Article de méthode

La technologie 2D-HPLC-MS combinée à un réseau moléculaire pour l’identification de composants dans le pendule de l’aconit de la médecine tibétaine

DOI :

10.3791/66239

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8 décembre 2023

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1Ethnic Medicine Academic Heritage Innovation Research Center, Meishan Hospital, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 2State Key Laboratory of Southwestern Chinese Medicine Resources, Innovative Institute of Chinese Medicine and Pharmacy, Chengdu University of Traditional Chinese Medicine, 3Key Laboratory of Chemical Biology & Traditional Chinese Medicine Research, Ministry of Education, 4Key Laboratory of Phytochemical R&D of Hunan Province, Hunan Normal University

* These authors contributed equally

Dans cet article

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Cette étude utilise la technologie bidimensionnelle de chromatographie liquide à haute performance couplée à la spectrométrie de masse (2D-HPLC-MS) en conjonction avec un réseau moléculaire pour démêler la composition chimique complexe de la plante médicinale tibétaine Aconitum pendulum Busch (APB). L’article fournit un protocole détaillé pour l’exploration et l’identification systématiques de composants chimiques complexes des plantes médicinales.

Résumé

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Dans cette étude, une approche globale a été utilisée, utilisant la technologie 2D-HPLC-MS en conjonction avec le réseau moléculaire pour démêler la composition chimique complexe de la plante médicinale tibétaine APB. Grâce à la mise en œuvre de la 2D-HPLC, une séparation améliorée des mélanges complexes a été obtenue, permettant d’isoler des composés individuels pour une analyse ultérieure. L’approche du réseau moléculaire a également permis d’élucider les relations structurelles entre ces composés, contribuant ainsi à la détermination de molécules bioactives potentielles. Cette stratégie intégrée a permis d’identifier efficacement un large éventail de composants chimiques présents dans l’usine. Les résultats ont révélé un large éventail de constituants chimiques dans l’APB, y compris les alcaloïdes, entre autres. Cette recherche fait non seulement progresser la compréhension du profil phytochimique de cette médecine traditionnelle tibétaine, mais fournit également des informations précieuses sur ses propriétés thérapeutiques potentielles. L’intégration de la 2D-HPLC-MS et du réseau moléculaire s’avère être un outil puissant pour l’exploration et l’identification systématiques de compositions chimiques complexes dans les plantes médicinales, ouvrant la voie à de nouvelles recherches et développements dans le domaine de la découverte de produits naturels.

Introduction

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La médecine tibétaine fait partie intégrante de la médecine traditionnelle chinoise, adhérant aux principes des pratiques médicales tibétaines, et est utilisée pour la prévention et le traitement des maladies1. Cependant, la phytothérapie tibétaine contient des constituants chimiques végétaux complexes caractérisés par des fluctuations importantes de leur contenu. La compréhension limitée des éléments bioactifs fondamentaux est devenue un goulot d’étranglement dans la modernisation de la médecine tibétaine2. L’application de la chromatographie liquide-spectrométrie de masse (LC-MS), combinant le fort pouvoir de séparation de la chromatographie avec la haute sensibilité de la spectrométrie de masse (MS), a été largement utilisée dans l’analyse de la médecine naturelle3. Cependant, en raison de la limitation d’un seul mécanisme de séparation, les composants ayant des structures très similaires ont tendance à coéluer dans la séparation unidimensionnelle par chromatographie liquide. Dans l’analyse spectrométrique de masse ultérieure, les composants co-élutés de faible abondance sont difficiles à détecter en raison de la suppression des ions causée par les composants de haute abondance4.

