Optimisation de la visualisation du transport axonal de la cargaison endogène par microscopie à fluorescence chez Caenorhabditis elegans vivant

Summary

L’article décrit l’optimisation des paramètres d’acquisition de la microscopie à fluorescence pour visualiser le transport axonal de cargaisons endogènes marquées à une résolution de neurone unique chez un nématode vivant.

Abstract

Le transport axonal est une condition préalable à la livraison des protéines axonales depuis leur site de synthèse dans le corps cellulaire neuronal jusqu’à leur destination dans l’axone. Par conséquent, la perte du transport axonal altère la croissance et la fonction neuronales. L’étude du transport axonal permet donc d’améliorer notre compréhension de la biologie des cellules neuronales. Avec les récentes améliorations de l’édition du génome CRISPR Cas9, le marquage endogène des cargaisons axonales est devenu accessible, permettant d’aller au-delà de la visualisation du transport basée sur l’expression ectopique. Cependant, le marquage endogène se fait souvent au détriment d’une faible intensité de signal et nécessite des stratégies d’optimisation pour obtenir des données robustes. Ici, nous décrivons un protocole pour optimiser la visualisation du transport axonal en discutant des paramètres d’acquisition et une approche de blanchiment pour améliorer le signal de la cargaison endogène marquée sur un fond cytoplasmique diffus. Nous appliquons notre protocole pour optimiser la visualisation des précurseurs de vésicules synaptiques (SVP) marqués par RAB-3 marqué par protéine fluorescente verte (GFP) afin de mettre en évidence comment l’ajustement fin des paramètres d’acquisition peut améliorer l’analyse de la cargaison axonale marquée de manière endogène chez Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

Tout au long de la vie, les neurones dépendent du transport axonal pour transporter les protéines, les lipides et d’autres molécules du corps cellulaire à leur destination finale dans l’axone. Par conséquent, l’altération du transport axonal est associée à une perte de la fonction neuronale et est souvent impliquée dans la pathologie des troubles neurodégénératifs ^1,2. Par conséquent, la compréhension des mécanismes sous-jacents au transport axonal est d’un grand intérêt.

Plusieurs décennies de recherche sur le transport axonal ont révélé de nombreuses informations importantes sur la machinerie moléculaire qui médie ce transport, leur composition ainsi que les mécanismes de régulation. Le transport axonal à longue distance se produit sur le cytosquelette des microtubules, qui se compose de polymères de microtubules partiellement chevauchants qui sont généralement orientés avec leur extrémité positive dans les axones³. Par conséquent, le transport antérograde est médié par des protéines motrices qui se déplacent jusqu’à l’extrémité positive des microtubules, les kinésines, tandis que le transport rétrograde dépend du moteur de dynéine dirigé vers l’extrémité négative. Bien que de nombreux aspects du transport aient été révélés, pour de nombreuses protéines axonales, on ne sait toujours pas comment elles sont chargées dans la machinerie de transport, comment les colis de transport individuels sont organisés et comment ce transport est régulé³.

Le transport axonal a d’abord été étudié dans des expériences de radio-marquage, dans lesquelles des acides aminés radiomarqués ont été injectés dans le compartiment somatique, où ils ont été incorporés dans des protéines endogènes naissantes et ont pu être suivis au fil du temps dans le compartiment axonal par autoradiographie⁴. Bien que les expériences de radiomarquage aient permis d’étudier le transport axonal de protéines endogènes in vivo, elles ne permettent pas de suivre directement le comportement de la cargaison individuelle pour obtenir des informations mécanistes⁴. Cette limitation a été surmontée grâce à l’utilisation de la microscopie à fluorescence. Cependant, le transport axonal n’est souvent pas visualisé sur des protéines endogènes, mais plutôt par l’expression d’une copie marquée par fluorescence. En particulier pour les protéines faiblement exprimées, la surexpression fournit des intensités de signal plus élevées qui rendent possible la visualisation, de préférence avec une résolution de neurone unique. De plus, l’expression ectopique de la protéine marquée fluorescente contourne le besoin et les défis de l’édition du génome. Inversement, il a été avancé que le comportement de la cargaison exprimée de manière ectopique peut différer du comportement de la cargaison endogène⁵.

