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Évaluation préalable à haut débit de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’aide d’un colorant de fluorescence à base de dihydroéthidium (DHE)

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DOI :

10.3791/66238

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19 janvier 2024

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1Department of Pathology, University of New Mexico, 2Department of Chemical and Biological Engineering, University of New Mexico

Dans cet article

Résumé

Ce protocole décrit une nouvelle méthode pour quantifier les espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires en utilisant le dihydroéthidium (DHE) comme sonde de colorant de fluorescence en utilisant une approche de criblage à haut débit. Le protocole décrit les méthodes d’évaluation quantitative des espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires dans les trois lignées cellulaires différentes de carcinome hépatocellulaire.

Résumé

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) jouent un rôle clé dans la régulation du métabolisme cellulaire dans les processus physiologiques et pathologiques. La production physiologique de ROS joue un rôle central dans la modulation spatiale et temporelle des fonctions cellulaires normales telles que la prolifération, la signalisation, l’apoptose et la sénescence. En revanche, la surproduction chronique de ROS est responsable d’un large éventail de maladies, telles que le cancer, les maladies cardiovasculaires et le diabète, entre autres. La quantification des niveaux de ROS de manière précise et reproductible est donc essentielle pour comprendre la fonctionnalité cellulaire normale. Les méthodes basées sur l’imagerie de fluorescence pour caractériser les espèces de ROS intracellulaires sont une approche courante. De nombreux protocoles ROS d’imagerie dans la littérature utilisent un colorant au diacétate de 2'-7'-dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA). Cependant, ce colorant souffre de limitations importantes dans son utilisation et son interprétabilité. Le protocole actuel démontre l’utilisation d’une sonde fluorescente au dihydroéthidium (DHE) comme méthode alternative pour quantifier la production totale de ROS dans un environnement à haut débit. La plate-forme d’imagerie à haut débit, CX7 Cellomics, a été utilisée pour mesurer et quantifier la production de ROS. Cette étude a été menée sur trois lignées cellulaires de cancer hépatocellulaire - HepG2, JHH4 et HUH-7. Ce protocole fournit une description détaillée des différentes procédures impliquées dans l’évaluation des ROS dans les cellules, y compris la préparation de la solution de DHE, l’incubation des cellules avec une solution de DHE et la mesure de l’intensité de la DHE nécessaire pour caractériser la production de ROS. Ce protocole démontre que le colorant fluorescent DHE est un choix robuste et reproductible pour caractériser la production de ROS intracellulaires à haut débit. Les approches à haut débit pour mesurer la production de ROS sont susceptibles d’être utiles dans diverses études, telles que la toxicologie, le dépistage de médicaments et la biologie du cancer.

Introduction

Les espèces réactives de l’oxygène (ROS) sont un groupe de radicaux chimiques naturels, hautement réactifs et instables dans le temps, formés dans le cadre du métabolisme cellulaire normal dans les cellules. Les ROS jouent un rôle clé et essentiel dans la modulation des processus physiologiques et biochimiques normaux qui se produisent dans les cellules 1,2. La principale source de production de ROS dans les cellules provient de la chaîne de transport d’électrons mitochondriale (CTE) dans le cadre du cycle bioénergétique normal. Les réactions enzymatiques telles que les NADPH oxydases cellulaires dans les cellules constituent d’autres sources importantes de production de ROS. Le métabolisme des molécules alimentaires (par exemple, le glucose) se produit via la voie de phosphorylation oxydative dans la matrice mitochondriale. Un niveau de base de production de ROS est essentiel pour réguler les processus physiologiques normaux de signalisation cellulaire. De nombreuses molécules protéiques clés qui font partie des voies de signalisation métabolique du glucose (par exemple, Akt et PTEN) sont connues pour répondre aux niveaux de ROS intracellulaires. De plus, les ROS sont produits par diverses enzymes intracellulaires telles que la xanthine oxydase, l’oxyde nitrique synthase et les constituants peroxysomaux dans le cadre des voies enzymatiques cellulaires 1,2. Contrairement aux sources naturelles de ROS, certains facteurs environnementaux, tels que les xénobiotiques, les agents infectieux, les rayons UV, la pollution, le tabagisme et les radiations, entraînent également une production excessive de ROS, qui sont un facteur clé du stress oxydatif intracellulaire 1,3. Un stress oxydatif cellulaire élevé peut endommager les biomolécules natives à l’intérieur d’une cellule, telles que les lipides, les protéines et l’ADN, provoquant diverses maladies telles que le cancer, le diabète, les maladies cardiovasculaires, l’inflammation chronique et les troubles neurodégénératifs 1,3,4. Par conséquent, des mesures précises des ROS sont essentielles pour comprendre les mécanismes cellulaires impliqués dans la physiopathologie des maladies induites par le stress oxydatif.

