Évaluation préalable à haut débit de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’aide d’un colorant de fluorescence à base de dihydroéthidium (DHE)

Résumé

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires en utilisant le dihydroéthidium (DHE) comme sonde de colorant de fluorescence en utilisant une approche de criblage à haut débit. Le protocole décrit les méthodes d’évaluation quantitative des espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires dans les trois lignées cellulaires différentes de carcinome hépatocellulaire.

Résumé

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle clé dans la régulation du métabolisme cellulaire dans les processus physiologiques et pathologiques. La production physiologique de ROS joue un rôle central dans la modulation spatiale et temporelle des fonctions cellulaires normales telles que la prolifération, la signalisation, l’apoptose et la sénescence. En revanche, la surproduction chronique de ROS est responsable d’un large éventail de maladies, telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et le diabète, entre autres. La quantification des niveaux de ROS de manière précise et reproductible est donc essentielle pour comprendre la fonctionnalité cellulaire normale. Les méthodes basées sur l’imagerie de fluorescence pour caractériser les espèces de ROS intracellulaires sont une approche courante. De nombreux protocoles ROS d’imagerie dans la littérature utilisent un colorant au diacétate de 2'-7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA). Cependant, ce colorant souffre de limitations importantes dans son utilisation et son interprétabilité. Le protocole actuel démontre l’utilisation d’une sonde fluorescente au dihydroéthidium (DHE) comme méthode alternative pour quantifier la production totale de ROS dans un environnement à haut débit. La plate-forme d’imagerie à haut débit, CX7 Cellomics, a été utilisée pour mesurer et quantifier la production de ROS. Cette étude a été menée sur trois lignées cellulaires de cancer hépatocellulaire - HepG2, JHH4 et HUH-7. Ce protocole fournit une description détaillée des différentes procédures impliquées dans l’évaluation des ROS dans les cellules, y compris la préparation de la solution de DHE, l’incubation des cellules avec une solution de DHE et la mesure de l’intensité de la DHE nécessaire pour caractériser la production de ROS. Ce protocole démontre que le colorant fluorescent DHE est un choix robuste et reproductible pour caractériser la production de ROS intracellulaires à haut débit. Les approches à haut débit pour mesurer la production de ROS sont susceptibles d’être utiles dans diverses études, telles que la toxicologie, le dépistage de médicaments et la biologie du cancer.

Introduction

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont un groupe de radicaux chimiques naturels, hautement réactifs et instables dans le temps, formés dans le cadre du métabolisme cellulaire normal dans les cellules. Les ROS jouent un rôle clé et essentiel dans la modulation des processus physiologiques et biochimiques normaux qui se produisent dans les cellules ^1,2. La principale source de production de ROS dans les cellules provient de la chaîne de transport d’électrons mitochondriale (CTE) dans le cadre du cycle bioénergétique normal. Les réactions enzymatiques telles que les NADPH oxydases cellulaires dans les cell....

Protocole

1. Culture cellulaire

1. Ensemencer les cellules d’essai (cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2, HUH7 et JHH4) dans une plaque de 96 puits à une densité d’ensemencement de 10 000 cellules/puits dans un volume d’ensemencement final de 200 μL par puits.
   1. Avant de cultiver les cellules HepG2, enduire les 96 puits de plaques de collagène de type IV (50 μg/mL) pendant 2 h à température ambiante (RT). Pour éviter la solidification du collagène stock, placez la solution mère dans de la glace et par la suite, lancez le processus de dilution à la concentration souhaitée.
   2. Après une période d’incubation de 2 heures, aspirez l’excès....

Résultats

Le dihydroéthidium (DHE) est un colorant de fluorescence sensible aux superoxydes qui fournit des informations spécifiques sur les états des ROS intracellulaires. Le colorant DHE émet intrinsèquement une fluorescence bleue dans le cytoplasme. Cependant, lors de l’interaction avec les radicaux superoxydes, il se transforme en 2-hydroxyéthidium, qui émet une fluorescence dans les longueurs d’onde rouges (>550 nm) (Figure 1). Le colorant DHE est facilement transporté dans les cellules et le .......

Discussion

Dans cette étude, un protocole permettant d’évaluer la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires induites par les superoxydes à l’aide d’un colorant de fluorescence dihydroéthidium (DHE) a été établi sur un système de criblage à haut contenu. La majorité des protocoles actuels disponibles dans la littérature utilisent le DCFH-DA comme sonde d’imagerie de fluorescence pour quantifier les espèces de ROS. Cependant, de nombreuses études ont montré que le DCFH-DA n’est pas une sonde idéale pour la me.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Tubes à centrifuger de 1,5 ml  ;	VWR  ;	20170-038  ;
Plaque à 96 puits  ;	Costar de Corning  ;	07-200-90  ;
Cellomics Cx7	ThermoFisher  ;
Collagène  ;	Biomatrice avancée  ;   ;	5056  ;
DHE (Dihydroethidium)  ;	ThermoFisher  ;	D1168  ;
DMEM  ;	Sigma  ;   ;	6046  ;
FBS  ;	VWR  ;	Référence 97068-085  ;
GraphPad Prism	GraphPad	Version 6.0
Lignée cellulaire HepG2	ATCC
Hoechst  ;	ThermoFisher  ;	33342  ;
Lignée cellulaire HUH7	ATCC
Peroxyde d’hydrogène  ;	Sigma  ;	88597  ;
Lignée cellulaire JHH4	ATCC
Menadione  ;	Sigma  ;	M5625  ;

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