Les améliorations récentes de l’édition du génome ont rendu les stratégies de marquage endogène plus accessibles. Par conséquent, une intensité de signal plus faible est devenue la principale limitation à l’étude du transport axonal d’une cargaison par expression ectopique au lieu du marquage endogène. Des considérations minutieuses dans la stratégie de marquage endogène associées à une optimisation des conditions d’acquisition peuvent surmonter ce défi.

Les nématodes constituent un excellent modèle de recherche pour étudier le transport axonal in vivo en raison de leur transparence et de leur facilité dans les manipulations génétiques. Dans ce protocole, nous décrivons une stratégie de recherche pour visualiser le transport axonal de protéines endogènes avec une résolution de neurone unique chez Caenorhabditis elegans vivant. Nous visualisons le transport axonal des précurseurs des vésicules synaptiques en utilisant une souche générée par le Jorgensen Lab⁶, dans laquelle la RAB GTPase associée à la vésicule, RAB3, est marquée de manière endogène avec GFP, dans le motoneurone DA9. En demandant comment de petites adaptations de différents paramètres d’acquisition et de photoblanchiment peuvent améliorer la visualisation d’événements de transport individuels, le protocole fournit des idées sur la façon d’optimiser les conditions d’imagerie.

Protocol

Pour un protocole détaillé sur la façon de maintenir et de préparer les nématodes pour l’imagerie de cellules vivantes, reportez-vous aux travaux de S.Niwa ⁷.

1. Génération de souches de vers

En plus de générer des souches de nématodes, le Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ contient une collection croissante de souches de nématodes avec des protéines endogènes marquées par fluorescence qui peuvent être obtenues directement à partir de leur page Web.

1. Choix de la stratégie de marquage par fluorescence
   1. Utilisez la souche de nématode MTS1161, qui contient l’allèle⁶ de rab-3(ox699), pour visualiser la GFP endogène marquée RAB-3 dans le motoneurone DA9 (la souche sera déposée au CGC). Pour visualiser d’autres protéines axonales, générez une souche de nématode avec une protéine marquée endogène en utilisant le protocole d’édition CRISPR Cas9 du Mello Lab⁹.
      REMARQUE : MTS1161 utilise une approche de recombinaison pour marquer spécifiquement RAB-3 de manière endogène avec une étiquette GFP⁶. Une approche alternative courante est basée sur la reconstitution d’une protéine fluorescente divisée, qui est recommandée pour les protéines particulièrement faiblement exprimées, car elle augmente le nombre de copies fluorescentes par protéine endogène en utilisant plusieurs copies fluorescentes divisées¹⁰. Le nombre de copies peut initialement être estimé sur la base des ensembles de données de transcriptome de la page Web CenGen (https://cengen.shinyapps.io/CengenApp/) ¹¹.
2. Choix du neurone pour visualiser le transport axonal
   1. Dans la souche MTS1161, visualisez RAB-3 dans le motoneurone DA9 (voir Figure 1). Pour d’autres cargaisons axonales, en particulier les protéines faiblement exprimées, identifiez un neurone dans lequel les niveaux d’expression de la protéine analysée sont les plus élevés à l’aide de la page Web CenGen.
      REMARQUE : Le projet CenGen (cengen.org) fournit une excellente ressource en ligne pour estimer les niveaux d’expression d’une protéine d’intérêt dans de nombreux neurones du nématode sur la base d’un vaste ensemble de données transcriptomiques couvrant les 302 neurones du système nerveux de C. elegans ^12,13.