En raison des courtes échelles de temps de production et d’élimination des ROS à l’intérieur des cellules, les mesures quantitatives de divers radicaux ROS restent un défi. Des méthodes telles que la résonance paramagnétique électronique (EPR)5, la chromatographie liquide à haute pression (HPLC) et l’imagerie par sonde de fluorescence sont utilisées pour mesurer les différents ROS cellulaires6. Bien que des méthodes telles que l’EPR et la HPLC donnent des estimations quantitativement précises, ces méthodes impliquent la destruction de la morphologie spatiale cellulaire et se présentent généralement sous la forme de mesures globales et globales d’un échantillon. En revanche, les méthodes basées sur l’imagerie telles que les méthodes basées sur des sondes de fluorescence conservent la morphologie cellulaire et le contexte spatial de la génération de ROS. Cependant, la spécificité de diverses sondes de fluorescence pour différents types de radicaux ROS n’a pas été bien établie 7,8. Plusieurs sondes fluorescentes telles que le dihydroéthidium (DHE), le diacétate de dichlorodihydrofluorescéine (DCFH-DA), la dihydrorhodamine (DHR), le diméthylanthracène (DMA), la 2,7 dichlorodihydroflurescéine (DCFH), le 1,3-diphénylisobenzofurane (DPBF) et MitoSox sont disponibles dans le commerce pour la détection des ROS. Au cours des dernières décennies, DHE, MitoSox et DCFH-DA sont les colorants fluorescents couramment utilisés pour mesurer les ROS dans les cellules et les tissus 8,9. DCFH-DA est un colorant largement utilisé pour détecter le H2O2 intracellulaire et le stress oxydatif. Malgré la popularité du DCFH-DA, de nombreuses études antérieures ont montré qu’il ne peut pas être utilisé de manière fiable pour mesurer les niveaux intracellulaires de H2O2 et d’autres niveaux de ROS 8,9,10,11,12,13,14.

En revanche, la sonde fluorescente dihydroéthidium (DHE) montre une réponse spécifique au radical superoxyde intracellulaire (O2-). Bien que le radical superoxyde soit l’une des nombreuses espèces de ROS observées dans les cellules, c’est un radical important impliqué dans la réduction des métaux de transition, la conversion en peroxynitrate et la formation d’hydroperoxydes, entre autres effets intracellulaires. La DHE est rapidement absorbée par les cellules et a une émission de fluorescence dans la gamme de longueurs d’onde rouges15. En réagissant spécifiquement avec le radical superoxyde, la DHE forme un produit fluorescent rouge, le 2-hydroxy éthidium (2-OH-E+). Ainsi, la DHE peut être considérée comme une sonde spécifique pour la détection des superoxydes. Cependant, la DHE peut également subir une oxydation non spécifique avec ONOO- ou OH., H2O2 et cytochrome c pour former un deuxième produit de fluorescence, l’éthidium E+, qui peut interférer avec les niveaux mesurés de 2-OH-E+. Cependant, ces produits 2-OH E+ et E+, en combinaison, représentent une partie importante des espèces de ROS cellulaires totales observées à l’intérieur d’une cellule lorsqu’elles sont colorées à la DHE. E+ s’intercale dans l’ADN, améliorant considérablement sa fluorescence 8,9,10,11,13,14,15,16. Étant donné que les spectres de fluorescence de l’éthidium et du 2-hydroxy éthidium ne diffèrent que légèrement, la majorité des niveaux de ROS observés dans une cellule secondaire à la production de superoxyde peuvent être détectés et mesurés à l’aide de produits de fluorescence DHE. Ces espèces de ROS sont identifiées à l’aide d’une excitation de longueur d’onde de 480 nm et d’une émission de longueur d’onde de 610 nm 15,16,17.

En plus de choisir une sonde de détection de ROS fluorescente spécifique, il est important de choisir une méthode de détection sensible pour mesurer les ROS intracellulaires. Une évaluation précise des niveaux de ROS intracellulaires est donc essentielle pour identifier les états d’équilibre redox perturbés qui se produisent dans les cellules malades ou les cellules qui ont été exposées à divers facteurs de stress environnementaux tels que les radiations, les composés toxicologiques et les agents génotoxiques18. Étant donné que les ROS sont un phénomène courant dans les cellules qui est responsable de la régulation d’une variété d’activités de signalisation cellulaire, des méthodes robustes de détection des ROS sont essentielles. Pour permettre une telle évaluation à haut débit de la production de ROS dans les cellules, ce protocole utilise une plateforme de criblage à haut contenu (HCS) pour mesurer les espèces de ROS. Le protocole actuel permet l’analyse à haut débit de la production intracellulaire de ROS, ce qui est d’une importance cruciale dans de nombreuses études toxicologiques19. Ce protocole vise à fournir une solution simple et polyvalente pour détecter et mesurer les ROS intracellulaires dans les cellules de carcinome hépatocellulaire adhérent. Les réactifs chimiques deH2,O2 et de ménadione sont utilisés comme puissants stimulateurs de ROS pour mesurer les niveaux relatifs de production de ROS dans un environnement contrôlé et à haut débit. Ce protocole peut être affiné pour mesurer la production de ROS dans les cellules adhérentes et non adhérentes dans des conditions appropriées, si nécessaire.

Protocole

1. Culture cellulaire

  1. Ensemencer les cellules d’essai (cellules de carcinome hépatocellulaire HepG2, HUH7 et JHH4) dans une plaque de 96 puits à une densité d’ensemencement de 10 000 cellules/puits dans un volume d’ensemencement final de 200 μL par puits.
    1. Avant de cultiver les cellules HepG2, enduire les 96 puits de plaques de collagène de type IV (50 μg/mL) pendant 2 h à température ambiante (RT). Pour éviter la solidification du collagène stock, placez la solution mère dans de la glace et par la suite, lancez le processus de dilution à la concentration souhaitée.
    2. Après une période d’incubation de 2 heures, aspirez l’excès de collagène et lavez les puits trois fois avec le 1x PBS.
  2. Cultivez les cellules dans le milieu Eagle modifié de Dulbecco (DMEM) pendant la nuit à 37 °C et à une concentration de 5 % de CO2 dans un incubateur humidifié.
  3. Le lendemain, ou lorsque la confluence de 80 % à 90 % est atteinte, selon la première éventualité, traiter les cellules avec du H2O2 (non traité, 250 μM, 500 μM, 750 μM et 1000 μM) et de la ménadione (non traitée, 25 μM, 50 μM, 75 μM, 100 μM), respectivement pendant 30 min pour induire le stress oxydatif représentatif.
  4. Vous pouvez également choisir de tester les cellules avec la substance de test de votre choix, capable d’induire un stress oxydatif dans les cellules.

