Isolement de cellules gliales gliales rétiniennes primaires de souris

Résumé

Ce manuscrit décrit un protocole détaillé pour isoler les cellules gliales rétiniennes de Müller des yeux de souris. Le protocole commence par l’énucléation et la dissection des yeux de souris, suivies de l’isolement, de l’ensemencement et de la culture des cellules de Müller.

Résumé

La principale cellule de soutien de la rétine est la cellule gliale de Müller. Ils couvrent toute la surface de la rétine et se trouvent à proximité des vaisseaux sanguins de la rétine et des neurones rétiniens. En raison de leur croissance, les cellules de Müller effectuent plusieurs tâches cruciales dans une rétine saine, notamment l’absorption et le recyclage des neurotransmetteurs, des composés de l’acide rétinoïque et des ions (comme le potassium K+). En plus de réguler le flux sanguin et de maintenir la barrière hémato-rétinienne, ils régulent également le métabolisme et l’apport de nutriments à la rétine. Une procédure établie pour isoler les cellules primaires de Müller de souris est présentée dans ce manuscrit. Pour mieux comprendre les processus moléculaires sous-jacents impliqués dans les différents modèles murins de troubles oculaires, l’isolement cellulaire de Müller est une excellente approche. Ce manuscrit décrit une procédure détaillée pour l’isolement des cellules de Müller chez la souris. De l’énucléation à l’ensemencement, l’ensemble du processus dure environ quelques heures. Pendant 5 à 7 jours après l’ensemencement, le substrat ne doit pas être changé afin de permettre aux cellules isolées de se développer sans entrave. La caractérisation cellulaire à l’aide de la morphologie et de marqueurs immunofluorescents distincts vient ensuite dans le processus. Le nombre maximum de passages pour les cellules est de 3 à 4 fois.

Introduction

Les cellules de Müller (MC) sont les cellules gliales principales et les plus abondantes présentes dans le tissu rétinien. Ils sont les acteurs clés de l’intégrité structurelle et des fonctions métaboliques au sein de la rétine¹. La structure stratégique des MC est répartie sur toute l’épaisseur de la rétine, fournissant ainsi un soutien à la rétine. En plus de leurs propriétés d’échafaudage, ils ont des fonctions métaboliques pour les neurones rétiniens, leur fournissant des substrats énergétiques, notamment le glucose et le lactate. Ces fonctions sont cruciales pour maintenir une fonction neuronale saine. Il a été rapporté que les MC altérés ....

Protocole

Toutes les expériences sur des animaux étaient conformes à la déclaration de l’ARVO pour l’utilisation d’animaux dans la recherche ophtalmique et visuelle et ont été réalisées conformément à notre protocole sur les animaux approuvé par le comité de l’Institute for Animal Care and Use (IACUC) et aux politiques de l’Université d’Oakland (numéro de protocole 2022-1160)

1. Préparation du milieu et de la solution

1. Préparez la solution oculaire à cellules de Müller en complétant le milieu Dulbecco Modified Eagle Medium (DMEM, détails dans le tableau des matériaux) avec de la pénicilline/streptomycine à la dilution de 1:1....

Résultats

Validation de la spécificité, de la pureté et de la fonction barrière des cellules de Müller isolées
Pour confirmer la viabilité, la morphologie et les qualités distinctives des cellules de Müller isolées, les cellules ont été examinées au microscope optique. Des images P0 et P1 ont été enregistrées (Figure 1A). Pour vérifier la contamination des cellules de Müller isolées par des cellules EPR et confirmer leur pureté, une coloration par immunofluorescence (FI) a été réal.......

Discussion

L’isolement de l’épithélium pigmenté rétinien primaire (EPR) chez la souris a déjà été documenté par notre laboratoire. Ce manuscrit décrit un protocole de démonstration détaillé pour l’isolement des cellules primaires de Müller. Cette procédure implique l’énucléation, le traitement, la dissection, la collecte, l’ensemencement, la culture et la caractérisation de cellules de Müller isolées dans des yeux de souris. Il est basé sur un protocole précédemment couronné de succès trouvé dans des publications antérieures et not.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Bécher : 100mL	KIMAX	14000
Collagenase IV  ;	Worthington  ;
Pipettes de transfert graduées jetables :3,2 mL		13-711-20
DMEM (1X)  ;	Thermo Scientific	11885084	Media pour développer Mü ; cellules LLER°
Sérum fœtal bovin (FBS)	gibco	26140079	Pour milieu de culture cellulaire Muller complet
Glutamine synthase	Signalisation cellulaire	80636
Heracell VISO 160i Incubateur CO2	Thermo Scientific	50144906
Kimwipes	Kimberly-Clark	34155
Seringue Luer-Lok avec aiguille attachée 21 G x 1 1/2 po, stérile, à usage unique, 3 mL	B-D
Micro tube à centrifuger : 2 mL	Grainger	11L819
Stylo Strep gibco		15140-122	Pour Mü complet ; Milieu de culture cellulaire ller
Phosphate Buffer salin (PBS)	Thermo Scientific	J62851.
épiler à action positive AP, style 5/45	Dumont	72703-DZ
Ciseaux Iris Standard Droit 11,5cm	GARANA INDUSTRIES	2595
Centrifugeuse Sorvall St8 ThermoScientific		75007200
Stemi 305 Microscope	Zeiss	n/a
Lame chirurgicale, #11, Acier inoxydable	Bard-Parker	371211
Plat de culture en suspension 60 mm x 15 mm Style	Corning	430589
Plat de culture tissulaire : 100 x 20 mm style	Corning	353003
Tornado Tubes : 15 ml	Midsci	C15B
Tubes Tornado : 50 ml	Midsci	C50R
5MS, 8,2 cm, droite, 0,09 x 0,05 mm Pointes	Dumont	501764
Pince à épiler Positive Action Style 5, Biologique, Dumostar, Finition polie, 110 mm OAL	Microscopie électronique Sciences Dumont	50-241-57
Sous-coussin, Modéré : 23 » x 36"	McKesson	4033
Vannas Ciseaux à ressort - 2.5mm Tranchant	FST	15000-08
Vimentin  ;	invitrogen	MA5-11883
Zeiss AxioImager Z2	Zeiss	n/a
Zeiss Zen Blue 2.6	Zeiss	n/a

LS004188 stériles 309577Pince à Pince à épiler