2. Manipulation des vers et préparation pour l’imagerie

1. Maintenir les nématodes sur une pelouse de bactéries (souche : OP50) ensemencées sur des plaques de milieu de croissance des nématodes à 20 °C et cultivées jusqu’à l’âge adulte pour l’imagerie.
   REMARQUE : Il est important de mesurer le transport axonal à un stade d’âge défini, car les taux de transport diminuent avec l’âge de manière constante à travers différentes cargaisons axonales, classes de neurones et organismes^{14, 15, 16, 17, 18-Les} nématodes au stade larvaire L4 ou 1 jour avant l’âge adulte ont été utilisés dans la plupart des articles et offrent donc les plus grands ensembles de données pour les comparaisons.
2. Préparez les nématodes pour l’imagerie des cellules vivantes : Effectuez toutes les étapes suivantes avec un stéréomicroscope pour visualiser et manipuler les vers.
   1. Transférez les nématodes dans une gouttelette de 0,5 mM de lévamisole à l’aide d’un pic en fil de platine et incubez les nématodes pendant 20 min dans la gouttelette.
   2. Montez soigneusement 10 à 20 nématodes de la gouttelette de lévamisole dans une gouttelette de 12 μL de milieu M9 sur une plaque d’agarose à 10 % (dissoute dans le milieu M9) sur une lame de verre à l’aide d’un cure-cheveux. Pour une procédure détaillée sur la façon de faire un patch d’agarose à 10%, reportez-vous au protocole de S.Niwa⁷.
      REMARQUE : Le montage d’un petit nombre de nématodes est suffisant car seuls quelques animaux seront imagés par lame avant que les animaux ne commencent à souffrir d’hypoxie.
   3. Placez une lamelle sur la gouttelette (22 mm x 22 mm ou 18 mm x 18 mm). Pour le transport d’imagerie dans l’axone DA9, positionnez l’axone près de la lamelle. Pour ce faire, faites pivoter la lamelle de 45° après l’avoir placée sur le dessus de la plaque de gélose, pour faire rouler les animaux sur leur dos.
   4. Scellez l’espace entre la lamelle et la lame de verre avec un gel visqueux comme de la vaseline. Cela empêchera la plaque d’agarose de sécher, ce qui peut faire dériver les nématodes hors du champ d’imagerie.
      REMARQUE : Il est crucial de traiter les animaux aussi doucement que possible. Des concentrations trop élevées de lévamisole ou des dommages physiques au ver peuvent altérer le transport axonal. De légères contractions de la queue pendant la séance d’imagerie sont un bon signe que l’animal reste en bonne santé. Les animaux restent en bonne santé et peuvent même se remettre de la plaque d’agarose après la séance d’imagerie.

3. Microscopie à cellules vivantes

REMARQUE : Les valeurs exactes des paramètres d’acquisition peuvent différer d’un microscope à l’autre. Cependant, les tendances pour chaque paramètre d’acquisition doivent être indépendantes du microscope utilisé. Un microscope confocal à disque rotatif équipé d’une ligne laser distincte pour le blanchiment a été utilisé dans ce protocole (voir le tableau des matériaux pour plus de détails sur le microscope). La fluorescence verte a été excitée par un laser de 488 nm et l’émission a été filtrée par un filtre d’émission ET525/36. Le blanchiment a été effectué à l’aide d’une ligne laser de 488 nm.

1. Assurez-vous que la température de la pièce, ou si une étape à température contrôlée est disponible, est réglée à une température constante. Pour les nématodes, réglez la température à 20 °C.
2. Montez la diapositive et utilisez un objectif avec un grossissement de 4x-20x pour localiser les nématodes sur la lame et mémoriser les positions. Passez à un objectif de grossissement 63x pour l’acquisition d’images.
3. Prenez une seule image pour vérifier les paramètres d’acquisition initiaux. Suivez les intensités du signal dans le champ de vision avec l’histogramme d’intensité du logiciel d’acquisition. Les valeurs d’intensité doivent couvrir le tiers inférieur du signal maximal que la caméra peut détecter. Évitez la saturation des pixels. Augmentez l’intensité du laser d’excitation si l’intensité du signal est trop faible.
   REMARQUE : N’utilisez pas d’intensités laser d’excitation trop élevées car il blanchit la protéine fluorescente pendant le time-lapse.
4. Modifiez le paramètre d’acquisition et les étapes ici pour optimiser la détection du signal de fluorescence.
   1. Mise en œuvre d’une étape de blanchiment : Blanchir la région de l’axone qui va être analysée à l’aide d’une ligne laser de 488 nm (puissance : 15 mW) pour l’étape de blanchiment. Visez une efficacité de blanchiment d’au moins 90 %. Déterminez l’efficacité du blanchiment en comparant l’intensité du signal de la région avant et après l’étape de blanchiment.
      REMARQUE : Le blanchiment améliore le signal des particules en mouvement en abaissant le signal qui dérive des particules stationnaires ainsi que du signal qui dérive de la fraction cytoplasmique de la protéine en arrière-plan. La cargaison membraneuse, telle que RAB-3 sur les précurseurs des vésicules synaptiques, a une faible fraction cytoplasmique, de sorte que l’étape de blanchiment n’améliore que légèrement le signal du paquet de transport sur le fond cytoplasmique (Figure 2A,D). Cependant, le blanchissement permet de mieux retracer les événements de transport individuels sur de plus longues distances et de quantifier les temps de pause (Figure 2A).
   2. Binning : utilisez le binning 2 x 2 pour améliorer l’intensité du signal des événements de transport individuels. Le regroupement combine des réseaux de pixels en un seul pixel plus grand. Cela réduira la résolution spatiale mais augmentera l’intensité du signal des événements de transport individuels et est particulièrement utile pour les particules faibles (Figure 2B,D).
   3. Temps d’exposition : Augmentez le temps d’exposition pour augmenter l’intensité du signal. L’augmentation du temps d’exposition augmente l’intensité du signal de l’échantillon au détriment de l’obtention d’une résolution temporelle plus faible pour les événements de transport. Pour l’expérience ici, utilisez une résolution temporelle de 300 ms à 700 ms entre des points de temps consécutifs (temps d’exposition de 100 à 500 ms) pour suivre les événements de transport individuels de RAB-3. (Figure 2C,D)
5. Enregistrement en accéléré : Prenez un laps de temps d’au moins 1 à 3 minutes en fonction de l’intensité du signal de la protéine ainsi que de la fréquence des événements de transport individuels. Une fois qu’un laps de temps a été enregistré, passez à l’animal suivant. Les animaux sur une lame ne doivent pas être imagés pendant plus de 30 minutes pour s’assurer que les animaux enregistrés sont en bonne santé.
   REMARQUE : De légères secousses de la queue de l’animal pendant l’enregistrement sont un indicateur que l’animal est toujours en vie.