2. Préparation de solution mère et diluée pour la coloration DHE des cellules

  1. Préparez une solution mère de DHE (5 mg/mL ou 15,9 mM) en dissolvant 5 mg de DHE dans 1 mL de DMSO.
  2. Diluer la solution mère de DHE avec de l’eau autoclavée doublement distillée jusqu’à une concentration finale de 100 μM.
  3. Pour éviter le processus de congélation et de décongélation du colorant (qui peut endommager les propriétés de fluorescence au fil du temps), préparer plusieurs aliquotes dans des tubes à centrifuger de 1,5 mL avec une concentration de 100 μM et les conserver à -20 °C.
  4. Pour obtenir une concentration de travail finale de 10 μM, utilisez une aliquote de la concentration de DHE de 100 μM et diluez-la avec un média DMEM préchauffé.
    REMARQUE : La solution de travail doit être préparée fraîche le jour de l’expérience.
  5. Vortex la solution de colorant de fluorescence de travail pendant 5 à 10 s pour assurer un bon mélange du colorant.

3. Processus de coloration DHE

  1. Retirez le milieu contenant le médicament ou la substance d’essai de chaque puits et lavez-le doucement une fois avec 1x PBS ou DMEM.
    REMARQUE : Lors de l’exécution des étapes d’ajout ou de lavage de l’expérience, il est crucial d’éviter tout contact direct entre les cellules et le pipeteur. Cela peut être réalisé en pipetant doucement le PBS le long des côtés des puits pour minimiser tout dommage mécanique potentiel aux cellules. S’assurer que la pipette ne touche pas directement les cellules aidera à maintenir l’intégrité et la viabilité des cellules pendant toute la durée de l’expérience.
  2. Ajouter 100 μL de milieu DMEM contenant 10 μM de DHE (solution de travail) dans chaque puits et incuber à 37 °C pendant 30 min.
  3. Après une période d’incubation de 30 minutes, retirez le milieu contenant de la DHE et lavez chaque puits doucement trois fois avec la solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Cela peut être effectué avec une pipette multicanal pour assurer un délai d’exécution rapide.
  4. Ajouter 200 μL de 1x PBS dans chaque puits avec le colorant de coloration nucléaire Hoechst 33342 pendant 10 min à RT.
  5. Retirez la solution de coloration nucléaire Hoechst 33342 du puits et ajoutez 200 μL de 1x PBS dans chaque puits.
    REMARQUE : Pour obtenir des cellules fixes, suivez le même protocole que pour les cellules vivantes, avec une étape supplémentaire consistant à ajouter 4 % de PFA pendant 5 minutes après le traitement et la coloration à la DHE. Retirez la solution PFA et lavez les cellules avec le 1x PBS. Ensuite, incubez les cellules avec le colorant nucléaire pendant 10 min.
  6. Déplacez la plaque vers la plate-forme de criblage à haut contenu, la microscopie à fluorescence ou le lecteur de plaques pour l’acquisition d’images le plus rapidement possible.