La 2D-HPLC, qui signifie chromatographie liquide bidimensionnelle à haute performance, représente une nouvelle méthode chromatographique qui combine harmonieusement différents mécanismes de séparation à l’aide d’une paire de colonnes. Cela comprend la fusion ou l’alternance de la chromatographie en phase normale avec la chromatographie liquide en phase inverse et de la chromatographie liquide à interaction hydrophile avec la chromatographie liquide en phase inverse5. En fusionnant ces propriétés chromatographiques complémentaires, la capacité de séparation améliorée est obtenue, ce qui permet de relever efficacement les défis posés par les matrices d’échantillons complexes6. De plus, en couplant la chromatographie bidimensionnelle avec la MS, la puissante capacité de séparation de la 2D-HPLC et la capacité de détection à haute sensibilité de la MS peuvent être entièrement intégrées, fournissant un soutien pour l’étude de systèmes médicamenteux complexes et de leurs constituants fondamentaux 7,8,9.

La médecine tibétaine présente généralement un éventail multiforme de composants et de fonctionnalités, où les ingrédients actifs existent généralement dans des compositions complexes et à des concentrations minimales. En intégrant la 2D-LC en tant que système de séparation robuste et la MS en tant que détecteur extrêmement sensible, les défis posés par les échantillons complexes en termes de séparation et d’identification peuvent être relevés plus efficacement 10,11,12. Cette fusion contribue considérablement à faire avancer l’exploration de la composition chimique de la médecine tibétaine.

Qu’il s’agisse d’un LC-MS traditionnel ou d’un LC-MS 2D, il est possible d’obtenir une grande quantité d’informations. Cependant, l’extraction d’informations structurelles de composants de systèmes complexes à partir de cette énorme quantité d’informations a toujours été un défi important. Par conséquent, les chercheurs ont mis au point diverses méthodes de criblage et d’exploration des données MS. Global Natural Products Social Molecular Networking (GNPS) est une plate-forme d’organisation et de visualisation de données MS/MS où les données de spectrométrie de masse 2D-LC-MS peuvent être téléchargées13. Chaque spectre est considéré comme un vecteur et comparé à tous les autres spectres en utilisant la similarité cosinus. Lorsque la similitude entre deux spectres dépasse un seuil, ils sont connectés dans un réseau moléculaire (MN). Cela peut être utilisé pour l’identification rapide de composés connus et la détermination de divers produits naturels inconnus14.

La médecine tibétaine a généralement plusieurs fonctions, mais sa composition complexe et ses différences de concentration significatives rendent difficile l’élucidation efficace de la relation entre la fonction et la base matérielle15. Une étude approfondie de la médecine tibétaine nécessite la caractérisation systématique d’un maximum de composants. Dans le cadre de cette étude, nous avons l’intention d’utiliser l’APB en médecine tibétaine comme objet de recherche pour démontrer la stratégie et le processus d’étude systématique des composants chimiques complexes de la médecine tibétaine à l’aide de la technologie 2D-HPLC-MS et de la technologie MN. Dans la construction du système chromatographique 2D, nous avons combiné la chromatographie liquide en phase inverse et la chromatographie liquide à interaction hydrophile avec des mécanismes de séparation significatifs pour obtenir une séparation plus efficace des composants complexes de l’APB16. De plus, pour pallier l’incompatibilité des solvants entre les deux dimensions, un mode de modulation de dilution en colonne a été adopté. En combinant la puissante capacité de séparation de la 2D-LC avec la capacité de détection à haute sensibilité de la MS, les informations spectrales des composants complexes de l’APB sont obtenues de manière plus efficace et plus complète. De plus, grâce au réseau et à la visualisation d’informations spectrales massives par la technologie MN, les composants de l’APB sont systématiquement analysés. La stratégie et le processus démontrés dans cette étude devraient être appliqués à l’étude d’autres médecines tibétaines, en promouvant la recherche sur la base matérielle de la médecine tibétaine, qui est d’une grande importance pour l’avancement des ressources de la médecine tibétaine et l’amélioration des normes de contrôle de la qualité des herbes tibétaines17. L’ensemble du processus expérimental est illustré à la figure 1.