4. Analyse des données de transport axonal

REMARQUE : Utilisez ImageJ/Fiji¹⁹ pour les étapes d’analyse d’image suivantes. Fidji est capable de lire les données à l’aide de tous les logiciels de microscopie courants.

1. Génération Kymograph
   1. Importer les données : importez le fichier de données time-lapse dans Fidji. S’il ne peut pas importer les données aux Fidji, exportez l’enregistrement du temps sous forme de fichier tiff à partir du progiciel et chargez-le ensuite dans les Fidji.
   2. Correction de la dérive : Vérifiez si le segment de l’animal/de l’axone s’est déplacé ou a légèrement dérivé lors de l’acquisition de l’image. Corrigez les mouvements ou les dérives des animaux en exécutant le plugin StackReg²⁰. Lors de l’exécution du plugin, choisissez la transformation Rigid Body .
   3. Génération manuelle d’un kymographe : une procédure détaillée étape par étape est fournie à la figure 3. Utilisez le film corrigé de la dérive pour générer le kymographe. Utilisez l’outil Ligne segmentée et ajustez la largeur de la ligne pour qu’elle corresponde au diamètre de l’axone en double-cliquant avec le bouton gauche de la souris sur l’icône de la ligne segmentée pour tracer une ligne le long du segment d’axone qui sera analysé. Exécutez le plug-in ImageJ/Fiji Kymoreslicewide pour générer le kymographe et utilisez la valeur d’intensité maximale sur toute la largeur de la ligne dans ses paramètres de paramètre.
      REMARQUE : Garder une cohérence dans la direction du dessin de la ligne (par exemple, toujours proximal à l’axone distal ou inversé) simplifie le traçage de la direction du mouvement vers l’arrière dans les kymographes.
2. Analyse des paramètres de transport
   1. Calculez le paramètre de transport : numéro d’événement, vitesse, durée de course et durée de pause à partir du kymographe en suivant les étapes suivantes.
      1. Suivre les événements de transport dans le kymographe : utilisez l’outil Ligne droite pour suivre des événements de transport individuels sur le kymographe. Enregistrez chaque ligne dans le gestionnaire de retour sur investissement et tracez tous les événements de transport dans le kymographe. Choisissez les paramètres de mesure suivants dans ImageJ/Fiji : Aire, Rectangle englobant, Valeur de gris moyenne, Diamètre de Feret.
      2. Paramètre de transport Calculate : collez le tableau des résultats dans une feuille de calcul et utilisez les colonnes suivantes des sections de résultats pour calculer :
         Longueur de course : multipliez la largeur (en pixels) par la résolution de la caméra (par exemple, x μm/pxl) pour déterminer la longueur de course en μm.
         Vélocité : Durée de la course/Durée de la course. Pour déterminer la durée d’un mouvement en secondes, multipliez la hauteur (en pixels) par le temps d’acquisition entre des points temporels consécutifs (par exemple, x s/pixel).
         Temps de pause : durée de l’exécution entre deux mouvements consécutifs où la vélocité est de 0.
         Numéro d’événement : Le nombre total d’événements peut être normalisé en fonction de la longueur totale du kymographe pour déterminer le nombre d’événements par minute et le segment de longueur axonale. Les événements peuvent ensuite être classés en événements de transport antérogrades et rétrogrades. Pour déterminer la directionnalité de chaque événement de mouvement, utilisez l’outil Angle de Feret. Dans les kymographes qui ont été initialement générés en traçant la ligne segmentée du proximal au distal et les événements de transport antérogrades dans le kymographe pointent de droite à gauche, un angle de Féret < 90° indiquera un événement antérograde et >90° un événement rétrograde, sinon ce sera l’inverse.