4. Acquisition d’images et mesure d’intensité

  1. Chargement des plaques
    1. Ouvrez le logiciel de criblage à haut contenu (HCS) Cellomics CX7 pour l’acquisition de données.
    2. Calibrez soigneusement la plate-forme d’imagerie selon les spécifications du fabricant à l’avance avec la plaque spécifique à 96 puits de votre choix pour éviter toute image floue ou floue dans les données.
      REMARQUE : Les plaques multipuits de différents fournisseurs peuvent avoir des propriétés de matériau différentes et peuvent influencer la qualité des images finales obtenues.
    3. Une fois étalonnés, enregistrez les paramètres du système spécifiques à la marque de la plaque dans la base de données de l’instrument et réutilisez-les pour de futures acquisitions de données.
    4. Placez soigneusement la plaque contenant les échantillons préparés sur la platine chauffée du système d’imagerie HCS. Assurez-vous que la plaque est bien positionnée et dans la bonne orientation pour l’imagerie sur le support de microplaque (c’est-à-dire localisez l’étiquette marquée A1 sur la platine du lecteur, puis faites pivoter la microplaque de manière à ce que l’emplacement du puits A1 corresponde au coin avec l’autocollant).
    5. Appuyez doucement sur la microplaque pour vous assurer qu’elle repose à plat contre la platine. Un nivellement inégal de la plaque dans le système HCS peut entraîner des erreurs d’acquisition d’images.
    6. Une fois la plaque en place, maintenez la touche Ctrl enfoncée, puis cliquez sur Ctrl-OK dans la boîte de dialogue Charger/Décharger la plaque du logiciel.
  2. Sélection des paramètres d’imagerie
    1. Dans le système d’imagerie HCS, ouvrez le mode d’activation de la cible dans l’interface des bio-applications Cellomics et créez un nouveau protocole à l’aide du protocole de configuration à deux canaux compatible avec (a) la coloration nucléaire et (b) l’acquisition de données de sonde de fluorescence DHE. Dans le protocole actuel, les filtres 386_BGSRS_BGSRS, 480_BGS_RS et 386_BGS_RS ont été utilisés pour (a) la coloration nucléaire Hoechst 33342, (b) la production totale de ROS et (c) la détection des radicaux superoxydes, respectivement. Le choix de ces filtres a été motivé par le chevauchement spécifique des propriétés d’émission de chaque colorant (DAPI et DHE) utilisé dans le cadre de ce protocole.
      REMARQUE : La convention de dénomination des filtres, par exemple 386-23_BGRFRN_BGRFRN, fait référence à l’excitation de l’échantillon avec une lumière de 386 nm avec une largeur de bande de 23 nm, suivie d’un filtre dichroïque qui laisse passer la lumière bleue (B), verte (G), rouge (R), rouge lointaine (FR) et proche infrarouge (N) à des gammes de longueurs d’onde spécifiques et le 386_BGS_RS fait référence à un filtre d’émission qui laisse passer la lumière de longueur d’onde d’émission BGS et RS après le dichroïque.
    2. Spécifiez les objectifs du processus d’acquisition d’images dans l’interface du protocole logiciel, tels que le grossissement 10x ou 20x, selon les besoins.
    3. Choisissez le grossissement d’objectif approprié en fonction du niveau de détail d’imagerie souhaité et des résolutions nécessaires à l’expérience. Cependant, la résolution de chaque objectif est fixe. Des détails de résolution plus élevés nécessiteront de changer l’objectif sur la plate-forme. Dans le protocole actuel, un objectif 20x, 0,45 NA est utilisé, qui fait partie de la plate-forme de criblage à haut contenu utilisée dans ce protocole.
      REMARQUE : L’objectif 20x représente un bon compromis entre les détails de la résolution d’image et la vitesse d’acquisition nécessaire pour capturer les changements ROS au fil du temps. Des objectifs à grossissement plus élevé peuvent être choisis (par exemple, 40X), mais cela entraînera des temps d’acquisition plus longs.
    4. Spécifiez les paramètres d’exposition de la caméra d’acquisition d’images, tels que le temps d’exposition, le binning de la caméra et l’intervalle z-stack, en fonction des exigences spécifiques du protocole.
      REMARQUE : Le temps d’exposition (souvent en millisecondes) varie en fonction de la force du signal et de la sensibilité des fluorophores spécifiques utilisés. Cela peut également différer légèrement d’une expérience à l’autre en fonction de la concentration de colorant et de la qualité de la coloration. Dans le protocole actuel, les paramètres d’acquisition sont fixés comme suit : % cible - 35 %, mode d’acquisition d’image - 1104 x 1104 (avec binning 2x2) et objectif 20x, 0,45 NA. Ces paramètres peuvent être réglés en fonction des conditions expérimentales spécifiques.
  3. Paramètres de configuration de l’imagerie
    REMARQUE : Une fois les paramètres d’imagerie définis, le processus de collecte d’images peut être lancé à l’aide de l’interface logicielle.
    1. Paramètres de collecte d’images
      1. Identifier l’objet d’intérêt principal (le noyau des cellules) à l’aide de différents algorithmes disponibles dans l’instrument (optique - isodonnées, fixe et triangle).
        NOTA : La méthode isodonnée pour l’identification et le marquage de l’objet primaire est utilisée dans le présent protocole.
      2. Segmentez l’objet (le cas échéant) par forme ou par paramètre d’intensité.
      3. Validez l’objet principal en fonction des paramètres de taille, de forme et d’intensité souhaités propres à chaque type de cellule.
      4. Ensuite, définissez la « région d’intérêt » (ROI) autour de cet objet principal.
        REMARQUE : Le retour sur investissement est un paramètre clé de l’acquisition de données qui définit l’emplacement où l’intensité du colorant de fluorescence est identifiée comme étant cohérente et reproductible pour tous les types de cellules. Le retour sur investissement définit les paramètres clés (tels que l’intensité du colorant), qui sont mesurés pour chaque objet de suivi primaire (c’est-à-dire une cellule) dans différents canaux de l’instrument. Le retour sur investissement peut être défini sous la forme d’un cercle ou d’un anneau autour du noyau de chaque cellule. Le logiciel HCS obtient automatiquement l’intensité du marqueur de colorant de fluorescence DHE dans le canal 2 dans la limite du ROI pour chaque cellule segmentée et analysée de manière automatisée.
      5. Placez un cercle de 20 μm autour de l’objet principal (noyau). La distance de 20 μm a été choisie dans cette étude en fonction de la taille approximative des différentes lignées cellulaires utilisées dans ce protocole (HepG2, JHH-4 et HUH-7). Le retour sur investissement de l’anneau de 20 μm autour des cellules a obtenu l’intensité de fluorescence de manière cohérente et reproductible.
        REMARQUE : Le paramètre clé dans le choix d’un retour sur investissement est la capacité à couvrir correctement la zone de la cellule ; la taille du retour sur investissement circulaire dépend de la taille de la cellule. Les cellules plus grandes peuvent nécessiter un retour sur investissement plus important et vice-versa pour un retour sur investissement plus petit. Ces paramètres doivent être déterminés à l’avance pour chaque type de cellule et de colorant de fluorescence d’intérêt.
  4. Caractérisation de la population et sélection des caractéristiques à stocker
    1. Une fois les différents paramètres d’acquisition définis dans le protocole d’imagerie HCS, mettez le système HCS en mode d’acquisition de données.
    2. Les paramètres d’acquisition d’images pour ce protocole ont été définis comme suit : une limite de balayage de 1000 cellules/puits, avec un minimum requis de 10 objets (cellules) par trame.
      REMARQUE : Le nombre de champs évalués pour chaque puits a été déterminé en fonction du nombre final de cellules atteignant le nombre de 1000. Le système HCS continue de rechercher divers endroits dans le puits jusqu’à ce qu’il obtienne la population cible de 1000 cellules/puits. La vitesse d’acquisition dépend donc de la confluence et du nombre total de cellules présentes dans chaque puits de la plaque de 96 puits. Dans le protocole actuel, l’intensité totale et moyenne du canal 2 (représentant les radicaux superoxydes et la production totale de ROS) a été collectée dans chaque puits pour des analyses ultérieures en aval.
  5. Capture, traitement et analyse d’images
    1. Après avoir ajusté et finalisé les paramètres d’acquisition d’image, lancez le processus de balayage pour chaque plaque à 96 puits.
      REMARQUE : Le système d’imagerie Cellomics CX7 permet un criblage à haut contenu et une analyse automatisée d’échantillons de divers paramètres, y compris la production de ROS dans les cellules à haut débit. En plus de la production de ROS, le système HCS est capable de fournir des informations supplémentaires précieuses sur divers paramètres tels que la morphologie cellulaire, la localisation subcellulaire et de nombreuses autres caractéristiques cellulaires d’intérêt. Une fois optimisée pour l’acquisition, la plateforme d’imagerie HCS permet une caractérisation complète, qualitative et quantitative des paramètres cellulaires de manière robuste.
    2. Une fois le processus de numérisation terminé, lancez le logiciel d’analyse de vue et exportez les différents paramètres de données quantitatives dans un format .csv pour une analyse supplémentaire.
    3. À l’aide d’un logiciel tiers, copiez et collez les différentes valeurs quantitatives d’intérêt pour des analyses supplémentaires en aval.
      REMARQUE : Dans le protocole actuel, le logiciel GraphPad Prism a été utilisé pour analyser les valeurs d’intensité de la DHE en réponse au stress oxydatif induit par les expositions à H2O2 et à la ménadione.
  6. Analyse des données et des statistiques
    1. Calculer l’intensité moyenne moyenne du canal 2 (représentant les valeurs ROS totales et les radicaux superoxydes).
      REMARQUE : Toutes les expériences pour calculer les valeurs d’intensité ont été répétées trois fois avec 6 répétitions par condition à chaque niveau de dosage.
    2. Effectuez une ANOVA unifacteur ou un test t pour mesurer les différences dans les valeurs d’intensité entre diverses conditions de test.