Dans l’expérience présentée ici, un nouveau modulateur de dilution en colonne a été introduit dans le système de chromatographie liquide bidimensionnelle Agilent (2D-LC)18. L’ajout d’une pompe de refoulement indépendante a permis de modifier le chemin d’écoulement de l’analyse, ce qui a entraîné une orthogonalité élevée de l’analyse 2D-LC. L’accouplement et la commutation entre les deux dimensions sont réalisés par deux vannes à six orifices, comme le montre la figure 2. Lorsqu’une boucle d’échantillonnage est remplie dans la première dimension, une autre boucle d’échantillonnage est analysée dans la deuxième dimension. Cela signifie que le temps de remplissage de la boucle 1D et le temps de déroulement de la boucle 2D sont égaux. Cela nécessite le gradient rapide généré par la pompe binaire dans la deuxième dimension. Aucun pic n’est perdu lors de l’analyse de l’ensemble de l’effluent. Ceci est particulièrement utile pour l’analyse d’échantillons inconnus. Il en résulte un grand nombre de chromatogrammes 2D qui doivent être combinés pour l’analyse des données.

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Protocole

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1. Préparation

  1. Préparation des échantillons
    1. À l’aide d’une balance de sensibilité de 1/10 000, peser 0,25 g (poids sec) d’APB dans un tube de microcentrifugation de 3 mL, ajouter 2,5 mL de méthanol, puis sonicate pendant 30 min (puissance 240 W, fréquence 40 kHz).
    2. Effectuer une centrifugation à 1,2 x g pendant 5 min, recueillir le surnageant et filtrer à travers un filtre à membrane avec une taille de pores de 0,22 μm.
  2. Préparation du matériel expérimental
    1. Préparez la phase mobile bidimensionnelle, utilisez de l’acétonitrile comme phase B organique et configurez de l’eau ultrapure à 0,1 % d’acide formique comme phase A aqueuse.
    2. Effectuer une filtration diphasique (0,22 μm) et un sonicate à l’aide d’un appareil à ultrasons (40 kHz) pendant 15 min. Purgez la phase mobile remplacée pour éliminer les bulles. Dans cette expérience, la colonne C18 a été utilisée comme colonne 1D, la colonne hydrophile comme colonne 2D, et la colonne a été montée sur l’instrument.
  3. Réglage du rapport de dérivation approprié
    1. Connectez la ligne de sortie de l’instrument 2D-LC à travers un té à l’entrée de masse et l’autre extrémité du té à une ligne shuntée. Ajustez le débit à une valeur appropriée pour vous assurer que le débit dans le spectre massique est de 0,3 à 0,5 mL/min.
      REMARQUE : Étant donné que la deuxième dimension du 2D-LC est généralement réglée au-dessus de 2 mL/min, ce débit est trop important pour MS, il est donc nécessaire d’effectuer une division.

2. Fonctionnement 2D-LC

  1. Double-cliquez sur l’icône Instrument 1 Online pour que le poste de travail chimique communique automatiquement avec le 1260 LC et entre dans le poste de travail.
  2. Pour le réglage des paramètres de méthode 2D-LC, sélectionnez l’écran Méthode et exécution du contrôle dans le menu Affichage pour appeler l’interface souhaitée, qui sera normalement saisie par défaut. Cliquez sur le module d’injecteur, cliquez avec le bouton droit de la souris sur Méthode, définissez le volume d’injection, le débit et le gradient de temps de phase mobile de la pompe 1D.
  3. Entrez l’exemple de temps d’exécution sous Temps d’arrêt. Cliquez sur le menu principal Instrument et cliquez sur Méthode 2D-LC dans le menu déroulant. Sélectionnez Complet en mode 2D-LC. Entrez 2 min au temps de modulation , 1,9 min au temps d’arrêt du dégradé 2D . Réglez les paramètres de débit sur 2 ml. Modifiez le dégradé 2D et définissez-le sur les longueurs d’onde. Après avoir modifié la méthode, sélectionnez Enregistrer la méthode sous dans le menu Méthode pour nommer la nouvelle méthode, puis cliquez sur OK.
    REMARQUE : La pompe de transfert externe nécessite un réglage manuel du débit.

