 des NIH.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AgaroseSigma-AldrichA9539
Plaques de recouvrement (22 mm x 22 mm, No1) ; Verre de protection Gold SealThomas Scientific6672A14
LevamisoleChemCruzsc-205730
Microscope : Microscope inversé Nikon Ti2, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Appareil photo Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, Objectif à immersion dans l’huile Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA, Scanner de photostimulation Nikon à 488 nm avec un filtre d’émission ET525/36Microscope
  ; NIS-elements ARNikonpour le Nikon Ti2  ;
Lames de microscopie simples prénettoyéesThermo Scientific420-004T
Nematode strainIdentifierSource
rab-3(ox699[GFP ::flip-on ::rab-3]) (II) ; shyIs43(glr-4p ::FLP-NLSx2 ; odr-1p ::RFP) (II)Park et al. (DOI : 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161  ;Sera déposé à la CGC (https://cgc.umn.edu/)
confocal à disque tournant Nikon Logiciel

Références

  1. Millecamps, S., Julien, J. P. Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).
  2. Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal transport deficits and adult-onset neurodegenerative diseases. Neurobiol Dis. 105, 273-282 (2017).
  3. Kevenaar, J. T., Hoogenraad, C. C. The axonal cytoskeleton: from organization to function. Front Mol Neurosci. 8, 44(2015).
  4. Roy, S. Seeing the unseen: the hidden world of slow axonal transport. Neuroscientist. 20 (1), 71-81 (2014).
  5. Watson, E. T., Pauers, M. M., Seibert, M. J., Vevea, J. D., Chapman, E. R. Synaptic vesicle proteins are selectively delivered to axons in mammalian neurons. Elife. 12, e82568(2023).
  6. Schwartz, M. L., Jorgensen, E. M. SapTrap, a toolkit for high-throughput CRISPR/Cas9 gene modification in Caenorhabditis elegans. Genetics. 202 (4), 1277-1288 (2016).
  7. Niwa, S. Immobilization of Caenorhabditis elegans to analyze intracellular transport in neurons. J Vis Exp. (128), e56690(2017).
  8. Caenorhabditis genetics center (CGC). University of Minnesota. , Available from: https://cgc.umn.edu/ (2023).
  9. Ghanta, K. S., Mello, C. C. Melting dsDNA donor molecules greatly improves precision genome editing in Caenorhabditis elegans. Genetics. 216 (3), 643-650 (2020).
  10. He, S., Cuentas-Condori, A., Miller, D. M. NATF (Native and Tissue-Specific Fluorescence): A strategy for bright, tissue-specific GFP labeling of native proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 212 (2), 387-395 (2019).
  11. Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN Project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  12. Taylor, S. R., et al. Molecular topography of an entire nervous system. Cell. 184 (16), 4329-4347 (2021).
  13. Hammarlund, M., Hobert, O., Miller, D. M., Sestan, N. The CeNGEN project: The complete gene expression map of an entire nervous system. Neuron. 99 (3), 430-433 (2018).
  14. Takihara, Y. In vivo imaging of axonal transport of mitochondria in the diseased and aged mammalian CNS. Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (33), 10515-10520 (2015).
  15. Li, L. B. The neuronal kinesin UNC-104/KIF1A is a key regulator of synaptic aging and insulin signaling-regulated memory. Curr Biol. 26 (5), 605-615 (2016).
  16. Viancour, T. A., Kreiter, N. A. Vesicular fast axonal transport rates in young and old rat axons. Brain Res. 628 (1-2), 209-217 (1993).
  17. Cross, D. J., Flexman, J. A., Anzai, Y., Maravilla, K. R., Minoshima, S. Age-related decrease in axonal transport measured by MR imaging in vivo. Neuroimage. 39 (3), 915-926 (2008).
  18. Vagnoni, A., Hoffmann, P. C., Bullock, S. L. Reducing Lissencephaly-1 levels augments mitochondrial transport and has a protective effect in adult Drosophila neurons. J Cell Sci. 129 (1), 178-190 (2016).
  19. Schindelin, J., et al. Fiji: an open-source platform for biological-image analysis. Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
  20. Thevenaz, P., Ruttimann, U. E., Unser, M. A pyramid approach to subpixel registration based on intensity. IEEE Trans Image Process. 7 (1), 27-41 (1998).
  21. Neumann, S., Chassefeyre, R., Campbell, G. E., Encalada, S. E. KymoAnalyzer: a software tool for the quantitative analysis of intracellular transport in neurons. Traffic. 18 (1), 71-88 (2017).
  22. Hall, D. H., Russell, R. L. The posterior nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans: serial reconstruction of identified neurons and complete pattern of synaptic interactions. J Neurosci. 11 (1), 1-22 (1991).
  23. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the ventral nerve cord of Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 275 (938), 327-348 (1976).
  24. White, J. G., Southgate, E., Thomson, J. N., Brenner, S. The structure of the nervous system of the nematode Caenorhabditis elegans. Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci. 314 (1165), 1(1986).
  25. Park, J., Xie, Y., Miller, K. G., De Camilli, P., Yogev, S. End-binding protein 1 promotes specific motor-cargo association in the cell body prior to axonal delivery of dense core vesicles. Curr Biol. 33 (18), 3851-3864 (2023).
  26. Dokshin, G. A., Ghanta, K. S., Piscopo, K. M., Mello, C. C. Robust genome editing with short single-stranded and long, partially single-stranded DNA donors in Caenorhabditis elegans. Genetics. 210 (3), 781-787 (2018).
  27. Paix, A., Folkmann, A., Rasoloson, D., Seydoux, G. High efficiency, homology-directed genome editing in Caenorhabditis elegans using CRISPR-Cas9 ribonucleoprotein complexes. Genetics. 201 (1), 47-54 (2015).
  28. Goudeau, J., et al. Split-wrmScarlet and split-sfGFP: tools for faster, easier fluorescent labeling of endogenous proteins in Caenorhabditis elegans. Genetics. 217 (4), (2021).
  29. Cranfill, P. J., et al. Quantitative assessment of fluorescent proteins. Nat Methods. 13 (7), 557-562 (2016).
  30. Fan, X., et al. SapTrap assembly of Caenorhabditis elegans MosSCI transgene vectors. G3. 10 (2), Bethesda. 635-644 (2020).
  31. Glomb, O., et al. A kinesin-1 adaptor complex controls bimodal slow axonal transport of spectrin in Caenorhabditis elegans. Dev Cell. 58 (19), 1847-1863 (2023).

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