Résultats

Le dihydroéthidium (DHE) est un colorant de fluorescence sensible aux superoxydes qui fournit des informations spécifiques sur les états des ROS intracellulaires. Le colorant DHE émet intrinsèquement une fluorescence bleue dans le cytoplasme. Cependant, lors de l’interaction avec les radicaux superoxydes, il se transforme en 2-hydroxyéthidium, qui émet une fluorescence dans les longueurs d’onde rouges (>550 nm) (Figure 1). Le colorant DHE est facilement transporté dans les cellules et le noyau. La fluorescence émise peut être visualisée avec une configuration de microscopie à fluorescence couramment disponible dans de nombreux laboratoires. Dans la présente étude, l’utilité du colorant DHE sur plusieurs lignées cellulaires de carcinome hépatocellulaire - cellules HUH7, JHH4 et HepG2 en tant que sonde de génération d’espèces ROS a été testée sur une plateforme de criblage à haut contenu. Les cellules ont été traitées avec deux agents générateurs de ROS - (a) du peroxyde d’hydrogène et (b) de la ménadione pendant 30 minutes de manière dose-dépendante (voir Figure 2 et Figure 3 pour plus de détails sur le dosage) pour induire un stress oxydatif dans les cellules, suivi d’un marquage au colorant DHE dans une plaque de 96 puits. H2O2 et la ménadione ont augmenté l’intensité de la fluorescence de façon spectaculaire dans les trois lignées cellulaires de manière dose-dépendante. À l’aide des algorithmes de segmentation et de quantification d’images de la plateforme de criblage à haut débit, l’intensité de la fluorescence DHE induite par ROS a été quantifiée en 1000 cellules par puits sur six réplicats. Trois répétitions indépendantes ont été mesurées, et les résultats ont été agrégés et analysés. La coloration nucléaire Hoechst 33342 joue un rôle important dans l’identification du plan dans lequel les cellules adhérentes sont présentes dans chaque puits. De plus, la fluorescence 2-OH-E+ et E+ peut être détectée à la fois dans le noyau et le cytoplasme des cellules testées, respectivement, sur la plate-forme de criblage à haut débit (voir Figure 4).