3. Fonctionnement MS

  1. Allumez l’interrupteur de la pompe à vide. Ouvrez le robinet principal de la bouteille d’argon et le robinet diviseur de pression et ajustez la pression à environ 0,3 MPa. Ouvrez la vanne d’azote.
  2. Attendre au moins 8 h pour s’assurer que le vide est adéquat dans les conditions expérimentales. Vérifiez que la pression atmosphérique de l’argon et de l’azote est suffisamment élevée avant l’analyse.
  3. Pour lancer le logiciel de contrôle MS, cliquez sur la source SEI de chauffage dans le panneau du logiciel et entrez les paramètres MS, y compris la température du chauffage (350 °C), le débit de la gaine (35 arb), le débit d’air auxiliaire (15 arb), la tension de pulvérisation (3,8 KV en mode positif, -2,5 KV en mode négatif) et la température capillaire (275 °C). Cliquez sur le bouton Appliquer pour activer la source d’ions.
  4. Pour configurer la méthode MS, entrez des valeurs pour configurer le temps d’acquisition, la polarité, la plage de masse, le numéro de valeur de transfert, la durée de la valeur de transfert, etc. Temps d’exécution MS (min) : 93,00. Détails de la configuration de ScanEvent : ITMS + norme c o (100.0-1200.0), CV=0.0v. Norme ITMS + c Dep MS/MS, ion le plus intense de (1) : Type d’activation : CID, Min. Signal requis : 500, Largeur d’isolement : 2.00, Org. normalisée Energie : 35.0, État de charge par défaut :3, Activation Q : 0.250, Temps d’activation : 93.000. Pour définir des paramètres dépendants des données, utilisez des paramètres de polarité distincts comme désactivés, Perte neutre en haut : 3, Produit en haut : 3. Cliquez sur Enregistrer pour configurer les paramètres en tant que méthode d’instrument.
    REMARQUE : La fin de l’exécution est conforme à celle du 2D-LC.
  5. Cliquez sur le bouton Configuration de la séquence pour ouvrir la table de séquence. Entrez le type d’échantillon, le nom de fichier, le chemin d’accès, l’ID de l’échantillon, la méthode de l’instrument, l’emplacement, la quantité d’injection et d’autres informations dans le formulaire.
  6. Cliquez sur le bouton Enregistrer pour enregistrer le listage des séquences, puis cliquez sur le bouton Démarrer l’analyse pour configurer et démarrer l’acquisition MS. Cliquez sur Run Control sur l’instrument 2D-LC et sélectionnez Run Method. Dans le même temps, l’instrument MS clique également sur le bouton Exécuter .
    REMARQUE : Étant donné que le 2D-LC et le MS ne sont pas contrôlés par le même logiciel dans cette expérience, ils doivent être configurés séparément sur les deux instruments.

4. Fonctionnement du réseau moléculaire

  1. Préparation des données : Exportez des données spectrales de masse brutes 2D-HPLC-MS et convertissez les données spectrales de masse secondaires en données mzXML ou mzML via Msconvert de ProteoWizard. (http://proteowizard.sourceforge.net/).
  2. Pour télécharger des données, téléchargez le logiciel WinSCP sur le site officiel et téléchargez les données mzML sur le compte créé par GNPS via le protocole FTP. Une fois l’installation terminée, lancez WinSCP.
  3. Se connecter au serveur FTP GNPS : Dans l’interface WinSCP, sur la page de configuration de la session , renseignez les informations de connexion suivantes : Protocole de fichier : Sélectionnez FTP. Pour le nom d’hôte : Entrez massive.ucsd.edu., pour le numéro de port : Conservez le 22 par défaut.
  4. Entrez le numéro de compte et le mot de passe. Après avoir rempli les informations ci-dessus, cliquez sur le bouton Connexion pour établir une connexion au serveur FTP GNPS.
  5. Créez des réseaux moléculaires en ouvrant un navigateur Web et en visitant le site Web du GNPS (https://gnps.ucsd.edu/). Les nouveaux utilisateurs doivent créer un compte, puis se connecter.
  6. Sur l’interface principale du site Web GNPS, cliquez sur l’onglet Tâches dans la barre de navigation supérieure et sélectionnez Créer une nouvelle tâche dans le menu déroulant. Sur la page de création de tâche, cliquez sur le bouton Ajouter des fichiers, puis sélectionnez et téléchargez le fichier de données. (par exemple, format mzML).
  7. Dans l’onglet Paramètres de tâche, définissez les différents paramètres qui génèrent le MN. Ces paramètres incluent l’algorithme d’extraction de pic, la valeur de dépassement de pic, la méthode de calcul de similarité, etc. Effectuez les réglages de paramètres appropriés si nécessaire. Cliquez sur le bouton Lancer l’analyse en bas de la page pour exécuter la tâche.
  8. Une fois la tâche exécutée, recherchez la tâche créée dans la liste des tâches et cliquez sur le nom du service pour afficher les résultats de l’analyse. Le site Web fournit des diagrammes MN, des substituts, des réseaux symbiotiques et d’autres informations connexes.