Results

Vue d’ensemble du système modèle et de la procédure de mesure
Pour visualiser le transport axonal des précurseurs des vésicules synaptiques, nous avons tracé de manière endogène la GFP marquée RAB-3. Ici, nous utilisons une souche⁶ de GFP ::Flip-on ::RAB-3 récemment générée, dans laquelle l’expression de la recombinase Flippase sous un promoteur spécifique de la cellule (glr-4p) marque RAB-3 endogène dans le motoneurone DA9. DA9 est un motoneurone bipolaire, dont le corps cellulaire est situé à l’arrière de l’animal, sur la face ventrale, près de l’anus (Figure 1A). Il contient une courte dendrite qui court vers l’avant le long du cordon nerveux ventral et un long axone qui court vers l’arrière, forme une commissure puis court vers l’avant le long du cordon nerveux dorsal, où il forme des synapses en passant qui innervent le muscle dorsal et le neurone VD 22,23,24. Nous visualisons le transport axonal dans la région asynaptique ; la plupart des événements de transport peuvent être capturés avec un seul plan focal (Figure 1A). Une première étape de photo-blanchiment est mise en œuvre pour réduire le bruit de fond des vésicules stationnaires dans cette zone, qui ont souvent tendance à s’arrêter dans cette région (Figure 1B). Des vidéos en accéléré sont enregistrées sur une période de 3 minutes et le signal RAB-3 le long de la région asynaptique est tracé dans un kymographe pour extraire les événements de transport individuels (Figure 1C).

Ajustement du paramètre d’acquisition pour optimiser la visualisation du transport axonal
Pour surmonter la faible intensité du signal de nombreuses protéines endogènes marquées par fluorescence, les paramètres d’acquisition du microscope doivent être optimisés. Pour une quantification robuste des événements de transport, l’intensité du signal des événements de transport individuels doit être aussi brillante que possible sur le fond cytoplasmique ou sur la cargaison stationnaire en pause. Les précurseurs des vésicules synaptiques s’arrêtent souvent dans la région asynaptique dans des bassins de vésicules distincts, ce qui interfère avec la détection de nouvelles vésicules entrantes et rend difficile le suivi de leurs traces de transport⁷.

Une seule étape initiale de blanchiment de fluorescence peut réduire considérablement le signal de fluorescence dérivé des flaques de vésicules afin d’améliorer la détection de mouvement de nouvelles vésicules entrantes (Figure 2A). L’étape de blanchiment n’a que légèrement amélioré le signal de déplacement des vésicules RAB-3 sur l’intensité du fond cytoplasmique, probablement parce que la fraction cytoplasmique de RAB-3 est très faible (Figure 2D).

L’utilisation du binning fournit une couche supplémentaire pour améliorer le signal sur l’arrière-plan des événements de transport individuels en combinant un tableau de pixels en un seul pixel. Un binning 2 x 2 réduira de moitié la résolution spatiale (ici de 108,33 nm/pixel à 216,7 nm/pixel), ce qui est toujours suffisant pour suivre les particules de transport RAB-3 individuelles (Figure 2B) mais améliore considérablement l’intensité du signal des vésicules individuelles (Figure 2D). À moins qu’une très haute résolution spatiale ne soit requise, le binning peut également être appliqué pour visualiser de nombreuses autres cargaisons axonales.