L’exposition à H2O2 a entraîné une augmentation statistiquement significative de la fluorescence induite par les ROS dans toutes les lignées cellulaires analysées de manière dose-dépendante (voir Figure 2 ; panneau inférieur). Cependant, une telle réponse dose-dépendante n’a pas été observée dans le cas des expositions à la ménadione. Avec la ménadione, la lignée cellulaire JHH4 a montré une augmentation dose-dépendante de l’intensité de la fluorescence, tandis que dans les lignées cellulaires HepG2 et HUH7, une différence significative de l’intensité de fluorescence n’a été observée qu’aux concentrations plus élevées de ménadione (voir Figure 3 ; panneau inférieur). Ces différences dans les réponses de génération de ROS pourraient être dues aux mécanismes distincts de production de ROS deH2,O2 et de ménadione. Alors que H2O2 déclenche la formation de ROS dans les cellules de manière plus directe (par exemple, par l’action d’enzymes antioxydantes telles que les peroxydases et les catalases), on suppose que la ménadione génère des espèces de ROS de manière indirecte par le biais d’un dysfonctionnement mitochondrial induit. En raison du mécanisme indirect de production de ROS, la fluorescence de la DHE peut nécessiter plus de temps pour se manifester avec la ménadione. Ces résultats indiquent que la fluorescence de la DHE dépendante des ROS est sensible à la durée de l’exposition au stress oxydatif, à la concentration et aux types de cellules. L’optimisation du protocole expérimental pour chaque type de cellule unique est donc indispensable. Plus important encore, ce protocole démontre la faisabilité de l’utilisation du colorant DHE comme agent de détection ROS à haut débit, ce qui est utile dans des domaines tels que la toxicologie, la biologie du cancer et le criblage de médicaments.

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Figure 1 : Un schéma illustrant les voies de conversion oxydative de la molécule de fluorescence DHE en 2-hydroxyéthidium (2-OH-E+) et en éthidium (E+), respectivement. Les spectres d’émission de fluorescence de 2-OH-E+ et E+ se chevauchent à une excitation de 480 nm. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 2 : Le traitement au peroxyde d’hydrogène augmente les niveaux de ROS intracellulaires de manière dose-dépendante. Les cellules de carcinome hépatocellulaire - (A) HUH7, (B) JHH4 et (C) HepG2 ont été traitées avec H2O2 à des doses de 250 μM, 500 μM, 750 μM et 1000 μM pendant une période de 30 minutes. Les cellules ont été colorées avec un colorant DHE (10 μM) dans un milieu de culture pendant 30 minutes supplémentaires, suivies d’une coloration nucléaire Hoechst 33342. Au total, 1000 cellules ont été comptées dans chaque puits. Une augmentation linéaire et dose-dépendante de la fluorescence de la DHE est observée dans les trois lignées cellulaires (panneau du haut). Des augmentations statistiquement significatives de la fluorescence sont observées dans toutes les lignées cellulaires pour des doses de 500 μM et plus (panneau inférieur). Chaque ensemble de données est une moyenne de six répétitions dans une plaque de 96 puits obtenue à partir de trois expériences indépendantes (n = 3). Les conditions de traitement ont été comparées à des échantillons non traités à l’aide d’un test ANOVA à un facteur (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001 ; barre d’échelle d’image - 50 μm) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 3 : Le traitement par ménadione augmente les niveaux de ROS intracellulaires de manière dose-dépendante. Les cellules de carcinome hépatocellulaire - (A) HUH7, (B) JHH4 et (C) HepG2 ont été traitées avec de la ménadione à des doses de 25 μM, 50 μM, 75 μM et 100 μM pendant une période de 30 minutes. Les cellules ont été colorées avec un colorant DHE (10 μM) dans un milieu de culture pendant 30 minutes supplémentaires, suivies d’une coloration nucléaire Hoechst 33342. Au total, 1000 cellules ont été comptées dans chaque puits. Une augmentation linéaire et dose-dépendante de la fluorescence de la DHE est observée dans les trois lignées cellulaires (panneau du haut). Des augmentations statistiquement significatives de la fluorescence sont observées de manière constante pour la dose maximale (100 μM ; panneau inférieur). Une variabilité est observée pour les doses restantes de ménadione entre différentes lignées cellulaires (JHH4 > HUH7 > HepG2). Chaque ensemble de données est une moyenne de six répétitions dans une plaque de 96 puits obtenue à partir de trois expériences indépendantes (n = 3). Les conditions de traitement ont été comparées à des échantillons non traités à l’aide d’un test ANOVA à un facteur (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001 ; barre d’échelle d’image - 50 μm) Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