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Résultats

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L’APB a été utilisé comme organisme modèle pour valider la faisabilité de la technologie 2D-HPLC-MS en conjonction avec la méthode MN. En important les données brutes MS dans le MN avec les paramètres définis par défaut, un MN a été généré. MN est une stratégie de calcul visuel qui visualise tous les ions moléculaires détectés dans une expérience LC-MS-MS complète et les relations chimiques entre ces ions moléculaires13.

MN est basé sur les fragments de spectre de masse...

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Discussion

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L’objectif principal de cette expérience était l’optimisation d’une méthode partielle dans le cadre de la séparation bidimensionnelle en phase liquide. Pour y parvenir, un nouveau modulateur de dilution en colonne a été intégré de manière transparente dans le système de chromatographie liquide bidimensionnelle (2D-LC). Cet ajustement technique était d’une importance primordiale car il a considérablement amélioré la compétence dans le profilage des constituants chimiques présents dans la médecine tibétaine connue sous le ...

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Déclarations de divulgation

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Les auteurs ne déclarent aucun intérêt financier concurrent.

Remerciements

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Ce travail a été financé par la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82130113), la Fondation nationale des sciences naturelles de Chine (82204765), la Fondation des sciences de la nature du Sichuan (2022NSFSC1470), le projet de financement spécial postdoctoral de la province du Sichuan (TB2023020) et le programme de promotion de la recherche Xinglin Scholars de l’Université de médecine traditionnelle chinoise de Chengdu (BSH2021030). Ces fonds apportent un soutien en termes d’équipements expérimentaux, de matériaux expérimentaux et de frais de publication.

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Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article
NomEntrepriseNuméro de catalogueCommentaires
AcétonitrileFisher chimiqueF22M81203Phase mobile
Aconitum pendulum//Phytothérapie
Agilent 1290 Infinity (II) 2D-LC  ;Agilent TechnologiesG2198-90001Chromatographie
liquide Seringues jetablesChengdu Keen équipement expérimental/Tube EP de 1 ml
Équipement expérimental de Chengdu Keen/
Flacon d’injection en phase liquidede 3 ml Équipement expérimental de Chengdu Keen/Spectromètre
de masse LTQ XLThermo FisherLTQ21991Spectromètre de masse
Membranes microporeuses  ;Équipement expérimental Chengdu Keen/0.22&mu ; m
Ultimate XB-C18,5 &mu ; m,2.1 x 200 mmWelch00201-31015colonne en phase inversée
GT SonicUGT20DEC048YNettoyeur à ultrasons 240W 40KHz
XAmide,3 &mu ; m,100ADalian Mondi TechnologieD2019110601Colonne hydrophile
de 1,5 ml Nettoyeur à ultrasons à

Références

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Mots-clés

Identification des alcalo desisolement de compos sspectrom trie de masseanalyse phytochimiqued couverte de produits naturelscomposition chimique

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