Ensuite, nous nous sommes demandé comment les changements dans le temps d’exposition peuvent améliorer l’intensité du signal d’événements de transport uniques. Nous avons particulièrement inclus le temps d’exposition dans l’analyse pour démontrer également qu’un temps d’exposition allant jusqu’à 500 ms avec 700 ms entre les points d’imagerie suivants fournit toujours une résolution temporelle à laquelle les précurseurs des vésicules synaptiques peuvent être suivis (Figure 2C,D).

Génération et analyse de kymographes avec Fidji
Générer un kymographe et analyser les événements de transport individuels en suivant les étapes de la figure 3.

Figure 1 : Vue d’ensemble du système modèle permettant de visualiser le transport axonal du RAB-3 fluorescent endogène. (A) Panneau supérieur : Vue d’ensemble du nématode avec l’axe postérieur-antérieur et l’axe ventral-dorsal indiqués. Le motoneurone DA9 est étiqueté en bleu. Panneau central : Zoom avant sur la zone encadrée affichée dans le panneau supérieur avec compartimentation DA9 indiquée. En passant, les synapses sont illustrées en vert, * indique l’anus. Notez que l’axone se poursuit dans le cordon nerveux dorsal jusqu’à ce qu’il passe par la vulve. La case rouge indique la région de la zone asynaptique. Panneau inférieur : Image de microscopie confocale de la GFP endogène marquée RAB-3 dans l’axone proximal dans un seul plan focal. Notez qu’il existe des puits vésiculaires de RAB-3 en pause plus longue dans la région asynaptique, bien que la plupart des signaux RAB-3 se regroupent dans la région synaptique. La région asynaptique est encadrée en rouge. Echelle : 20 μm. (B) Images représentatives d’un enregistrement en accéléré pour visualiser le transport axonal. Pour améliorer la traçabilité des particules de transport individuelles par rapport aux particules stationnaires, la région asynaptique est d’abord photoblanchie. Les panneaux inférieurs en boîte violette montrent un exemple d’un événement de mouvement antérograde (pointe de flèche orange) et rétrograde (pointe de flèche bleue). Les panneaux de haut en bas représentent des points temporels consécutifs. (C) L’enregistrement en accéléré en (B) a été tracé sous forme de kymographe (représentation 2D du temps sur la position). Les lignes diagonales représentent des événements de mouvement dans lesquels la pente indique la vitesse. Les lignes verticales montrent les événements stationnaires. La boîte violette est un zoom avant du kymographe pour mettre en évidence les événements de transport qui sont également représentés en (B) et les événements de transport antérogrades (orange) et rétrogrades (bleu) sont tracés. Les lignes verticales pointillées indiquent les événements de pause. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 2 : Optimisation des étapes et des paramètres d’acquisition pour améliorer la visualisation du fret axonal endogène. Des GFP ::RAB-3 endogènes ont été visualisés dans la zone asynaptique de l’axone DA9 en prenant des images d’un seul plan focal sur un microscope à disque rotatif confocal. Des kymographes ont été acquis pour visualiser les événements de transport individuels dans les directions antérogrades (de droite à gauche) et rétrogrades (de gauche à droite) (A-C). (A) Les kymographes montrent des événements de transport de RAB3 sans (kymographes gauches) ou avec une étape de blanchiment intégrée. Notez que l’étape de blanchiment améliore la visualisation des événements de pause (indiqués par des pointes de flèches jaunes) entre des événements de transport consécutifs (pointes de flèches orange). (B) La mise en œuvre du binning 2 x 2 permet d’améliorer l’intensité du signal des événements de transport RAB3 faibles. Les images ont été acquises à un temps d’exposition de 300 ms et avec (C) l’augmentation progressive du temps d’exposition (de 100 ms à l’extrême gauche à 500 ms à l’extrême droite) contribue à améliorer l’intensité du signal des événements de transport individuels. Les images ont été acquises en binning 2 x 2 et en utilisant une première étape de photoblanchiment. Tous les kymographes ont une durée totale de 3 min et sont dessinés à la même échelle, de sorte que les kymographes avec moins de points de temps d’acquisition en raison d’un laps de temps plus long entre les points d’imagerie consécutifs ont une longueur totale du kymographe plus courte. (D) Quantification de l’intensité du signal par événement de transport après soustraction de la fluorescence de fond des kymographes en (A-C). Notez que le binning et l’étape de photoblanchiment ont été acquis à un temps d’exposition de 300 ms. Comparaison statistique à l’aide de n événements pendant 100 ms (n_événements = 27 chez n_animaux = 2), 200 ms (n_événements = 30 chez n_animaux = 2), 300 ms (n_événements = 88 chez n_animaux = 6), 500 ms (n_événements = 12 chez n_animaux = 1), 300 ms sans regroupement (w.o.) (n_événements = 31 chez n_animaux = 3), 300 ms avec regroupement (w) (n_événements = 88 chez n_animaux = 6) et 300 ms, 2 x 2 binning avec blanchissement (n_événements = 88 chez n_animaux = 6) et sans blanchiment. Chaque point de données représente l’intensité du signal d’un événement de transport RAB-3 individuel après la soustraction du bruit de fond (cytoplasme de l’axone) à un seul point temporel le long de sa trace qui a été choisi au hasard. Le temps d’exposition a été comparé à l’aide d’un test de Kruskal-Wallis suivi d’une comparaison multiple de Dunn, le binning et le photoblanchiment ont été comparés à l’aide d’un test de Mann-Whitney par paires. Les barres d’erreur indiquent l’écart-type. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure 3 : Procédure étape par étape pour générer un kymographe et mesurer les événements de transport individuels. (A) Après avoir chargé l’enregistrement vidéo dans Fidji, l’outil de ligne segmentée est utilisé pour tracer une ligne sur toute la longueur du segment axonal qui va être analysé. (B) Un kymographe (panneau de droite) est généré à l’aide du plugin Kymoreslicewide avec les paramètres représentés dans le panneau de gauche. (C) Les événements de transport individuels sont suivis à l’aide de l’outil de ligne linéaire et stockés dans le gestionnaire de retour sur investissement. Le panneau de droite affiche les paramètres de mesure utilisés pour générer le tableau des résultats. (D) Les résultats de la table sont utilisés pour calculer le paramètre de transport. Les cases indiquent les paramètres importants qui sont décrits dans la section méthodes du protocole. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Discussion