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Figure 4 : Fluorescence de la DHE sur cellule unique - Vue rapprochée des changements de fluorescence de la DHE observés après traitement avec (A) du peroxyde d’hydrogène et (B) de la ménadione pendant une durée de 30 min. Des changements cytoplasmiques et nucléaires de la fluorescence de la DHE sont observés dans les différentes cellules. Le masque de segmentation automatique généré par la plateforme de filtrage à haut contenu est également visible. Barre d’échelle de l’image - 10 μm. Grossissement - 20x. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Figure supplémentaire 1 : Imagerie de la fluorescence DHE induite par les superoxydes en réponse au peroxyde d’hydrogène. Les cellules de carcinome hépatocellulaire - (A) HUH7, (B) JHH4 et (C) HepG2 ont été traitées avec H2O2 à des doses de 250 μM, 500 μM, 750 μM et 1000 μM pendant une période de 30 minutes. Les cellules ont ensuite été colorées avec un colorant DHE (10 μM) dans un milieu de culture pendant 30 minutes supplémentaires. Par la suite, les cellules ont été éclairées par une LED de 386 nm et l’imagerie de fluorescence a été collectée à >560 nm. Aucune contre-coloration nucléaire n’a été effectuée pour éviter la diaphonie spectrale. Une augmentation dose-dépendante de la fluorescence de la DHE est observée à des doses > 500 μM. La fluorescence de la DHE éclairée par UV devrait être due à la majorité de la production de radicaux superoxydes. Chaque ensemble de données est une moyenne de six répétitions dans une plaque de 96 puits obtenue à partir de deux expériences indépendantes (n = 2). Les conditions de traitement ont été comparées à des échantillons non traités à l’aide d’une ANOVA à un facteur (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001 ; barre d’échelle d’image - 50 μm) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Figure supplémentaire 2 : Imagerie de la fluorescence DHE induite par la superoxyde en réponse à la ménadione - Les cellules de carcinome hépatocellulaire - (A) HUH7, (B) JHH4 et (C) HepG2 ont été traitées avec de la ménadione à des doses de 25 μM, 50 μM, 75 μM et 100 μM pendant une période de 30 minutes. Les cellules ont ensuite été colorées avec un colorant DHE (10 μM) dans un milieu de culture pendant 30 minutes supplémentaires. Comme pour le peroxyde d’hydrogène, une augmentation dose-dépendante de la fluorescence de la DHE a été observée. Chaque ensemble de données est une moyenne de six répétitions dans une plaque de 96 puits obtenue à partir de deux expériences indépendantes (n = 2). Les conditions de traitement ont été comparées à des échantillons non traités à l’aide d’une ANOVA à un facteur (**** - p < 0,0001, *** - p < 0,001 ; barre d’échelle d’image - 50 μm) Veuillez cliquer ici pour télécharger ce fichier.

Discussion

Dans cette étude, un protocole permettant d’évaluer la production d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) intracellulaires induites par les superoxydes à l’aide d’un colorant de fluorescence dihydroéthidium (DHE) a été établi sur un système de criblage à haut contenu. La majorité des protocoles actuels disponibles dans la littérature utilisent le DCFH-DA comme sonde d’imagerie de fluorescence pour quantifier les espèces de ROS. Cependant, de nombreuses études ont montré que le DCFH-DA n’est pas une sonde idéale pour la mesure des ROS intracellulaires. Diverses raisons postulées pour expliquer l’inadéquation du DCFH-DA en tant que sonde incluent - (i) le DCFH-DA ne présente pas de réaction directe avec H2O2, ce qui en fait un colorant inapproprié pour évaluer le niveau intracellulaire de H2O2. (ii) Plusieurs espèces oxydantes à un électron, telles que OH., NO2. et ONOO-, oxydent le DCFH en DCF. (iii) Les métaux de transition, le cytochrome C et la peroxydase hémique peuvent favoriser l’oxydation du DCFH en présence d’oxygène et de H2O2. (iv) Plus important encore, DCFH-DA produit le produit intermédiaire DCFH.- / DCF., qui, en présence d’oxygène, induit la production de superoxyde supplémentaire. La dismutation avec O2.- génère du H2O2 supplémentaire, ce qui peut entraîner une augmentation artificielle de l’intensité de la fluorescence et des niveaux de ROS élevés à tort. De nombreux auteurs ont jugé que l’utilisation de DCFH-DA n’était pas une sonde fluorescente fiable pour la détection deH2O2 intracellulaire et d’autres espèces de ROS 8,9,10,11,12,13,14.

Contrairement au DCFH-DA, le DHE réagit spécifiquement avec le radical superoxyde, conduisant à la génération d’un produit fluorescent, le 2-hydroxyéthidium (2-OH E+). Les espèces ROS non superoxydes peuvent également réagir avec la DHE pour générer un deuxième produit fluorescent, l’éthidium (E+). Bien que les spectres de fluorescence de 2-OH-E+ et E+ soient relativement similaires, ces deux molécules représentent les produits finaux des interactions spécifiques entre les espèces ROS intracellulaires et la DHE et sont responsables de l’intensité totale de fluorescence observée dans les cellules en raison du stress oxydatif. Certaines études ont indiqué que l’excitation sélective à des longueurs d’onde UV plus courtes (<400 nm) pourrait être plus spécifique pour l’excitation de l’éthidium 2-OH (par opposition à E+) et, par conséquent, pour la production de radicaux superoxydes 7,12,14. Cela a été évalué en excitant les cellules avec une lumière LED de 386 nm uniquement. Par rapport à l’excitation de longueur d’onde de 480 nm, une intensité d’émission réduite a été observée à une longueur d’onde de 560 nm (voir la figure supplémentaire 1 et la figure supplémentaire 2). Cependant, on ne peut pas être certain que cela est uniquement dû à la fluorescence de l’éthidium 2-OH et représente une lacune potentielle de l’approche actuelle. D’autres études ont montré que l’excitation UV (par exemple, 386 nm) peut également entraîner une émission simultanée de fluorescence d’éthidium, bien qu’à des niveaux inférieurs à ceux de l’éthidium2-OH 7,15. Quoi qu’il en soit, notre protocole établit la DHE comme une meilleure alternative aux colorants pour mesurer les différences quantitatives de la majorité de la production de ROS intracellulaires à l’aide d’un système d’imagerie et de criblage à haut contenu.

L’absence de moteurs intermédiaires de la génération de ROS (comme ceux observés dans DCFH-DA) est postulée comme un avantage majeur dans l’utilisation de la DHE pour évaluer la production intracellulaire de ROS. Cependant, ce mécanisme de fluorescence de la DHE n’est pas encore fermement établi. Dans les cas où une quantification précise des niveaux de ROS est nécessaire, il est conseillé d’utiliser des méthodes orthogonales supplémentaires de validation quantitative telles que la CLHP et/ou les méthodes de chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse (LC-MS) pour estimer avec précision les niveaux de 2-OH-E+ dans les cellules 8,9,13. Cependant, il faut savoir que les méthodes HPLC et LC-MS impliquent nécessairement l’agrégation et la solubilisation des cellules pour évaluation. Ainsi, l’information spatio-temporelle codée dans une méthode d’imagerie basée sur la fluorescence comme dans le protocole actuel serait perdue dans l’HPLC et la LC-MS et représente un avantage majeur des méthodes d’évaluation ROS basées sur l’imagerie. Un avantage supplémentaire de la fluorescence décalée vers le rouge de la DHE est que la lumière de plus grande longueur d’onde (en rouge) est moins toxique pour les cellules en raison de la plus faible énergie transportée par la lumière rouge.

La nature dose-dépendante de la fluorescence DHE pour mesurer les changements relatifs des ROS intracellulaires a été testée en utilisant la ménadione et le peroxyde d’hydrogène comme inducteurs de stress oxydatif. La ménadione et le peroxyde d’hydrogène ont été choisis comme substances d’essai en raison des mécanismes variables des ROS et de la génération de stress oxydatif20,21. Alors que la production de ROS due à l’exposition à la ménadione est indirecte (par dysfonctionnement mitochondrial), H2O2 produit un stress oxydatif de manière plus directe. L’augmentation des concentrations de ménadione a conduit à une production accrue de fluorescence de DHE de manière linéaire, reproductible et dose-dépendante. Semblable à la ménadione, H2O2 est un inducteur bien connu de ROS capable de générer des radicaux hydroxyles (OH) par la chimie de Fenton de manière directe22. Une réponse linéaire et dose-dépendante a également été observée dans la fluorescence de la DHE due à l’exposition au H2O2. En raison de la sélectivité de la DHE pour le radical superoxyde en particulier, elle ne réagit pas directement avec le H2O2. Au lieu de cela, les radicaux superoxydes intracellulaires produits réagissent initialement avec H2O2 pour former des espèces ROS secondaires, telles que les radicaux hydroxylés via les réactions de Haber-Weiss et Fenton, qui sont ensuite détectées par fluorescenceDHE 23. Le spectre d’émission de fluorescence de la DHE en réponse à deux substances oxydantes différentes en mesurant la majorité de la production intracellulaire de ROS est établi dans le protocole actuel 8,13. Ces résultats établissent l’utilité du colorant fluorescent DHE comme meilleure alternative pour la détection et la quantification des niveaux de ROS intracellulaires à l’aide d’approches de criblage à haut débit.

La sélectivité, la sensibilité et les propriétés optiques supérieures de la DHE en font une alternative précieuse pour étudier la production de ROS et les dommages oxydatifs à haut débit, comme établi dans le protocole actuel. Les études futures de notre laboratoire exploreront le rôle de la DHE en tant que marqueur ROS dans la réactivité croisée entre les ROS et les mécanismes de signalisation cellulaire dans diverses conditions physiologiques et pathologiques dans un environnement à haut débit.

Déclarations de divulgation

Les auteurs déclarent qu’ils n’ont pas d’intérêts concurrents.

Remerciements

RK et RRG ont été soutenus par une subvention du Centre des métaux en biologie et en médecine (CMBM) de l’UNM par le biais de la subvention P20 P20 GM130422 du NIH NIH. RRG a été soutenu par une subvention pilote de la subvention NM-INSPIRES P30 1P30ES032755. Le soutien de l’imagerie pour l’instrument CX7 Cellomics a été fourni par les cœurs du centre AIM financés par la subvention NIH P20GM121176. Nous tenons à remercier le Dr Sharina Desai et le Dr Li Chen pour leur aide précieuse concernant les problèmes techniques liés à l’utilisation de la plate-forme d’imagerie CX7 Cellomics.

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
Tubes à centrifuger de 1,5 ml  ;VWR  ;20170-038  ;
Plaque à 96 puits  ;Costar de Corning  ;07-200-90  ;
Cellomics Cx7ThermoFisher  ;
Collagène  ;Biomatrice avancée  ;   ;5056  ;
DHE (Dihydroethidium)  ;ThermoFisher  ;D1168  ;
DMEM  ;Sigma  ;   ;6046  ;
FBS  ;VWR  ;Référence 97068-085  ;
GraphPad PrismGraphPadVersion 6.0
Lignée cellulaire HepG2ATCC
Hoechst  ;ThermoFisher  ;33342  ;
Lignée cellulaire HUH7ATCC
Peroxyde d’hydrogène  ;Sigma  ;88597  ;
Lignée cellulaire JHH4ATCC
Menadione  ;Sigma  ;M5625  ;
HCSDCX7LEDPRO

Références

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Réimpressions et autorisations

Mots-clés

Fluorescence au dihydro thidiummesure des ROS intracellulairescellules de carcinome h patocellulaireimagerie de fluorescencecriblage toxicologiqued tection du superoxydeCellomics CX7criblage de m dicaments
Évaluation préalable à haut débit de la génération d’espèces réactives de l’oxygène (ROS) à l’aide d’un colorant de fluorescence à base de dihydroéthidium (DHE)
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