Limites de la méthode et méthodes alternatives
Dans ce protocole, nous avons optimisé les paramètres d’acquisition pour visualiser le transport axonal de RAB-3 marqué endogènement, qui est associé à des précurseurs de vésicules synaptiques. Pour visualiser RAB-3, nous avons utilisé une souche⁶ de FLIP-on ::GFP ::RAB-3 récemment publiée et exprimé la recombinase Flippase sous un promoteur spécifique de la cellule (glr-4p)²⁵. Cette stratégie nous permet de marquer RAB-3 avec un seul fluorophore GFP. RAB-3 est relativement facile à visualiser car il est fortement exprimé et fortement enrichi sur les précurseurs des vésicules synaptiques, de sorte que les événements de transport individuels ont une intensité de signal brillante sur un signal faible qui dérive du fond cytoplasmique. D’autres protéines axonales peuvent nécessiter des stratégies d’optimisation supplémentaires en dehors des paramètres de microscopie pour permettre la visualisation des événements de transport. En particulier pour les protéines faiblement exprimées, le système split-GFP offre une excellente alternative. Dans ce système, la GFP₁₁ est insérée dans le locus endogène de la protéine d’intérêt et la GFP_1-10 est exprimée à partir d’un promoteur spécifique de la cellule. Un grand avantage de ce système est la petite taille de la matrice de réparation de l’ADN (environ 70 nucléotides) qui doit être insérée génomiquement, ce qui rend la recombinaison homologue plus efficace par rapport à l’insertion de l’ORF de l’étiquette fluorescente entière^26,27. En raison de sa petite taille, plusieurs fragments de GFP₁₁ peuvent être insérés dans la protéine endogène, ce qui amplifie le nombre de fluorophores GFP reconstitués par protéine et améliore ainsi le signal fluorescent de la protéine endogène et donc du paquet de transport²⁸.

En plus de marquer la protéine avec une approche split-GFP ou GFP, d’autres fluorophores génétiquement codés peuvent être utilisés qui présentent des avantages et des inconvénients uniques concernant leurs propriétés photochimiques, qui ont été récemment comparées²⁹. De plus, des fluorophores chimiques aux propriétés plus photostables peuvent être utilisés en marquant de manière endogène la protéine d’intérêt avec une balise HALO ou SNAP³⁰.

En particulier pour les protéines cytoplasmiques qui sont abondantes dans l’ensemble de l’axone, une approche de marquage conditionnel peut être nécessaire. Nous avons récemment visualisé une telle cargaison, la spectrine endogène, par microscopie à fluorescence en utilisant un marquage contrôlé dans le temps pour visualiser uniquement les nouvelles protéines de spectrine synthétisées. Pour le marquage conditionnel avec une résolution de neurone unique, nous avons combiné l’expression d’une recombinase induite par le choc thermique avec un système GFP divisé³¹.

Si l’objectif de recherche vise à comprendre le transport des organites, l’expression d’un domaine protéique associé à l’organite peut fournir une alternative à l’expression ectopique de la protéine pleine longueur.

Étapes critiques du protocole
Une préparation minutieuse pour optimiser la visualisation de la protéine en fonction des niveaux d’expression attendus ainsi que pour choisir la stratégie de marquage optimale est particulièrement critique pour la visualisation réussie des protéines endogènes marquées. Les niveaux d’expression de la plupart des protéines dans de nombreux neurones peuvent être estimés sur la base de l’ensemble de données transcriptomiques de Cengen¹³. La faible intensité du signal attendue des événements de transport pour les protéines faiblement exprimées ou cytoplasmiques peut être améliorée en fixant plusieurs copies du fluorophore. Notez toutefois qu’avec toute expérience de marquage, il faut veiller à ne pas perturber la fonction de la protéine marquée. Dans le cas où il existe un phénotype connu pour le mutant correspondant, il est important de vérifier que le marquage ne génère pas ce phénotype. Dans les cas où il n’y a pas de phénotype connu, d’autres approches sont nécessaires, qui varieraient au cas par cas.

L’état de santé de l’animal est une étape critique de l’imagerie des événements de transport axonal. Les animaux doivent être traités avec la plus grande douceur possible pour la préparation de l’image ainsi que pendant l’imagerie (p. ex., utilisation d’un cure-cheveux au lieu d’un fil métallique pour transférer les animaux paralysés, réduction du temps d’incubation dans l’agent paralysant, réduction du temps d’imagerie pour éviter la phototoxicité).

Modifications et dépannage
Bien que nous ayons l’intention d’optimiser la visualisation du transport axonal des protéines endogènes, les stratégies d’optimisation des paramètres d’acquisition sont également applicables aux protéines exprimées ectopiques. Surtout si les niveaux d’expression endogènes sont trop faibles pour visualiser les événements de transport, l’expression ectopique de la protéine peut fournir une alternative.

Dans le cas où aucun événement de transport ne peut être enregistré malgré une forte intensité de signal de la protéine endogène marquée, les animaux pourraient être dans un état malsain. Ce problème peut être résolu en préparant les animaux à la microscopie selon des procédures de préparation plus douces (par exemple, réduire le temps d’incubation de l’agent paralysant). Alternativement, les événements de transport peuvent être rares, et un enregistrement vidéo de 3 minutes peut ne pas être suffisant pour capturer les événements. La capture d’événements de transport rares peut être optimisée en augmentant la durée de l’enregistrement vidéo, en augmentant le nombre d’animaux imagés ou en imageant les animaux à un stade de développement différent auquel les événements de transport pourraient être plus fréquents.

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Plaques de recouvrement (22 mm x 22 mm, No1) ; Verre de protection Gold Seal	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope : Microscope inversé Nikon Ti2, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Appareil photo Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS, Objectif à immersion dans l’huile Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA, Scanner de photostimulation Nikon à 488 nm avec un filtre d’émission ET525/36		Microscope
; NIS-elements AR	Nikon		pour le Nikon Ti2  ;
Lames de microscopie simples prénettoyées	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP ::flip-on ::rab-3]) (II) ; shyIs43(glr-4p ::FLP-NLSx2 ; odr-1p ::RFP) (II)	Park et al. (DOI : 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161  ;	Sera déposé à la CGC (https://cgc.umn.edu/)